Name: Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a comparar la expresión de proteínas recombinantes humanas en plataformas de fermentación tradicionales y sistemas de plantas. Este método evalúa rendimiento, calidad y parámetros operativos para optimizar la producción.

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Este trabajo fue apoyado por la acción COST 'Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins' FA0804. Los autores agradecen al Dr. Anatoli Giritch y al Prof. Yuri Gleba por proporcionar los vectores MagnICON con fines de investigación.

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
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<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
<li>Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+engineering+of+viral+RNA+replicons%3A+efficient+assembly+by+recombination+of+DNA+modules+delivered+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).</li>
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<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
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<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Falorni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+detects+the+frequent+occurrence+of+autoantibodies+to+the+Mr+65%2C000+isoform+of+glutamic+acid+decarboxylase+in+Japanese+insulin-dependent+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes.</a> Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

En este estudio tres plataformas diferentes se compararon para la expresión de una proteína humana recombinante: células bacterianas, células de baculovirus / insectos y plantas. La plataforma basada en plantas fue explorada aún más por la explotación de tres tecnologías de expresión ampliamente utilizado (es decir, transitoria - MagnICON y pK7WG2 base - y estables). La proteína diana escogido para este experimento, hGAD65mut, se ha expresado anteriormente en diferentes sistemas de 13, y su producció...

Las proteínas recombinantes se producen comercialmente en masa en sistemas de expresión heterólogos con la ayuda de herramientas biotecnológicas emergentes. Los factores clave que deben tenerse en cuenta a la hora de elegir el sistema de expresión heterólogo son: la calidad de la proteína, la funcionalidad, la velocidad del proceso, el rendimiento y el coste.
En el campo de las proteínas recombinantes, el mercado de productos farmacéuticos se está expandiendo rápidamente y, en consecuencia, la mayoría de los productos biofarmacéuticos producidos hoy en día son recombinantes. Las proteínas pueden expresarse en cultivos celulares de bacterias, levaduras, mohos, mamíferos, plantas e insectos, así como en sistemas vegetales (ya sea por transformación estable o transitoria) y animales transgénicos; Cada sistema de expresión tiene sus ventajas y limitaciones inherentes y, para cada proteína recombinante diana, el sistema de producción óptimo debe evaluarse cuidadosamente.
Las plataformas basadas en plantas están surgiendo como una alternativa importante a los sistemas tradicionales basados en fermentadores para la producción segura y rentable de proteínas recombinantes. Aunque los costos de procesamiento posteriores son comparables a los de las células microbianas y de mamíferos, la menor inversión inicial requerida para la producción comercial de plantas y la economía de escala potencial, proporcionada por el cultivo en grandes áreas, son ventajas clave.
Evaluamos plantas como biorreactores para la expresión de la isoforma de 65 kDa de la descarboxilasa del ácido glutámico humano (hGAD65), uno de los principales autoantígenos en la diabetes autoinmune tipo 1 (DT1). El hGAD65 se ha adoptado en gran medida como marcador, tanto para clasificar como para controlar la progresión de la enfermedad, y su papel en la prevención de la diabetes tipo 1 se está investigando actualmente en ensayos clínicos. Si estos ensayos tienen éxito, la demanda mundial de hGAD65 recombinante aumentará drásticamente.
Aquí, nos centramos en la expresión de la contraparte enzimáticamente inactiva de hGAD65, hGAD65mut, un mutante generado por la sustitución del residuo de lisina que une el cofactor PLP (piridoxal-5'-fosfato) con un residuo de arginina (K396R)1. 
hGAD65mut conserva su inmunogenicidad y, en células de plantas e insectos, acumula hasta diez veces más que hGAD65, su contraparte de tipo salvaje. Se planteó la hipótesis de que la actividad enzimática de hGAD65 interfiere con el metabolismo de las células vegetales hasta tal punto que suprime su propia síntesis, mientras que hGAD65mut, la forma enzimáticamente inactiva, puede acumularse en las células vegetales a niveles más altos.
Para la expresión de hGAD65mut, se exploró el uso de diferentes tecnologías, ampliamente utilizadas en biotecnología vegetal, y se comparó con las plataformas de expresión tradicionales (Escherichia coli y Baculovirus/células de insectos).
En este trabajo, se revisaron y compararon las plataformas recombinantes desarrolladas para la expresión de hGAD65mut que comprenden sistemas tradicionales y basados en plantas sobre la base de la velocidad y el rendimiento del proceso, y de la calidad y funcionalidad del producto final.

