Name: La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un In Vitro Prion Análisis de Conversión de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprende a evaluar barreras de especie en encefalopatías espongiformes transmisibles mediante un ensayo in vitro de conversión de proteína priónica. Este método evita el uso de animales vivos y proporciona resultados confiables.

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Agradecemos a John Olsen (Departamento de Recursos Naturales de Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien y Steve Schmitt (Departamento de Recursos Naturales de Michigan) y al Dr. Daniel Walsh (Centro Nacional de Salud de la Vida Silvestre del USGS) por su ayuda con la adquisición de tejidos. También agradecemos al Laboratorio Estatal de Higiene de Wisconsin por los servicios de pruebas diagnósticas, y a la Dra. Tonie Rocke y su personal (Centro Nacional de Salud de Vida Silvestre del USGS) por el uso del equipo. Cualquier uso de nombres comerciales, de productos o de empresas es solo para fines descriptivos y no implica la aprobación por parte del Gobierno de los EE. UU.

Trabajo Animal realizado en el Centro Nacional de Salud de la fauna de USGS fue realizado de acuerdo con la Oficina de NIH de directrices Laboratorio Animal Welfare y bajo cuidado de los animales institucional y el empleo protocolo # EP080716. Los tejidos de animales cazadores-cosechada fueron regalos de la Wisconsin o Michigan Departamentos de Recursos Naturales. 1. Preparación de la solución NOTA: Las soluciones que se indican a continuación son necesarios para la preparación del sustrato de ensayo CER en la Sección 2 a continuación. Preparar cada una de estas soluciones de soluciones de concentración de valores más altos; concentraciones recomendadas para las soluciones madre se dan entre paréntesis después de cada nombre químico respectivo incluido. Preparar todas las soluciones frescas sobre la preparación del sustrato y se almacena a 4 ° C hasta su uso. <ol><li> Para tampón de lisis, preparar una solución de la siguiente en 10 mM Tris, pH 7,5 (Tris 1 M, pH 7,5 solución valores recomendados): 100 mM scloruro de odio (NaCl, 1 M de solución madre), ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (EDTA, EDTA 500 mM, pH 8,0 solución stock), 0,5% NP-40 (solución madre 10%), 0,5% de desoxicolato (DOC, solución madre 10% ). </li><li> Para tampón de conversión, preparar una solución de sulfato de 0,05% de dodecil de sodio (SDS, 10% de solución de stock) y 0,5% de Triton X-100 (solución al 10% de stock) en 1 salina tamponada con fosfato (PBS, 10, pH 7,4 solución madre). </li><li> Para soluciones caotrópicas, preparar dos 3 M soluciones de clorhidrato de guanidina (GdnHCl, 8 M de valores) en 1x PBS (solución 10x). Ajustar el pH de una de las soluciones a 3,5 ± 0,05 con ácido clorhídrico concentrado (HCl). Comprobar que el pH de la segunda solución se mantiene a un pH de 7,4 ± 0,05 y ajustar usando HCl concentrado o hidróxido de sodio (NaOH) si es necesario. </li></ol> 2. Prepare pares CER ensayo de sustrato <ol><li> Obtener el tejido cerebral sano, no-TSE-infectado de especies de interés y preparar un volumen de peso-por-10%(W / v) de homogeneizado en tampón de lisis utilizando cualquiera de los siguientes métodos: Dounce, molino de bolas, o de homogeneización mortero y mano de mortero. Además refinar resultante homogeneizados sometiéndolos a homogeneización jeringa y aguja, el uso de agujas de calibre creciente hasta que el substrato puede ser aspirado y expulsado con facilidad a través de una aguja de la jeringa 27 G. <ol><li> Para sustratos preparados a partir de roedores y otros pequeños mamíferos, homogeneizar todo el cerebro (s); para sustratos preparados a partir de los mamíferos más grandes, use OBEX (tronco cerebral) para preparar los homogeneizados de tejido. Al seleccionar la cantidad de homogeneizado de cerebro, prepare no más de 50% de la capacidad de la centrífuga utilizada para la precipitación de proteínas en el paso 2.6. </li><li> Si la calidad del tejido cerebral adquirido es cuestionable, evaluar los niveles de PrP C por SDS-PAGE e inmunoblot 16 17 antes de sustrato preparación. </li></ol></li><li> Divida homogeneizado de cerebro en dos volúmenes iguales en tubos cónicos de plástico etiquetadas separadas. Añadir GdnHCl (3 M soluciones en 1 PBS) a pH 3,5 o bien 7,4 a cada tubo en una proporción de 1: 1 volumen de homogeneizado de cerebro. </li><li> Compruebe los valores de pH de las dos soluciones. Ajustar el pH de la pH 3,5 sustrato a pH ± 0,05 usando HCl concentrado. Asegúrese de que el pH de la otra sustrato se mantiene a un pH de 7,4 ± 0,05 y ajustar el pH si es necesario con HCl o NaOH según sea necesario. Evitar sobrepasar valores de pH mediante la adición juiciosa de ácido o base. </li><li> Girar soluciones en un mezclador extremo sobre extremo a temperatura ambiente (RT) durante 5 h. </li><li> Precipitado de proteína mediante la adición de cuatro volúmenes de metanol a las soluciones de sustrato en cada tubo cónico, vórtice para mezclar bien, y se incuba a -20 ° C durante 16-18 h. </li><li> Las muestras de sedimentos por centrifugación a 13000 × g durante 30 min a 4 ° C. Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante y dejar que el metanol se evapore de los pellets. Utilice bastoncillos de algodón para ayudar en la absorción de metanol aferrado a la parte interior del tubo. No permita bolitas a la sobre-dry, y una vez metanol ya no es visible, continúe con el siguiente paso. </li><li> Bolitas de proteína Resuspender en tampón de conversión. Utilizar una cantidad de tampón de conversión igual a la cantidad de material de partida homogeneizado de cerebro dispensado en cada tubo en el paso 2.2. NOTA: Es fundamental que el búfer de conversión utilizado para volver a suspender gránulos de proteína tanto de pH 3,5 y los preparativos de sustrato 7,4 tratados con la solución está definida en el paso 1.2 anterior (que contiene bajos niveles de detergentes y un pH fisiológico). </li><li> Soluciones brevemente con ultrasonidos sustrato en un aparato de ultrasonidos cuphorn (10 seg en ~ 30% de la potencia máxima), alícuota en 0,5 a 1,0 ml volúmenes de 1,5 ml tubos de microcentrífuga etiquetados. Realizar una inmunotransferencia de control de calidad (paso 2.9) en una parte alícuota de cada sustrato. Guarde otras alícuotas a -80 ° C hasta el momento de realizar el ensayo CER (Sección 4). </li><li> Realizar el control de calidad en los pares de sustrato CER antes de su uso (Figura 2). Estos pasos aseguran que los sustratos CER provide óptimos resultados en los estudios de conversión. <ol><li> Asegurar cantidades comparables de PrP C en los dos sustratos. Comparar los niveles de PrP en el 10-25 l de cada sustrato por SDS-PAGE e inmunotransferencia 16 17. Si los niveles de proteína en el pH 7,4 y 3,5 son sustratos dentro de ~ 10% uno del otro, los pares de sustrato son apropiados para su uso en estudios de CER. NOTA: Los inmunoblots PrP no deben mostrar evidencia de una extensa degradación PrP C. La inmunorreactividad de PrP debe ser principalmente&gt; 20 kDa. Bandas de menos de esta masa molecular pueden ser productos de degradación. Patrones de bandas deben ser más o menos equivalente entre pares de sustrato. </li><li> A medida que la PrP C en ambos sustratos debe ser sensible PK, tratar 10-25 l de cada sustrato con PK a una concentración final de 100 mg / ml y digerir las muestras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 hora en el termo-agitador. Evaluar cualquier señal PrP restante por SDS-PAGE 16 y 17 de inmunotransferencia.Sustratos con PrP res no son apropiados para su uso en estudios de CER. </li></ol></li></ol> 3. Preparar Agente TSE Semillas <ol><li> Obtener el tejido cerebral infectado por el TSE a partir de especies de interés y preparar un 10% (w / v) de homogeneizado en 1X PBS pH 7,4 usando los métodos enumerados en el paso 2.1. NOTA: Las semillas también podrían producirse a partir de otros tejidos infectados por el TSE fuera del sistema nervioso central, sin embargo, la eficiencia de la conversión de sustratos derivado del cerebro por semillas derivadas de tejidos periféricos infectadas por el TSE aún no se ha evaluado experimentalmente en la literatura publicada. </li><li> Alícuota resultante homogeneizado (s) en 100 a 300 volúmenes mu l en 0,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C hasta el momento de realizar el ensayo CER. </li></ol> Ensayo 4. CER NOTA: El ensayo CER implica la adición de una cantidad relativamente pequeña de PrP TSE (siempre en la &quot;semilla&quot;) de una especieen un exceso relativo de PrP C (proporcionado en el cerebro no infectada &quot;sustrato&quot;) de otra especie que ha sido parcialmente desnaturalizadas, ya sea en pH 3,5 o 7,4. Tras un período de incubación prolongada agitación, la conversión basado en plantillas de PrP C en PrP TSE en cada reacción se evalúa la señal densitométrico de PrP res que queda después de la digestión PK y detección inmunoblot. La comparación de los niveles de PrP res en los sustratos previamente desnaturalizado a pH 3,5 vs. 7,4 proporciona una medida de la barrera de especies. Una visión general experimental de este procedimiento de ensayo se proporciona en la Figura 1. <ol><li> Lentamente