La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la barrera de especies de las encefalopatías espongiformes transmisibles, conocidas como TSE, hacia una especie determinada sin necesidad de exponer a animales vivos. Esto se logra primero preparando dos sustratos para el ensayo de conversión que se utilizarán en un ensayo in vitro. El segundo paso consiste en incubar estos sustratos con los agentes TSE que se desean probar a continuación.

Después de digerir con proteasa K, las muestras se someten a electroforesis en gel de SDS y transferencia inmunológica. El paso final consiste en medir la cantidad de proteína PreOn resistente a la proteinasa K en cada sustrato mediante citometría D y comparar estas cantidades mediante el cálculo de una relación de eficiencia de conversión o CER. En última instancia, la CER proporciona una medida de la barrera entre especies para el TSE evaluado respecto a la especie huésped a partir de la cual se preparó el sustrato.

Las ventajas de este ensayo incluyen su bajo costo, su corto plazo experimental y la sustitución de animales vivos por muestras de tejido. Aunque este método es muy adecuado para obtener información sobre las barreras de especies en enfermedades priónicas silvestres, puede aplicarse a cualquier otra especie de interés. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la preparación del sustrato, el control de calidad y la estandarización.

Después de obtener tejido cerebral sano no infectado de la especie de interés, prepare un homogenado al 10% peso por volumen en tampón de lisis utilizando un molino de bolas o un mortero y pistilo. Homogenización. Luego, refine aún más los homogenados sometiéndolos a una homogenización con jeringa y aguja, usando agujas de calibre creciente hasta que el sustrato pueda aspirarse y expulsarse con facilidad a través de una aguja de jeringa de calibre 27. A continuación, divida el homogenado cerebral en dos volúmenes iguales en tubos cónicos plásticos separados y etiquetados, y agregue clorhidrato de guanidina tres molar en XPBS a pH 3,5 o 7,4 a cada tubo en una proporción de volumen uno a uno respecto al homogenado cerebral.

Ahora, verifique los valores de pH de las soluciones de sustrato y use ácido clorhídrico concentrado o hidróxido de sodio según sea necesario para asegurar que el pH de cada sustrato permanezca dentro de ±0,05 del pH objetivo. Agite las soluciones en un mezclador rotatorio de extremo a extremo a temperatura ambiente durante cinco horas. Luego, precipite la proteína añadiendo cuatro volúmenes de metanol a las soluciones de sustrato en cada vórtice cónico para mezclar bien e incube a menos 20 grados Celsius durante 16 a 18 horas.

Después de la incubación, sedimente las muestras por centrifugación a 13.000 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, deseche con cuidado y deseche los sobrenadantes S y permita que el metanol se evapore de los pellets. Utilice aplicadores de algodón para ayudar a absorber el metanol adherido al interior del tubo.

No permita que los pellet se sequen en exceso. Pase al siguiente paso cuando ya no sea visible el metanol; utilice una cantidad de tampón de conversión igual a la cantidad de material inicial de homogenato cerebral para resuspender los pellet de proteína. Después de la resuspensión, sonicar brevemente las soluciones de sustrato durante 10 segundos.

Someta a ultrasonidos en un bocín de copa alrededor del 30 % de la potencia máxima. Luego, alícuote las soluciones en volúmenes de 0,5 a un mililitro en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros etiquetados, ya que la proteína priónica celular en ambos sustratos debe ser sensible a la proteinasa K. Trate de 10 a 25 microlitros de cada sustrato con proteinasa K a una concentración final de 100 microgramos por mililitro y digiera las muestras a 1000 RPM a 37 grados Celsius durante una hora en el agitador térmico. Cargue los sustratos digeridos con proteinasa K, junto con 10 a 25 microlitros de cada sustrato no digerido.

Sobre una página de SDS, geles e inmunobloqueo con un anticuerpo específico contra la proteína priónica para evaluar la proteína priónica del hospedador, la resistencia a la proteinasa K y los niveles de proteína no digerida. Esta imagen muestra los resultados del inmunoblot. Las dos primeras calles contienen los sustratos no digeridos y las dos calles de la derecha contienen el sustrato digerido con proteinasa K.

Si los niveles de proteína en los sustratos de pH 7,4 y 3,5 son aproximadamente un 10 % similares entre sí y no son resistentes a la proteinasa K, los pares de sustratos son adecuados para su uso en estudios de CER; almacene otras alícuotas a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar el ensayo de CER. Los agentes TSE deben manipularse utilizando las precauciones de bioseguridad adecuadas y según las directrices institucionales. Tras obtener el tejido cerebral infectado con TSE de la especie de interés, prepare un homogeneizado al 10 % peso/volumen en un XPBS a pH 7,4 utilizando el método de homogenización empleado previamente para la preparación de los pares de sustratos.

