Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

El objetivo general de este procedimiento es medir la función de una población de canales CFTR en un sistema reconstruido y examinar la respuesta de los canales frente a la presencia de moléculas moduladoras. Esto se logra primero purificando la proteína CFTR de tipo silvestre o mutante a partir de células SF nine mediante un procedimiento rápido de purificación, que produce proteína CFTR funcional en solución detergente. El segundo paso consiste en reconstituir la proteína purificada en liposomas proteicos con un lípido definido, seleccionado por el investigador.

A continuación, se genera un gradiente químico de yoduro a través de la membrana mediante la eliminación del yoduro liposomal extra, creando así una fuerza impulsora para el movimiento iónico a través del canal CFTR. El paso final consiste en activar el canal e iniciar la liberación de yoduro desde los liposomas proteicos en presencia de la molécula moduladora de interés. Finalmente, se utiliza un electrodo selectivo de yoduro para monitorear la función del canal CFTR en tiempo real en este sistema reconstruido.

Este método permite el estudio de la actividad del canal de cloruro de una población purificada de moléculas de CFTR después de su reconstitución en liposomas de fosfolípidos. Aunque se decidió utilizar este método para obtener información sobre la función del canal C-F-D-R-N nueve y el efecto de moduladores de moléculas pequeñas, también puede aplicarse a otros sistemas, como la caracterización funcional de otras proteínas de membrana. Para tener éxito, las personas nuevas en este método deben asegurarse de haber optimizado las relaciones de proteína a lípido para su sistema, de no estar trabajando con proteínas con funcionalidad deficiente o no funcional, y de haber generado un gradiente suficiente de yoduro a través de vesículas bien selladas.

Para preparar el lípido, primero seque cinco miligramos de fosfatidilcolina de huevo o PC de huevo en un tubo de vidrio no borosilicatado bajo una corriente de gas argón durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, calcule el volumen del tampón seis según se indica en el protocolo del texto, y luego agregue directamente el tampón seis al lípido. Selle el tubo de vidrio con perfil y vortexee el tubo durante dos minutos a temperatura ambiente para suspender el lípido en el tampón.

A continuación, suspenda el lípido a temperatura ambiente utilizando una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro hasta que no se observe ninguna película de lípido en la pared del tubo. El tampón quedará turbio debido al lípido suspendido. Somete el lípido en el tubo a una ráfaga de 22 segundos en un baño ultrasónico que contenga hielo, y luego coloque el tubo sobre hielo durante un minuto.

Realice este ciclo tres veces. A continuación, agregue la proteína CFTR al lípido, obteniendo un volumen final de un mililitro. Mezcle la proteína con una suspensión de lípidos 10 veces utilizando una aguja de calibre 25.

Coloque la muestra en hielo durante 30 minutos, agitando el tubo cinco veces cada cinco minutos para mezclar mientras incuba la muestra. Rompa la pestaña inferior de una columna de centrifugación de un solo uso para unión de detergente y centrifugue la columna durante dos minutos a 2000 × g. Para eliminar el tampón de almacenamiento, lave la columna con cinco mililitros de tampón siete y centrifugue la columna durante cuatro minutos a 2000 × g para eluir el tampón de lavado.

Lave la columna tres veces, transfiera la totalidad de la muestra de proteína lipídica de un mililitro a la parte superior de la resina de la columna y luego incube la columna durante dos minutos a temperatura ambiente. Centrifugue la columna a temperatura ambiente durante cuatro minutos a 2000 ×g. A continuación, transfiera la muestra turbia de proteoliposomas a un tubo microfusible limpio y coloque el tubo en hielo. Sumeja cinco gramos de perlas de Sephadex G-50 en 50 mililitros de tampón nueve durante al menos dos horas a temperatura ambiente.

Luego, cargue cuatro columnas pequeñas de tamizado con las perlas saturadas hasta que estén llenas al menos tres cuartas partes. Centrifugue las columnas durante cuatro minutos a 2000 veces G para eliminar el tampón en exceso de la resina. Aproximadamente 2,25 mililitros de resina empaquetada deben quedar en la columna después de la centrifugación.