se descongele pares de sustrato CER no infectadas (ensayo requiere volúmenes iguales de sustratos previamente desnaturalizado a ambos pH 3.5 y 7.4) y soluciones de semillas TSE-infectados por su inclusión en la parte superior de un lecho de hielo (aproximadamente 1 hr tiempo de descongelación). </li><li> Una vez descongelado completamente, aspirado y luego expulsar a cada solución de sustrato a través de una27 G aguja de la jeringa varias veces para volver a homogeneizar. Tratar brevemente con ultrasonidos cada solución semilla infectada con TSE durante 10 segundos a ~ 30% de la potencia máxima. Mantenga todas las soluciones en hielo mientras se prepara reacciones de conversión. </li><li> Label 5 tubos individuales bajos vinculantes, de paredes finas de PCR por agente de la EET están probando. </li><li> Preparar reacciones de conversión en estos tubos mediante la adición de 5 l de solución de semilla infectada TSE-10% a 95 l de (a) sustrato CER preparados a pH 7,4 y (b) CER sustrato preparado a pH 3,5. <ol><li> Para cada muestra experimental, preparar reacciones paralelas en pares sustrato CER previamente desnaturalizado tanto a pH 3,5 y 7,4. </li><li> Optimizar proporciones de semillas agente de la EET sustrato cerebral no infectada a través de la determinación empírica. Semilla común: relaciones de sustrato empleado mantener un volumen total de reacción de 100 l y l incluyen 1:99, 2:98 y 5:95 l l. Para la mayoría de aplicaciones, la semilla 5:95 l: relación de volumen de sustrato es apropiado y es lo que se presenta en ºes el protocolo. </li></ol></li><li> Preparar tres muestras de control por agente EET se ensayaron como sigue: (a) añadir 5 l de solución de semilla infectada TSE-10% a tampón de conversión de 95 l como control para la entrada de PrP res; añadir tampón de conversión de 5 l a 95 l de sustrato preparado en (b) pH 3,5 y (c) pH 7,4 como controles para la conversión no específica, no moldeado. </li><li> En resumen vórtice cada muestra en su tubo de PCR cerrado para mezclar semillas y sustrato bien. Siga con un pulso momentáneo en una baja velocidad de banco mini-centrífuga para eliminar cualquier volumen de la mezcla de reacción atrapado en el tubo de la tapa PCR. </li><li> Cargar las muestras en tubos de PCR individualmente etiquetados en un banco superior termo-agitador equipado para aceptar tubos de PCR. Agitar las muestras a 1.000 rpm a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Después de agitación, añadir sarcosilo a una concentración final de 2% (w / v) y PK a una concentración final de 100 mg / ml. Muestras Digest en 1000 rpm a 37 ° C durante 1 hora en el termo-agitador. NOTA: La adición de sarcosilo a muestras ayudas post-conversión en PK digestión de PrP C. Señales de falsos positivos en muestras no cabezas de serie (Paso 4.5) son virtualmente eliminados por adición de sarcosilo. </li><li> Añadir tampón de muestra de SDS-PAGE, las muestras de calor a 95 ° C durante 5 minutos y resolver restantes PrP res en cada muestra por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia 16 17. NOTA: Después de la adición de tampón de muestra y calefacción, muestras podrá inmediatamente procesada o muestras se pueden almacenar a -20 ° C o -80 ° C antes de la inmunotransferencia. Todos los datos aquí presentados fueron generados usando los sistemas de gel y transferencia Novex NuPAGE. Las muestras individuales del ensayo de CER se trataron con tampón de muestra y el agente reductor de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras se calentaron a continuación a 95 ° C durante 5 min y 30 l de cada muestra se cargó en un 12% de bis-tris geles prefabricados. </li><li> Calcular el ratio de eficiencia de conversión (CER) como una medidade barrera de las especies. Medir los niveles de PrP res por densitometría 17 y dividen la densidad total de la muestra de pH 7,4 por la del pH 3.5 muestra. Multiplicar por 100 para producir un porcentaje. </li><li> Recopilar datos de réplicas experimentales independientes para generar una media CER ± desviación estándar para una especie con un agente de la EET dado. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Para completar con éxito de este protocolo, se debe prestar atención a los niveles de PrP C en el tejido cerebral infectado utilizado para la preparación del sustrato (paso 2.1.2) y la semilla al sustrato ratio para reacciones de conversión (paso 4.4.2). En nuestra experiencia, los cerebros pueden ser extraídos para su uso como sustrato CER luego de un período sustancial post-mortem, siempre que la PrP C está presente por inmunotransferencia (Figura 4). De hecho, algunos autolisis ...

Encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades de priones) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales con periodos de incubación prolongados que afectan a una variedad de animales y seres humanos. El agente etiológico putativo de las EET se compone de un isómero mal plegada de la proteína priónica host (PrP) que es capaz de auto-propagación por conversión basado en plantillas de la forma celular normal de PrP (PrP C) en una, asociada a la enfermedad infecciosa forma (PrP TSE) que se acumula en los tejidos del sistema nervioso central del huésped infectado 1. Priones mamíferos infecciosas en general transmiten desde el host-a-host de una manera específica de la especie, lo que ha dado lugar al concepto de la &quot;barrera de las especies TSE&quot; limitar los eventos de transmisión entre especies 2. Los determinantes biológicos de la barrera de especies prión no se comprenden bien. Secuencia de aminoácidos similitud entre la infecciosa PrP TSE y el anfitrión PrP C cUna influencia fuertemente si la conversión tiene lugar 3-5, pero sigue siendo insuficiente para explicar todos los eventos de transmisión de priones observados in vivo 6,7. Por lo tanto, la caracterización de las barreras de especies de EET se ha basado en gran medida en estudios de desafío de los animales: la exposición de los animales no tratados previamente de una especie dada a los priones de otro y midiendo el tiempo de incubación resultante de la aparición de la enfermedad y la tasa de ataque como indicadores de la eficacia de la transmisión. Los ratones que expresan PrP C a partir de especies heterólogas también se utilizan para este tipo de estudio 8. Los costos asociados a la producción de ratones transgénicos y bioensayos priónicas prolongadas, así como las consideraciones éticas del uso de los animales, son obstáculos para la investigación experimental de la EET barreras entre especies. Evaluación de la barrera de la especie humana a las EET se basa en ratones modificados para expresar humana PrP C. Estos ratones requieren largos períodos de incubación a sucumbir a las EET o modificaciones a T humanosél molécula PrP C humana de inicio rápido de la enfermedad 9. Los períodos de incubación de las EET no humana en estos ratones pueden extenderse más allá de la vida útil normal de ratón haciendo la interpretación de los resultados negativos desafiantes. Los primates no humanos también han sido utilizados como indicadores para el estudio de las barreras entre especies humanas, pero estos estudios están llenos de los mismos desafíos que otros tipos de experimentación con animales y primates no humanos pueden no recapitular precisamente la enfermedad a medida que avanza en el huésped humano. Bioensayos animales siguen siendo el método &quot;estándar de oro&quot; para medir la susceptibilidad de una especie a dicha enfermedad, pero los obstáculos, los costos y la ética de estos estudios en animales vivos han obligado investigación sobre alternativas. Un número de ensayos in vitro, basados ​​en la evaluación de la conversión de PrP C anfitrión a una proteinasa K (PK) estado resistentes (PrPres) cuando se sembró por PrP TSE, se han desarrollado y utilizado para investigar TSE spECIES barreras 10-12. Ejemplos de ensayos in vitro incluyen ensayos libres de células de conversión, la proteína misfolding amplificación cíclica (EPCP), y el ratio de eficiencia de conversión (CER) ensayo de 10-14. Aunque ninguno de estos ensayos tienen en cuenta los factores periféricos que intervienen en las barreras de especies después de la infección natural, todo puede ser útil para identificar hosts potencialmente susceptibles para las EET. Aquí presentamos el protocolo para el ensayo CER, en el que dos desnaturalizados sustratos PrP C derivadas de homogeneizados cerebrales normales se utilizan en las principales reacciones de conversión del prión de banco (Figura 1) 13. PrP C en el sustrato desnaturalizado a pH 7,4 sólo se puede convertir en PrPres por PrP TSE se sembraron en la reacción en ausencia de una barrera de las especies 14. En contraste, la desnaturalización de PrP C en el otro sustrato a pH 3,5 permite que se convierte en PrP res después de la incubacióncon PrP TSE de cualquier especie y sirve como un control para la conversión. La relación de conversión de PrP C a PrP res en pH 7.4 sustrato con relación a la del sustrato pH 3.5 proporciona una medida de la barrera de especies. Hemos encontrado que el ensayo CER predice conoce barreras entre especies de ratones de laboratorio a diferentes EET y han utilizado el ensayo en los esfuerzos para predecir la barrera de las especies de numerosas especies de mamíferos, entre ellos el borrego cimarrón, a la caquexia crónica (CWD) y otras EET 14, 15. Los investigadores interesados ​​en una herramienta que permite la detección rápida de la EET barreras entre especies o la evaluación de la conversión de PrP C -a-PrP res encontrarán esta metodología útil.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris Geles SDS-PAGE</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Perlas de óxido de circonio</td><td>Siguiente Avance</td><td>ZROB05</td><td>Otras variedades de perlas también son efectivas</td></tr><tr><td>Anticuerpos</td><td>varios proveedores</td><td></td><td>Seleccione los anticuerpos primarios y secundarios apropiados para la detección de inmunotransferencia de PrPres de especies de interés</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td> <td>de perlasSiguiente Avance</td><td>Centrífuga BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Beckman</td><td>Coulter</td><td>369434</td><td>Alta velocidad con control</td></tr><tr><td>de temperatura Tubos cónicos</td><td>de cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Cuphorn</td><td>Sistemas de calor-Ultrasonidos</td><td>W-380</td><td>Heat Systems-Ultrasonics, Inc. ahora es Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometría programa de software</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Software de adquisición y análisis de imágenes</td><td>Otros programas, como NIH ImageJ, también funcionarán</td></tr><tr><td>Homogeneizador de onzas</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de extremo a extremo</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetra acético</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Producto químico peligroso: irritación ocular</td></tr><tr><td>Clorhidrato de guanidina, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, irritación de los ojos</td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Producto químico peligroso: ácido fuerte</td></tr><tr><td>Tampón de muestra de dodecilo sulfato de litio, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Producto químico peligroso: piel & irritación respiratoria, daño ocular grave, sólido inflamable</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Producto químico peligroso: toxicidad aguda, líquido inflamable</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-laurol-sarcosina (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, daño ocular</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Producto químico peligroso: irritación de la piel, daño ocular</td></tr><tr><td>Sistema de gel SDS-PAGE</td><td>Sistema</td> de <td>electroforesis Life</td> Technologies <td>NuPAGE Otros sistemas SDS-PAGE también funcionarán</td></tr><tr><td>Tubos de PCR (de baja fijación)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td> <td>de morteroFisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de polivinildifluoruro</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Producto químico peligroso: irritación de la piel y los ojos, sensibilización respiratoria, toxicidad orgánica</td></tr><tr><td>Agente reductor para muestras SDS-PAGE, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6750</td><td>Producto químico peligroso: toxicidad aguda</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, daño ocular, sólido inflamable</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Producto químico peligroso; base fuerte</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>Varios</td><td>Uso Tamaño de jeringa adecuado a los volúmenes de sustrato a homogeneizar</td></tr><tr><td>Agujas de jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (agitador de tubos de PCR)</td><td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Producto químico peligroso: irritación de la piel, los ojos, las vías respiratorias</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación ocular</td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Fisher Científico</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

la evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible especies barreras con un<em&gt; in vitro</em&gt; prion análisis de conversión de proteínas

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Los estudios para comprender la transmisión entre especies de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades priónicas) son desafiantes en el sentido de que generalmente se basan en estudios de desafío in vivo en animales largos y costosos. Se han desarrollado una serie de ensayos in vitro para ayudar a medir las barreras de las especies de priones, reduciendo así el uso de animales y proporcionando resultados más rápidos que los bioensayos animales. Aquí, presentamos el protocolo para un ensayo rápido de conversión de priones in vitro llamado ensayo de relación de eficiencia de conversión (CER). En este ensayo, la proteína priónica celular (PrPC) de un cerebro huésped no infectado se desnaturaliza a pH 7,4 y 3,5 para producir dos sustratos. Cuando el sustrato de pH 7.4 se incuba con el agente TSE, la cantidad de PrPC que se convierte en un estado resistente a la proteinasa K (PK) es modulada por la barrera de la especie del huésped original al agente TSE. Por el contrario, la PrPC en el sustrato de pH 3,5 se pliega incorrectamente por cualquier agente TSE. Al comparar la cantidad de proteína priónica resistente a PK en los dos sustratos, se puede hacer una evaluación de la barrera de especies del huésped. Demostramos que el ensayo CER predice correctamente las barreras de especies de priones conocidas de los ratones de laboratorio y, como ejemplo, mostramos algunos resultados preliminares que sugieren que los gatos monteses (Lynx rufus) pueden ser susceptibles al agente de la enfermedad de desgaste crónico del ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus).

