Misa cuantitativa espectrometría de perfiles de los proteomas de células del cáncer derivados de líquidos y tumores sólidos

El objetivo general de este procedimiento es dilucidar los perfiles de expresión de proteínas de tumores líquidos y sólidos. Esto se logra enriqueciendo primero las células cancerosas a partir de muestras de sangre o tejido derivadas del paciente. En el segundo paso, las proteínas se aíslan de las células cancerosas y luego se mezclan con un estándar de cuantificación susac específico para el tumor.

En el paso final, se digiere la mezcla de proteínas. En última instancia, la espectrometría de masas se utiliza para mostrar los perfiles de expresión de proteínas de tumores líquidos y sólidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología y la patología, como por ejemplo, ¿cómo se pueden identificar las dianas de los fármacos y los mecanismos de resistencia a la terapia?

Aunque este método puede proporcionar información sobre el descubrimiento de biomarcadores, también se puede aplicar a otros sistemas, como la investigación de cánceres diversos, sólidos y líquidos. Para demostrar el procedimiento, el Dr. Hannibal Berger del Instituto de Patología y el Dr. Christophe Lanz de mi laboratorio Para preparar células tumorales líquidas para la clasificación fluorescente por citometría de flujo, comience citando Ali un mililitro de la muestra de células mononucleares humanas suspendida en PBS más 2% de FBS para el control negativo, y un mililitro para cada tinte fluorescente utilizado en la tinción final. A continuación, incubar las células con los anticuerpos adecuados para el aislamiento de la población de células leucémicas y para los controles de compensación en hielo.

Después de 30 minutos, lave las celdas dos veces con PBS más 2% FCS. A continuación, añada una tinción de viabilidad celular a los tubos apropiados y clasifique las células según el esquema. Recogida de las muestras en IMDM más 10%FCS para la recogida de tumores sólidos mediante microdisección por captura láser.

Primero, use un micrótomo para cortar secciones de cinco a 10 micrómetros de espesor a partir de muestras incrustadas en parafina fija en formina. A continuación, monte las secciones en portaobjetos de membrana cubiertos con película y seque las muestras a 37 grados centígrados después de una hora. Separar y rehidratar las secciones mediante incubaciones sucesivas de un minuto en etanol absoluto de xileno, etanol al 70% y agua.

A continuación, tiñe las secciones con hematina durante 20 segundos. Enjuáguelas con agua del grifo y recoja las células de interés con el sistema de microdisección de captura láser para extraer proteínas de las células tumorales líquidas clasificadas. Centrifugar la muestra tres veces, lavando las células en 500 microlitros de PBS frío durante las dos segundas centrifugaciones.

A continuación, incube las células en 40 microlitros de tampón de lisis por una vez 10 a las seis células. Después de 15 minutos, centrifugue el lisado y transfiera el lisado transparente que contiene sobrenadante a un nuevo tubo de reacción para extraer la proteína de las células tumorales sólidas microdisecadas. Incubar la muestra de tejido con 60 microlitros de tampón de lisis tisular a 72 grados centígrados.

Después de 15 minutos, recoja el líquido mediante una breve centrifugación y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción. A continuación, sonicar el lisado en hielo durante tres minutos, seguido de una incubación con 15 microlitros que tienen un 20% de sulfato de sodio ESAL a 99 grados centígrados en un bloque calefactor con 600 RPM de agitación. Después de una hora, centrifugar el lisado y transferir la S natin a un nuevo tubo.

A continuación, determine las concentraciones de proteínas del estándar celular aclarado y súper SLAC, y luego mezcle cantidades iguales de las piezas de células tumorales con el estándar súper SLAC, seguido de litio. Aplicar tampón de sulfato desalinizador al 25% del volumen de la muestra y agente reductor al 10% del volumen de la muestra. A continuación, caliente la solución resultante en un bloque calefactor durante 10 minutos a 72 grados centígrados.

Para medir la concentración de proteínas del lisado de tumores sólidos en un lector de placas, mezcle una serie estándar de soluciones de dilución de albúmina en suero bovino, el lisado y el estándar superSLAC adecuado con un ensayo de proteínas disponible en el mercado y una placa de 96 pocillos. Después de un minuto de agitación, incube la muestra durante el período de tiempo adecuado y mida la absorbancia según lo indicado por el fabricante. A continuación, mezcle cantidades iguales de lisado clarificado y el patrón super SLAC con 200 microlitros de urea en una unidad de filtro y centrifuga las muestras durante 30 minutos.

Analizar los lisados de células tumorales por cromatografía líquida y análisis por espectrometría de masas. Comience resolviendo los péptidos de interés en 30 microlitros de tampón de carga durante cinco minutos en un baño de sonicación. A continuación, centrifuga la proteína y transfiere el sobrenadante transparente a un vial de muestreo automático de espectrometría de masas.

A continuación, inyecte cinco microlitros de muestra por análisis en el nano lc, ms MS system autos, el muestreador y concentre y desale los péptidos en línea en una configuración de columna ventilada y montada previamente en fase C 18 invertida. Por último, separe los péptidos en una microcolumna de fase C 18 reversa en una columna de pulverización nanos a su propio ritmo. Usando un gradiente de 90 minutos de cinco a 35% de nitrilo de acetilo frente a un 0,1% de ácido fórmico acuoso a 300 nanolitros por minuto, luego use una fuente de iones de nano aerosol para transferir y analizar los péptidos.

Utilizando un método de adquisición dependiente de los 15 datos principales, se pueden utilizar diferentes tipos de espectrómetros de masas para analizar los péptidos. El perfil proteómico de tumores líquidos y sólidos de pacientes es un enfoque prometedor para el descubrimiento de nuevos biomarcadores diagnósticos y predictivos. Por ejemplo, esta primera figura muestra una estrategia de compuerta ejemplar para aislar las tinciones de CD one 17, células leucémicas de una muestra de tumor líquido.

Mientras que aquí, una sección de cinco a 10 micrómetros de espesor montada sobre portaobjetos de membrana cubiertos con película, como se acaba de demostrar. Como se muestra, se seleccionó manualmente una región de interés y se extirpó mediante microdisección por captura láser, el análisis de conglomerados no supervisado de los perfiles de expresión de proteínas de muestras tumorales líquidas y sólidas se puede realizar mediante espectrometría de masas, lo que permite la separación clara de las diferentes entidades tumorales de acuerdo con sus distintos perfiles de expresión de proteínas. Estos datos pueden contribuir, en última instancia, al establecimiento de biomarcadores clínicamente relevantes.

La implementación de estrategias de enriquecimiento para modificaciones postraduccionales, como la fosforilación o la ventilación UIC, también se puede realizar para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo se pueden identificar los patrones de quinasas desregulados después de su desarrollo? Esta técnica abre el camino para que los investigadores en el campo de la patología y la oncología exploren los biomarcadores específicos y las vías de señalización en una variedad de entidades cancerosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar proteínas de cánceres como subpoblaciones para analizar sus patrones de expresión de proteínas y estados de señalización mediante espectrometría de masas.