Es fundamental que la resina esté adecuadamente hidratada para la elución con las proteoliposomas. A continuación, transfiera 125 microlitros de la muestra de proteoliposomas a la parte superior de cada columna y centrifugue durante cuatro minutos a 2000 veces. Reúna los EIT para su uso en los experimentos de FLX con yoduro.

Coloque un pequeño agitador magnético de fieltro F en un pocillo de una placa de 96 pocillos, y luego añada 150 microlitros de VX siete 70 a una concentración de 20 micromolar en tampón nueve al pocillo. Utilice una punta de pipeta para eliminar cualquier burbuja. A continuación, añada 150 microlitros de la muestra de proteoliposomas al pocillo, obteniendo un volumen total de 300 microlitros.

Coloque la placa de 96 pocillos sobre una placa agitadora a 130 revoluciones por minuto. Introduzca la punta del electrodo sensible al yoduro en la solución sin tocar la barra de agitación ni el fondo del pocillo. Para registrar los trazos de la señal del electrodo, filtre la señal mediante un filtro pasa-bajos con una frecuencia de muestreo de dos hercios y registre los trazos de la muestra durante cinco minutos para permitir que la muestra alcance el equilibrio.

Debe producir una línea base estable y casi plana. Luego, agregue tres microlitros de una solución stock de 100 milimolares de cloruro de magnesio A TP a pH siete. Para activar los canales CFTR, permita que la muestra se equilibre durante otros cinco minutos para alcanzar una nueva línea base.

A continuación, agregue tres microlitros de una solución stock de dos micromolar. Valinomicina para eliminar el gradiente electroquímico generado por la actividad de CFTR. Registre la disminución del voltaje debida a la actividad de FLX mediada por yoduro de CFTR durante al menos cinco minutos.

Luego agregue tres microlitros de una solución al 10% de Triton X-100 a la muestra para liberar el yoduro del lumen del proteoliposoma como control. Una liberación significativa de yoduro indica que el yoduro atrapado en las vesículas no era limitante para la actividad de CFTR. Después de medir la muestra, prepare una serie de diluciones de yoduro de potasio desde concentraciones micromolares hasta nanomolares en el tampón nueve.

Comenzando con la solución más diluida, registre la respuesta del electrodo en milivoltios a cada concentración de yoduro para generar una curva estándar. Se ensayó el CFTR de tipo silvestre para yoduro. La actividad de flujo de F se midió en anómoles por segundo tras la reconstitución.

El flujo de F yoduro se estimula significativamente en presencia de CFTR y ATP en comparación con el control que carece de CFTR, y mediante la adición de ATP. Cuando CFTR es fosforilado por la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico, una subunidad catalítica conocida como PKA, por el contrario, el pretratamiento con el potente inhibidor CFTRinh-172 reduce la velocidad del flujo de yoduro. Se evaluó la capacidad de VX-770 para potenciar el flujo de yoduro de CFTR de tipo silvestre en ausencia y en presencia de fosforilación por PKA; VX-770 aumentó el flujo relativo de yoduro únicamente en presencia de CFTR fosforilado. La eficacia de VX-770 se analizó utilizando una variante de CFTR denominada deltaF508-CFTR, y el análogo inactivo V091188 no potencia la actividad de deltaF508-CFTR fosforilado, mientras que VX-770 aumenta el flujo relativo de yoduro. Una vez dominada, esta técnica puede completarse desde la purificación hasta las mediciones de actividad de CFTR en un día laboral típico de ocho horas; la purificación de CFTR toma aproximadamente cuatro horas y la reconstitución requiere otra hora antes de iniciar el ensayo eFlex.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluido un ensayo de T PS y la medición por canal individual en el para lípido S, utilizando la misma preparación de la proteína CFDR para caracterizar más a fondo la interacción con las moléculas pequeñas. Mediante estos métodos, un investigador de fibrosis quística podrá abordar preguntas clave en el campo de los moduladores de CFTR, específicamente, si dicho modulador interactúa directamente con la proteína CFTR y cuál es el mecanismo de acción de ese modulador.