El uso exitoso del ensayo CER es dependiente en gran medida de la calidad de los pares de sustrato utilizado en reacciones de conversión. Por esta razón, siguiendo los procedimientos para preparar pares sustrato CER, un inmunoblot de control de calidad debe llevarse a cabo (Figura 2). Para ambos sustratos, ensayo de 10-25 l por inmunotransferencia. PrP C debe ser fácilmente detectable en cada sustrato y los niveles de PrP C debe ser aproximadamente la misma entre los dos. Inmunorea...

Medir la barrera a la transmisión entre especies de enfermedades priónicas es un desafío y generalmente implica desafíos con animales o ensayos bioquímicos. Aquí, presentamos un ensayo de conversión de proteínas priónicas in vitro con la capacidad de predecir barreras de especies.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la barrera de especies de las encefalopatías espongiformes transmisibles, conocidas como TSE, hacia una especie determinada sin necesidad de exponer a animales vivos. Esto se logra primero preparando dos sustratos para el ensayo de conversión que se utilizarán en un ensayo in vitro. El segundo paso consiste en incubar estos sustratos con los agentes TSE que se desean probar a continuación.Después de digerir con proteasa K, las muestras se someten a electroforesis en gel de SDS y transferencia inmunológica. El paso final consiste en medir la cantidad de proteína PreOn resistente a la proteinasa K en cada sustrato mediante citometría D y comparar estas cantidades mediante el cálculo de una relación de eficiencia de conversión o CER. En última instancia, la CER proporciona una medida de la barrera entre especies para el TSE evaluado respecto a la especie huésped a partir de la cual se preparó el sustrato.Las ventajas de este ensayo incluyen su bajo costo, su corto plazo experimental y la sustitución de animales vivos por muestras de tejido. Aunque este método es muy adecuado para obtener información sobre las barreras de especies en enfermedades priónicas silvestres, puede aplicarse a cualquier otra especie de interés. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la preparación del sustrato, el control de calidad y la estandarización.Después de obtener tejido cerebral sano no infectado de la especie de interés, prepare un homogenado al 10% peso por volumen en tampón de lisis utilizando un molino de bolas o un mortero y pistilo. Homogenización. Luego, refine aún más los homogenados sometiéndolos a una homogenización con jeringa y aguja, usando agujas de calibre creciente hasta que el sustrato pueda aspirarse y expulsarse con facilidad a través de una aguja de jeringa de calibre 27. A continuación, divida el homogenado cerebral en dos volúmenes iguales en tubos cónicos plásticos separados y etiquetados, y agregue clorhidrato de guanidina tres molar en XPBS a pH 3,5 o 7,4 a cada tubo en una proporción de volumen uno a uno respecto al homogenado cerebral.Ahora, verifique los valores de pH de las soluciones de sustrato y use ácido clorhídrico concentrado o hidróxido de sodio según sea necesario para asegurar que el pH de cada sustrato permanezca dentro de ±0,05 del pH objetivo. Agite las soluciones en un mezclador rotatorio de extremo a extremo a temperatura ambiente durante cinco horas. Luego, precipite la proteína añadiendo cuatro volúmenes de metanol a las soluciones de sustrato en cada vórtice cónico para mezclar bien e incube a menos 20 grados Celsius durante 16 a 18 horas.Después de la incubación, sedimente las muestras por centrifugación a 13.000 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, deseche con cuidado y deseche los sobrenadantes S y permita que el metanol se evapore de los pellets. Utilice aplicadores de algodón para ayudar a absorber el metanol adherido al interior del tubo.No permita que los pellet se sequen en exceso. Pase al siguiente paso cuando ya no sea visible el metanol; utilice una cantidad de tampón de conversión igual a la cantidad de material inicial de homogenato cerebral para resuspender los pellet de proteína. Después de la resuspensión, sonicar brevemente las soluciones de sustrato durante 10 segundos.Someta a ultrasonidos en un bocín de copa alrededor del 30 % de la potencia máxima. Luego, alícuote las soluciones en volúmenes de 0,5 a un mililitro en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros etiquetados, ya que la proteína priónica celular en ambos sustratos debe ser sensible a la proteinasa K. Trate de 10 a 25 microlitros de cada sustrato con proteinasa K a una concentración final de 100 microgramos por mililitro y digiera las muestras a 1000 RPM a 37 grados Celsius durante una hora en el agitador térmico. Cargue los sustratos digeridos con proteinasa K, junto con 10 a 25 microlitros de cada sustrato no digerido.Sobre una página de SDS, geles e inmunobloqueo con un anticuerpo específico contra la proteína priónica para evaluar la proteína priónica del hospedador, la resistencia a la proteinasa K y los niveles de proteína no digerida. Esta imagen muestra los resultados del inmunoblot. Las dos primeras calles contienen los sustratos no digeridos y las dos calles de la derecha contienen el sustrato digerido con proteinasa K.Si los niveles de proteína en los sustratos de