<table><tbody><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>para medio</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacteriológico</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM medio</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Medio para insectos, sin suplementar</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>MS medio que incluye vitaminas</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Agar vegetal</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td>Sulfato de</td></tr><tr><td>gentamicina</td> tóxico <td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Ganciclovir</td><td>Invitrogen</td><td>tóxico I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina disódica</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td> tóxico <td>Sigma</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td> tóxica <td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Tóxico y ndash; Stock de 25 mg/ml en DMSO</td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td>Toxico</td></tr><tr><td>Cimlorhidrato de espectinomicina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-&beta;-D-1-tiogalattopiranoside)</td><td>Sigma</td><td>I5502</td><td>Hidrato</td></tr> de <tr><td>MES</td> tóxico <td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioquímico</td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>Acetosjeringa</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Tóxico &ndash; 0,1 M de stock en Jeringa DMSO</td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP (6-Benzilaminopurina)</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>NAA (Ácido naftaleno acético)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxima</td><td>irritante Mylan Generics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Ajuste el pH con 1 N HCl para hacer tampón Tris-HCl</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fenilmetanosulfonilofluoruro)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Urea corrosiva, tóxica</td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>Tóxico &ndash; 1 M de stock, almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de la proteasa vegetal</td><td>tóxico Sigma</td><td>P9599</td><td>No congelar/descongelar demasiadas veces</td></tr><tr><td>SDS (Sulfato de dodecilo de sodio)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Inflamable, tóxico, corrosivo &ndash; 10% de stock</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Azul Brillante R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td> inflamable <td>Sigma</td><td>27221</td><td>Ácido</td></tr><tr><td>antiglutámico corrosivo descarboxilasa 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td>No congelar/descongelar demasiadas veces</td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante (HRP)-anticuerpo anti-conejo conjugado</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>No congelar/descongelar demasiadas veces</td></tr><tr><td>Sf9 Cells Life</td><td> Tecnologías</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A Sepharose</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Radioinmuno kit de ensayo</td><td>Techno Genetics</td><td>12650805</td><td>Material radiactivo</td></tr></tbody></table>

un análisis comparativo de expresión recombinante de proteínas en diferentes biofactorías: las bacterias, células de insecto y plant systems

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Sistemas a base de plantas se consideran una plataforma valiosa para la producción de proteínas recombinantes, como resultado de su potencial bien documentado para la producción flexible, de bajo costo de alta calidad, los productos bioactivos. En este estudio, se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en las culturas tradicionales a base de fermentador de células bacterianas y (insectos) con los sistemas de expresión basados ​​en plantas, tanto transitorios y estables. Para cada plataforma, se describe la puesta a punto, la optimización y la duración del proceso de producción, la calidad del producto final y los rendimientos y se evaluaron los costes de producción provisionales, específicos para la proteína recombinante diana seleccionado. En general, nuestros resultados indican que las bacterias no son adecuados para la producción de la proteína diana debido a su acumulación dentro de cuerpos de inclusión insolubles. Por otro lado, los sistemas basados ​​en plantas son plataformas versátiles tsombrero permite la producción de la proteína seleccionada a-menores costos que el sistema celular baculovirus / insecto. En particular, las líneas transgénicas estables muestran el más alto rendimiento del producto final y las plantas que expresan transitorios el desarrollo más rápido proceso. Sin embargo, no todas las proteínas recombinantes se pueden beneficiar de los sistemas basados ​​en plantas, pero la mejor plataforma de producción deben determinar empíricamente con un enfoque caso por caso, como se describe aquí.

Un diseño experimental para la expresión heteróloga de una proteína recombinante diana en diferentes sistemas de producción se describe aquí. El primer foco fue la puesta en marcha de las diferentes plataformas mediante el establecimiento de las condiciones óptimas para la expresión de la proteína diana en cada sistema. La expresión de la proteína diana, hGAD65mut, se indujo por triplicado E. culturas coli. Después de 3 h de expresión a 37 ° C, las células bacterianas se re...

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

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