Name: Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprende a reconstituir proteína CFTR purificada en proteoliposomas para medir la función del canal y los efectos de moléculas moduladoras. Este método permite estudiar la actividad de CFTR en tiempo real.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
<li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li>
<li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li>
<li>Genetic Analysis Consortium. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html">http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html</a> (1989).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li>
<li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li>
<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
<li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li>
<li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li>
<li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR%2C+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li>
<li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li>
<li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li>
<li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamjeesingh%2C+M+%22Reliable+Lab+Solutions%3A+Essential+Ion+Channel+MethodsReliable+Lab+Solutions%22">Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions</a>. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).</li>
<li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li>
<li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+%28PKA%29+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li>
<li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Second+Messenger+Phosphoprotein+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li>
<li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li>
<li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li>
</ol>

Los autores agradecen el asesoramiento del Dr. Mohabir Ramjeesingh durante el desarrollo de los métodos de purificación descritos aquí. Estos estudios fueron apoyados por subvenciones de funcionamiento a la Junta de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y fibrosis quística Canadá (CFC). PDWE fue financiada en parte por los premios de becas a través de la CIHR y CFC. Los autores reconocen la prestación de corrector, potenciador y compuestos inhibidores de Dr. R. Bridges (Rosalind Universidad de Medicina y Ciencia) y la distribución de los Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Los autores también reconocen servicio excepcional por el Fondo para el cultivo celular Baylor (NIH subvención P30 CA125123) en la expresión de WT y proteína CFTR mutante utilizando el sistema de baculovirus. El inactivo analógico VX-770, V-09-1188, fue un regalo de Vertex Pharmaceuticals.

Ha habido un número limitado de protocolos de purificación para de longitud completa, el aislamiento CFTR funcional, a partir de una variedad de sistemas de sobreexpresión celulares. El método descrito aquí es ventajosa, ya que permite la purificación rápida de WT-CFTR o alto enriquecimiento de F508del- y G551D-CFTR en cantidades moderadas que es altamente funcional en ensayos que incluyen ATPasa y mediciones directas de la función del canal, incluyendo mediciones de canal individuales en bicapa planar sistemas y medida...