pH 7,4 y 3,5 son aproximadamente un 10 % similares entre sí y no son resistentes a la proteinasa K, los pares de sustratos son adecuados para su uso en estudios de CER; almacene otras alícuotas a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar el ensayo de CER. Los agentes TSE deben manipularse utilizando las precauciones de bioseguridad adecuadas y según las directrices institucionales. Tras obtener el tejido cerebral infectado con TSE de la especie de interés, prepare un homogeneizado al 10 % peso/volumen en un XPBS a pH 7,4 utilizando el método de homogenización empleado previamente para la preparación de los pares de sustratos.Transferir los homogeneizados resultantes a volúmenes de 100 a 300 microlitros en tubos microcentrífugos de 0,5 mililitros y almacenarlos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para realizar el ensayo CER. Para comenzar, descongele lentamente cantidades iguales de sustrato CER no infectado a pH 3,5 y 7,4, pares y soluciones semilla infectadas con TSE, colocándolas sobre una cama de hielo durante aproximadamente una hora. Después del descongelamiento, mantenga las soluciones en hielo y vuelva a homogeneizarlas aspirando y expulsando cada solución de sustrato a través de una aguja de jeringa de calibre 27.Luego, sonicar brevemente cada solución infectada con TSE durante 10 segundos a aproximadamente el 30 % de la potencia máxima. A continuación, preparar las reacciones de conversión en tubos PCR de pared delgada y baja unión, etiquetados, pipeteando 95 microlitros de sustrato CER preparado a pH 7,4 en duplicado en dos de los tubos, y 95 microlitros de sustrato CER preparado a pH 3,5 en duplicado en otros dos tubos adicionales.Luego, agregue cinco microlitros de solución de semilla infectada al 10 %TSE a un tubo de cada sustrato con pH 7,4 y 3,5. En paralelo, agregue cinco microlitros de tampón de conversión al otro tubo de cada sustrato con pH 7,4 y 3,5 para controlar la conversión no específica y no templada. Además, prepare un control para la proteína priónica resistente a la proteinasa K de entrada.Para cada agente TSE que se esté analizando, añada cinco microlitros de solución de semilla infectada al 10 % TSE a 95 microlitros de tampón de conversión como control. Vortexe brevemente cada muestra en su tubo PCR cerrado, dedo y sustrato. A continuación, realice un breve impulso en una minicentrífuga de banco de baja velocidad para eliminar cualquier volumen de la mezcla de reacción atrapado en la tapa del tubo PCR.Cargue los tubos en un agitador térmico de banco equipado para aceptar tubos PCR y agite las muestras a 1000 RPM a 37 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, agregue sarco celda a una concentración final de 2 % peso por volumen y proteinasa K a una concentración final de 100 microgramos por mililitro. Diga las muestras a 1000 RPM a 37 grados Celsius durante una hora en el agitador térmico. Agregue tampón de muestra SDS-PAGE y caliente las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos, y separe la proteína PreOn resistente a pronasa K restante en cada muestra mediante SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia como antes. Finalmente, calcule la relación de eficiencia de conversión como una medida de la barrera entre especies.De acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, el sustrato del ensayo CER para ratón, preparado a pH 7,4 o 3,5, se incubó con scrapie adaptado a ratón RML, oveja doméstica, scrapie clásico, enfermedad crónica por desgaste en ciervo de cola blanca, o la cepa 263K de scrapie adaptado a hámster. En el ensayo CER, las muestras control etiquetadas como ninguna contenían una cantidad igual de agente infeccioso y ninguna muestra de sustrato de ratón se analizó en busca de la presencia de proteína priónica resistente a la proteinasa K mediante inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal SAF 83.Los valores brutos de tric para cada muestra se muestran debajo de cada carril del resultado de la proteinasa. Los niveles de proteína priónica resistente a la proteinasa K variaron entre los sustratos de ratón, desnaturalizados a pH 7,4 e inoculados con diversos agentes EET. Aunque se detectó proteína priónica resistente a la proteinasa K en todos los sustratos desnaturalizados a pH 3,5 e inoculados con un agente EET, este gráfico de barras muestra las proporciones medias más o menos la desviación estándar entre los sustratos de ratón a pH 7,4 y 3,5 para cada agente infeccioso, basadas en al menos tres ensayos independientes.Las letras minúsculas indican subconjuntos estadísticamente homogéneos determinados mediante un valor p inferior a 0,05 utilizando el análisis de varianza. Con el método de diferencias significativas mínimas de Tookie Kramer, una vez dominada esta técnica, puede realizarse en menos de 48 horas si se lleva a cabo correctamente. El ensayo CER puede utilizarse como evaluación inicial de la existencia de una barrera de especie EET que pueda justificar u obviar estudios adicionales en animales vivos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar sustratos, configurar reacciones de conversión y calcular las relaciones de eficiencia de conversión para evaluar las barreras entre especies.