Transferir los homogeneizados resultantes a volúmenes de 100 a 300 microlitros en tubos microcentrífugos de 0,5 mililitros y almacenarlos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para realizar el ensayo CER. Para comenzar, descongele lentamente cantidades iguales de sustrato CER no infectado a pH 3,5 y 7,4, pares y soluciones semilla infectadas con TSE, colocándolas sobre una cama de hielo durante aproximadamente una hora. Después del descongelamiento, mantenga las soluciones en hielo y vuelva a homogeneizarlas aspirando y expulsando cada solución de sustrato a través de una aguja de jeringa de calibre 27.

Luego, sonicar brevemente cada solución infectada con TSE durante 10 segundos a aproximadamente el 30 % de la potencia máxima. A continuación, preparar las reacciones de conversión en tubos PCR de pared delgada y baja unión, etiquetados, pipeteando 95 microlitros de sustrato CER preparado a pH 7,4 en duplicado en dos de los tubos, y 95 microlitros de sustrato CER preparado a pH 3,5 en duplicado en otros dos tubos adicionales.

Luego, agregue cinco microlitros de solución de semilla infectada al 10 %TSE a un tubo de cada sustrato con pH 7,4 y 3,5. En paralelo, agregue cinco microlitros de tampón de conversión al otro tubo de cada sustrato con pH 7,4 y 3,5 para controlar la conversión no específica y no templada. Además, prepare un control para la proteína priónica resistente a la proteinasa K de entrada.

Para cada agente TSE que se esté analizando, añada cinco microlitros de solución de semilla infectada al 10 % TSE a 95 microlitros de tampón de conversión como control. Vortexe brevemente cada muestra en su tubo PCR cerrado, dedo y sustrato. A continuación, realice un breve impulso en una minicentrífuga de banco de baja velocidad para eliminar cualquier volumen de la mezcla de reacción atrapado en la tapa del tubo PCR.

Cargue los tubos en un agitador térmico de banco equipado para aceptar tubos PCR y agite las muestras a 1000 RPM a 37 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, agregue sarco celda a una concentración final de 2 % peso por volumen y proteinasa K a una concentración final de 100 microgramos por mililitro. Diga las muestras a 1000 RPM a 37 grados Celsius durante una hora en el agitador térmico. Agregue tampón de muestra SDS-PAGE y caliente las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos, y separe la proteína PreOn resistente a pronasa K restante en cada muestra mediante SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia como antes. Finalmente, calcule la relación de eficiencia de conversión como una medida de la barrera entre especies.

De acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, el sustrato del ensayo CER para ratón, preparado a pH 7,4 o 3,5, se incubó con scrapie adaptado a ratón RML, oveja doméstica, scrapie clásico, enfermedad crónica por desgaste en ciervo de cola blanca, o la cepa 263K de scrapie adaptado a hámster. En el ensayo CER, las muestras control etiquetadas como ninguna contenían una cantidad igual de agente infeccioso y ninguna muestra de sustrato de ratón se analizó en busca de la presencia de proteína priónica resistente a la proteinasa K mediante inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal SAF 83.

Los valores brutos de tric para cada muestra se muestran debajo de cada carril del resultado de la proteinasa. Los niveles de proteína priónica resistente a la proteinasa K variaron entre los sustratos de ratón, desnaturalizados a pH 7,4 e inoculados con diversos agentes EET. Aunque se detectó proteína priónica resistente a la proteinasa K en todos los sustratos desnaturalizados a pH 3,5 e inoculados con un agente EET, este gráfico de barras muestra las proporciones medias más o menos la desviación estándar entre los sustratos de ratón a pH 7,4 y 3,5 para cada agente infeccioso, basadas en al menos tres ensayos independientes.

Las letras minúsculas indican subconjuntos estadísticamente homogéneos determinados mediante un valor p inferior a 0,05 utilizando el análisis de varianza. Con el método de diferencias significativas mínimas de Tookie Kramer, una vez dominada esta técnica, puede realizarse en menos de 48 horas si se lleva a cabo correctamente. El ensayo CER puede utilizarse como evaluación inicial de la existencia de una barrera de especie EET que pueda justificar u obviar estudios adicionales en animales vivos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar sustratos, configurar reacciones de conversión y calcular las relaciones de eficiencia de conversión para evaluar las barreras entre especies.