El transporte de cloruro a través de las membranas apicales de las células epiteliales en tejidos tales como las glándulas de pulmón, intestino, páncreas y sudoríparas está mediada principalmente por la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR), un miembro de ATP y la fosforilación regulada de la ABC (ATP Binding Cassette) C subfamilia de proteínas de membrana (revisado en 1). Como otros miembros de la subfamilia ABCC, CFTR es un multi-que abarca proteína de membrana grande, integral que se une ATP en dos sitios de unión de nucleótidos formados en la interfaz de sus dominios de unión a nucleótidos (NBDs), donde posee actividad ATPasa modesta en un solo sitio. Sin embargo, a diferencia de otros miembros de la subfamilia ABCC, CFTR se ha desarrollado como un canal Cl regulado única y no como un transportador de soluto activa. Las mutaciones en CFTR causa fibrosis quística, una enfermedad que afecta a múltiples órganos, como los pulmones, el tracto gastrointestinal, páncreas y tracto reproductivo, lo que lleva a la morbidity y mortalidad en adultos jóvenes. Enfermedad pulmonar normalmente representa la mortalidad temprana en la fibrosis quística y en la mayoría de los casos es causada por la pérdida de la función de CFTR en el epitelio de la superficie de las vías respiratorias conductoras. La falta de actividad del canal de cloruro CFTR causa una reducción en tanto Cl - y el movimiento del agua a través del epitelio superficial para modificar la capa de fluido en la superficie apical del epitelio respiratorio ciliado. Esto resulta en un líquido viscoso que la superficie de las vías respiratorias deteriora la capacidad de las células epiteliales ciliadas respiratorias a eficazmente patógenos claros fuera de las vías respiratorias. Como consecuencia, la mayoría de los pacientes con FQ sufren de episodios recurrentes de infección pulmonar y daño pulmonar debido a la inflamación. Como era de esperar, los estudios del mecanismo de acción de la proteína CFTR normal centran principalmente en estudios electrofisiológicos detallados de su actividad gating canal. Estudios de canal individuales han demostrado directamente que las funciones de CFTR como un dependiente de PKA Cl- Canal que posee una puerta regulado ATP 2. Estudios electrofisiológicos detallados proporcionan una gran cantidad de información sobre los canales individuales CFTR 1,3, sin embargo puede haber preocupación en cuanto a si las características de cualquiera de un solo canal particular que ha sido estudiado es el reflejo de toda la población de los canales de CFTR y por lo tanto el canal único Los resultados se deben considerar siempre junto con los métodos para el estudio de la población macroscópica. Ensayo directo de la actividad de los canales población de CFTR purificada tiene el potencial de proporcionar información sobre el defecto molecular asociado con mutaciones que causan enfermedades y para impulsar el descubrimiento de moduladores químicos que la reparación proteínas CFTR mutante. Hasta la fecha, hay más de 1.900 mutaciones diferentes en CFTR se cree causan fibrosis quística 4. La mutación principal, F508del-CFTR, que se encuentra en al menos un alelo en aproximadamente el 90% de los pacientes en América del Norte y Europa conduce a un mal plegamiento de proteínasnd retención en el retículo endoplásmico 5. F508del-CFTR también tiene otras consecuencias, incluyendo la actividad del canal defectuoso 6-9. La ausencia resultante de CFTR de la superficie celular se asocia con la enfermedad severa. G551D-CFTR, una mutación menos común, se cree que aún no se ha plegado correctamente es disfuncional como un canal de cloruro en la superficie celular 6. El desarrollo de pequeñas correctores molécula y potenciadores tiene el objetivo de corregir el plegado y / o el tráfico de mutantes tales como F508del-CFTR a la superficie celular, y de potenciación o el aumento de la actividad de los canales de mutaciones tales como G551D cuando está presente en la superficie celular, respectivamente . Mientras que los correctores VX-809 y VX-661 (todavía no están aprobados para su uso en pacientes, el potenciador Kalydeco (ivacaftor; VX-770) está siendo utilizado en 150 mg cada 12 h en pacientes con FQ&gt; 6 años con al menos un G551D mutación -CFTR, y más recientemente en los pacientes con una de G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Py G1349D. Kalydeco es seguro y los resultados en la mejora de las medidas clínicas de la enfermedad CF 10, sin embargo, el mecanismo de acción de esta pequeña molécula fue mal entendido en el momento de aprobación de la FDA para su uso en pacientes. Un puñado de métodos de purificación CFTR se han descrito anteriormente 2,11-18, muchas de las cuales requieren un período considerable de tiempo para completar. En una publicación reciente 19, un método de purificación y reconstitución rápida única fue descrito por CFTR sobreexpresa en el sistema de expresión de células 9 S f, y esta proteína purificada en sistemas lipídicos definidos se utilizó para desarrollar un haluro de CFTR ensayo de actividad de canal para una población de CFTR moléculas. El ensayo recapitula los efectos conocidos de la fosforilación, nucleótidos y los inhibidores sobre la función de CFTR. Se utilizó el sistema para interrogar a los efectos de la potenciador VX-770 / Kalydeco en peso (de tipo salvaje), F508del- y G551D-CFTR y se demostró por primerael tiempo que el fármaco interactúa directamente con la proteína CFTR para potenciar su actividad de los canales de una manera independiente de ATP, lo que demuestra la utilidad y aplicabilidad de estos métodos para el estudio de la interacción de CFTR y mutantes con nucleótidos y moléculas pequeñas desde una perspectiva de la población a responder a las preguntas clínicamente relevantes sobre la proteína. Los métodos también se han utilizado para estudiar otras moléculas potenciadoras y sus derivados 20, así como los efectos de una pequeña molécula corrector sobre la actividad de la proteína 21. Ensayos de eflujo se han utilizado en muchos estudios previamente para investigar la actividad de mutantes CFTR y los efectos de los compuestos CFTR-moduladores en su actividad, incluyendo los ensayos de células enteras utilizando electrodos, trazadores radiactivos y fluoróforos 22,23, vesículas de membrana con electrodos selectivos de iones 24 y se purificaron CFTR reconstituido con trazadores radiactivos 25. Sin embargo the uso de electrodos selectivos de iones para estudiar CFTR reconstituido purificado se informó por primera vez recientemente 19. Una adaptación del método actual se ha utilizado para la reconstitución y la caracterización funcional de dos proteínas de membrana en Pseudomonas aeruginosa, un patógeno CF común. Reconstitución de purificado proteína de membrana externa AlgE junto con mediciones de flujo de salida de yoduro se utilizaron para apoyar un modelo para la secreción de alginato aniónico a través de este transportador 26. Reconstitución y mediciones de yoduro de eflujo se aplicaron a la proteína purificada Wzx, lo que permitió un modelo que se propone que sugiere un mecanismo de antiport dependiente de H + para lípidos ligado oligosacárido translocación a través de la membrana interna bacteriana por esta proteína 27. En ambos casos yoduro fue utilizado como un sustituto para el sustrato aniónico, aunque a un menor rendimiento que uno podría esperar para un sustrato nativo. El método puede ser adecuado para la adaptación a otras proteínas con cvías de transporte o de conducción ationic para sustratos aniónicos. Aquí un procedimiento de purificación rápida se describe para la proteína CFTR y su reconstitución en proteoliposomas de lípidos definida. El procedimiento de reconstitución rápida se puede adaptar fácilmente para su uso con CFTR purificada por otros métodos, siempre que el tipo de detergente usado en la purificación es susceptible a la eliminación por los métodos utilizados aquí o puede ser intercambiado por un detergente adecuado antes de que el procedimiento de reconstitución. El método de yoduro de eflujo para la medición de la actividad del canal de la proteína CFTR purificada y reconstituida se describe en detalle y se presentan algunos resultados típicos que se pueden obtener a partir de este método.