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A continuación se describe un ensayo de novela de Vigilancia de la aceptación de priones y el tráfico por las células inmunes inmediatamente después de la inoculación intraperitoneal de purificación y el etiquetado fluorescente barras de agregados de priones a partir de material cerebral infectado entonces el seguimiento de su consumo y el movimiento del punto de inyección y la caracterización de las células mediadoras de estos eventos.

Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Misfolding proteína amplificación cíclica (EPCP) es un ensayo in vitro para el estudio de la conversión de priones y barreras cepa y especie. También se puede utilizar como un ensayo de detección de priones.

Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Incubar con una enzima proteolítica para digerir los priones normales, dejando intactos los agregados resistentes.

Detección de agregados de proteínas priónicas mal plegadas en tejido cerebral de ratón mediante Western Blotting

Los carroñeros tienen potencial para trasladar infecciosas priones de encefalopatía espongiforme transmisible en sus heces a las zonas libres de la enfermedad. Nos detalle los métodos utilizados para determinar si priones de scrapie adaptados-ratón permanecen infecciosa después del paso a través del tracto digestivo de cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un consumidor común de animales muertos.

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

priones de 'jove_content ha surgido recientemente como implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas. El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar el nematodo C. elegans como sistema modelo para monitorear la propagación de proteínas e investigar fenómenos similares a los priones.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.

Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica de amplificación del prión simple, rápido y eficiente, el método de conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC).

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El inmunomarcaje de proteínas priónicas anormales mediante protocolos inmunohistoquímicos requiere metodologías específicas de preparación de muestras y anticuerpos anti-PrP. El presente protocolo describe los pasos clave en el desenmascaramiento de epítopos para garantizar un inmunoetiquetado adecuado de PrP y minimizar la tinción de fondo no específica. Además, este enfoque considera medidas de bioseguridad al realizar estudios inmunohistoquímicos con los tejidos infectados por priones.

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Falta un método para evaluar las áreas de uso común en entornos de laboratorio para detectar la contaminación priónica y una descontaminación efectiva. El protocolo descrito aquí proporciona los fundamentos clave para implementar una prueba de deslizamiento de seguridad priónica de laboratorio que se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades individuales de laboratorios específicos.

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Se describe un modelo de rata de trastorno de estrés postraumático (TEPT), que revela las alteraciones persistentes en la función neuroendocrina y el retraso a largo plazo, la respuesta temor exagerado, característicos de pacientes con TEPT. El modelo animal y los métodos descritos aquí son útiles para la correlación de biomarcadores en núcleos cerebrales, que son mecanicista, pero no se puede medir en los pacientes, con biomarcadores en la sangre periférica de células blancas, que pueden.

Biomarcadores en un modelo animal para Revelar correlatos neurales, hematológicas y conductuales de estrés postraumático

Aprende a evaluar barreras de especie en encefalopatías espongiformes transmisibles mediante un ensayo in vitro de conversión de proteína priónica. Este método evita el uso de animales vivos y proporciona resultados confiables.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un In Vitro Prion Análisis de Conversión de proteínas (Video) | JoVE Journal

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