Validación de nanocuerpo y basados ​​en anticuerpos En Vivo Experimentos tumor de xenoinjerto NIRF-de formación de imágenes en ratones utilizando Ex Vivo Citometría de flujo y microscopía

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la validación ex vivo de experimentos de imágenes de xenoinjertos de fluorescencia de infrarrojo cercano in vivo en ratones utilizando nanocuerpos marcados con fluoróforos y anticuerpos convencionales.

El objetivo general de este procedimiento es realizar la validación ex vivo de experimentos de imágenes de xenoinjertos de fluorescencia de infrarrojo cercano in vivo en ratones utilizando nanocuerpos marcados con cuatro fluorados o anticuerpos convencionales. Esto se logra administrando primero fluoro en el infrarrojo cercano, cuatro anticuerpos específicos de antígeno marcados y anticuerpos convencionales a ratones portadores de xenoinjertos de antígeno positivo y negativo. El segundo paso es realizar imágenes in vivo.

Después de la obtención de imágenes, los ratones se sacrifican para eliminar los xenoinjertos, que se procesan para análisis ex vivo. En última instancia, la citometría de flujo ex vivo y la microscopía de fluorescencia se utilizan para validar los resultados de imágenes in vivo. La ventaja de este método sobre los métodos existentes, como las imágenes nucleares, es que el uso de un tinte fluorescente de infrarrojo cercano permite una comparación completa de imágenes multimodales in vitro, in vivo y ex vivo con una sola sonda para citometría de flujo, microscopía de fluorescencia e imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las imágenes tumorales, como la localización de metástasis durante la cirugía y el seguimiento de la eficacia de las terapias antitumorales. El marcaje de anticuerpos con fuerza fluorada permite la cuantificación exacta ex vivo de los anticuerpos unidos a las células. Esto nos permite distinguir si los singles específicos que vemos in vivo se deben a anticuerpos, unidos a antígenos de superficie celular, o inespecíficos debido al llamado efecto de permeabilidad y retención mejorados.

De siete a nueve días después de la inyección de las células tumorales, cuando los tumores deben tener alrededor de ocho milímetros de diámetro. Preparado para obtener imágenes de los ratones primero, aplicar ungüento oftálmico e inicializar el sistema de imágenes. A continuación, coloque a los ratones anestesiados en la platina calentada con sus tumores dirigidos a la cámara.

Mantenga de uno a 2% de flúor ISO durante todo el procedimiento de diagnóstico por imágenes utilizando el colector de flúor isof alojado en la cámara de diagnóstico por imágenes. Controla la frecuencia respiratoria. Si alguno es demasiado rápido, entonces la anestesia es demasiado ligera, y si es lenta o irregular, entonces la anestesia es demasiado profunda.

A continuación, tome imágenes de los ratones después de obtener la imagen de referencia. Inyecte a los ratones 50 microgramos de LOR seis construcciones de anticuerpos marcados con 80. Haga esto en un volumen de 200 microlitros de solución salina en la vena de la cola.

Después de la imagen, eutanasia al ratón y móntelo en un bloque de espuma de poliestireno y límpielo con etanol al 70%. Luego, corte la piel para exponer los tumores. Extirpar los tumores con un bisturí y mantenerlos intactos.

Una vez extirpados, corte los tumores por la mitad y transfiera una mitad a un plato de solución de P-B-S-A-E-B-S-F en ICE para su análisis por fax y transfiera la otra mitad a dos veces fría, 4% de PFA para inmunohistoquímica. Después de 24 horas en fijador a cuatro grados centígrados, transfiera los tumores a PBS con sacarosa al 30% y manténgalos a cuatro grados centígrados hasta que se hundan completamente en la solución. Luego, corte los tumores en pedazos que quepan en moldes criogénicos.

Llene los moldes con compuesto OCT y transfiera los trozos de tumor a los moldes. El tejido debe estar completamente sumergido en OCT. Luego, transfiera los moldes criogénicos a hielo seco y cuando estén completamente congelados, guárdelos a menos 80 grados centígrados hasta que puedan procesarse.

Para preparar las células, transfiera la mitad del tumor a una célula, colando en el colador. Córtelo en tres o cuatro pedazos y luego saque el émbolo de una jeringa de dos mililitros y use el émbolo para triturar el pañuelo contra el colador. Recoja la solución que fluye a través del colador Después de que los pañuelos se hayan triturado, enjuague el colador con PBS.

A continuación, transfiera la suspensión recogida a un tubo nuevo y gírela a 500 g durante cinco minutos. Suspendemos el pellet de celda en 10 mililitros de PBS con 0,2%BSA. A continuación, cuente las células de una a 5 millones de células de linfoma en un tubo de fax de cinco mililitros, y gire el tubo a 500 g y deseche el sobrenadante.

A continuación, suspenda las células en 100 microlitros de PBS con 0,2%BSA. En este punto, es posible bloquear la FCR utilizando un anticuerpo para unirse a FC gamma R. Espere 10 minutos y lave las células una vez con PBS con 0,2% de BSA. Ahora agregue un anticuerpo monoclonal anti CD 45 para identificar los leucocitos.

Incube las células durante 20 minutos en la oscuridad con este anticuerpo, y luego use dos lavados para eliminarlo justo antes del análisis por fax. Tiñe las células con yoduro de propidio durante 15 minutos en hielo para identificar las células muertas. A continuación, lávelos con PBS puro.

A continuación, Resus suspende las células en 150 microlitros de PBS y procede con los hechos. A los ratones se les inyectaron 50 microgramos de nanocuerpo y anticuerpo monoclonal para evaluar la especificidad de las construcciones marcadas con fluorescencia. Para la obtención de imágenes in vivo.

Todas las imágenes se realizaron seis horas después del flujo de inyección. El análisis citométrico de las suspensiones de células tumorales mostró un marcaje específico de las células tumorales positivas para antígenos con ambos conjugados AF 6 80. No hubo marcaje inespecífico de las células con antígeno negativo con ninguno de los constructos.

El tumor. Las secciones criogénicas mostraron un marcaje fuerte y casi homogéneo de las células positivas para antígenos con el nanocuerpo. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal dio un antígeno mucho más débil en la tinción homogénea como se esperaba.

Los tumores negativos no mostraron tinción del antígeno del anticuerpo, mientras que los tumores negativos mostraron tinción dispersa inespecífica en el espacio intersticial después de la inyección del anticuerpo convencional. Esto fue muy similar a la escena de tinción en el antígeno. Tumores positivos tras inyección del anticuerpo convencional Una vez dominados.

La parte de imagen de esta tecnología se puede realizar en un solo día siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el marcado por radio de nanocuerpos, para investigar la biodistribución de los conjugados inyectados en diferentes tejidos u otras cuestiones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la validación multimodal ex vivo de su experiencia de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano in vivo con una sonda marcada con fluoro cuatro.

Por lo tanto, le proporciona una técnica para la evaluación de nuevas construcciones de anticuerpos para imágenes moleculares preclínicas.