<table><tbody><tr><td>fos-colina 14 detergente</td><td>Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix: Productos Anatrace; CAS#&nbsp; :77733-28-9</td></tr><tr><td>cOmplete Comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa sin EDTA</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>Comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa sin EDTA (1 en 50 ml o mini: 1 en 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack&nbsp;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Columnas de cribado Fisher</td><td>Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtros centrífugos, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Proteína quinasa A dependiente de AMPc (PKA), subunidad</td> <td>catalíticaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td><td>Peirce PKA también es adecuado</td></tr><tr><td>PC, Huevo de gallina</td><td>Avanti Lípidos polares (www.avantilipids.com)</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Lípidos polares (www.avantilipids.com)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS, Cerebro porcino</td><td>Avanti Lípidos polares (www.avantilipids.com)</td><td>840032C</td><td>CFTR se ha reconstituido con éxito en Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, o una mezcla de PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)</td></tr><tr><td>PE, Huevo de gallina</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Columna giratoria de eliminación de detergente</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>Columnas de 1 ml de capacidad</td></tr><tr><td>valinomicina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Microelectrodo</td> selectivo de yoduro <td>Selleck Chemicals S1144</td><td></td></tr><tr>Laboratorios<td>de</td><td>Investigación Lazar (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Software Clampex 8.1</td><td>Axon Instruments (www.axon.com)</td><td></td><td>utilizamos componentes del sistema ClampX con un filtro casero para monitorear y registrar la respuesta a nuestro electrodo</td></tr><tr><td>Software alternativo: Sistema ArrowLabb&nbsp;</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>Lazar Research vende un medidor que puede interactuar con una computadora y software para registrar la respuesta de la sonda. Este software debería cumplir una función similar a nuestra configuración.</td></tr><tr><td>barras agitadoras pequeñas</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>elija una barra agitadora lo suficientemente pequeña como para caber fácilmente en un pocillo de una placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Sephadex G50, GE</td><td>Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>Los sonicadores de baño de otros fabricantes también deberían ser adecuados</td></tr></tbody></table>

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Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

La fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) es un miembro de formación de canal único de la casete de unión a ATP (ABC) superfamilia de transportadores. La actividad de los canales de la fosforilación y cloruro dependiente de nucleótidos de CFTR se ha estudiado con frecuencia en los sistemas de células enteras y como canales individuales en fragmentos de membrana rotos. Muchas mutaciones de fibrosis quística causantes se han mostrado alteraciones en esta actividad. Si bien un pequeño número de protocolos de purificación se han publicado, un método de reconstitución rápida que retiene la actividad del canal y un método adecuado para el estudio de la actividad del canal población en un sistema purificado han faltado. Aquí métodos rápidos se describen para la purificación y reconstitución funcional de la proteína CFTR de longitud completa en proteoliposomas de composición de lípidos definida que retiene la actividad como un canal de haluro regulado. Este método de reconstitución junto con un nuevo ensayo basado en flujo de la actividad del canal es un sistema adecuado parael estudio de las propiedades del canal población de tipo salvaje CFTR y los mutantes que causan enfermedades F508del- y G551D-CFTR. Específicamente, el método tiene utilidad en el estudio de los efectos directos de la fosforilación, nucleótidos y moléculas pequeñas tales como potenciadores e inhibidores sobre la actividad del canal CFTR. Los métodos también son susceptibles al estudio de otros canales / transportadores de membrana para sustratos aniónicos.

Se describe en esta publicación escrita son métodos para purificar, reconstituir y medir la actividad del canal regulado de la proteína CFTR. Figura 1a muestra el flujo de trabajo para la purificación, la reconstitución y procedimientos de flujo de salida de yoduro. Métodos para la reconstitución y la actividad del canal mediciones de flujo de yoduro también se muestran en más detalle en el vídeo asociado. La purificación y reconstitución de CFTR en proteoliposomas <p cl...

Descrito aquí es un procedimiento rápido y eficaz para la reconstitución funcional de tipo silvestre purificado y proteína CFTR mutante que conserva la actividad de este canal de cloro, que es defectuoso en la fibrosis quística. Flujo de salida de yoduro de proteoliposomas reconstituidas mediadas por CFTR permite estudios de actividad de los canales y los efectos de las moléculas pequeñas.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la función de una población de canales CFTR en un sistema reconstruido y examinar la respuesta de los canales frente a la presencia de moléculas moduladoras. Esto se logra primero purificando la proteína CFTR de tipo silvestre o mutante a partir de células SF nine mediante un procedimiento rápido de purificación, que produce proteína CFTR funcional en solución detergente. El segundo paso consiste en reconstituir la proteína purificada en liposomas proteicos con un lípido definido, seleccionado por el investigador.A continuación, se genera un gradiente químico de yoduro a través de la membrana mediante la eliminación del yoduro liposomal extra, creando así una fuerza impulsora para el movimiento iónico a través del canal CFTR. El paso final consiste en activar el canal e iniciar la liberación de yoduro desde los liposomas proteicos en presencia de la molécula moduladora de interés. Finalmente, se utiliza un electrodo selectivo de yoduro para monitorear la función del canal CFTR en tiempo real en este sistema reconstruido.Este método permite el estudio de la actividad del canal de cloruro de una población purificada de moléculas de C

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Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

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Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloro del epitelio, se ha informado de interactuar con varias proteínas y regular procesos celulares importantes, entre ellos los CFTR PDZ mediadas por motivo de las interacciones han sido bien documentados. Este protocolo describe los métodos que hemos desarrollado para montar un macromolecular CFTR PDZ-dependiente de señalización...

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Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

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La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Este artículo describe métodos específicos para obtener cantidades bioquímicas de detergente solubilizado TRPV1 para análisis espectroscópico. Los protocolos combinados proporcionan herramientas bioquímicas y biofísicas que se pueden adaptar para facilitar los estudios estructurales y funcionales de canales del ion mamíferos en un ambiente controlado por membrana.

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Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

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La electrofisiología es el estándar de oro para investigar la actividad de los canales iónicos. Sin embargo, hay muchos enfoques alternativos, incluidos los métodos ópticos. Aquí, describimos un método para monitorear la actividad de la repetición rica en leucina que contiene canales aniónicos formados por 8 canales (LRRC8) utilizando un método basado en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitorización de la actividad de repeticiones ricas en leucina que contiene 8 canales (LRRC8/VRAC) mediante transferencia de energía de resonancia de Förster de emisión sensibilizada (SE-FRET)

Aprende a reconstituir proteína CFTR purificada en proteoliposomas para medir la función del canal y los efectos de moléculas moduladoras. Este método permite estudiar la actividad de CFTR en tiempo real.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

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