El busulfán como agente mielosupresor para Generación estable de alto nivel de Médula Ósea quimerismo en ratones

El objetivo general de este procedimiento consiste en reemplazar el compartimento de médula ósea de ratones receptores con células de médula ósea de ratones donantes que expresan ubiquitamente la proteína verde fluorescente. En ausencia de irradiación. Esto se logra primero condicionando al ratón receptor mediante inyecciones intraperitoneales seriadas del compuesto mielosupresor busulfán.

A continuación, se aíslan células de médula ósea de los fémures y tibias de un ratón donante que expresa de manera ubicua la proteína verde fluorescente. Finalmente, se trasplantan las células de médula ósea donantes en un ratón receptor acondicionado mediante una inyección en la vena de la cola. En última instancia, se recoge sangre del ratón trasplantado y se analiza mediante citometría de flujo para estimar el grado de quimerismo de la médula ósea.

Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como la irradiación corporal total son que puede establecerse un alto grado de quimerismo en la médula ósea sin los efectos citotóxicos de la irradiación corporal total y sin necesidad de instalaciones ni equipos especializados. Este método no solo permite obtener información sobre la acumulación de células derivadas de la médula ósea en el sistema nervioso central, sino que también puede utilizarse para estudiar temas de investigación como el desarrollo de la linaje hematopoyético, la inmunobiología y la leucemia. Para preparar los ratones receptores, prepare busulfán diluido según el protocolo descrito en el texto y administre 20 miligramos por kilogramo a los ratones receptores diariamente mediante inyección intraperitoneal.

Después de sacrificar los ratones según las directrices institucionales, bajo una cabina de flujo laminar, rocíe un ratón con etanol al 70 %. Levante la piel en la región abdominal y, con tijeras quirúrgicas, haga una incisión a través de la piel desde la cavidad abdominal, hacia arriba por la pata en dirección al tobillo sosteniendo el pie. Tire firmemente de la piel desde el tobillo hacia la cadera, exponiendo el tejido de la pata.

Recorte el músculo y la grasa del fémur para exponer la articulación de la cadera mientras tira suavemente del pie. Para extender la pierna, presione las tijeras contra los huesos de la pelvis y corte justo por encima de la cabeza del fémur, teniendo cuidado de no cortar el fémur mismo. Para ayudar a mantener la esterilidad, sostenga la pierna por el pie y limpie cualquier tejido restante del fémur utilizando tijeras y tejidos autoclavados para frotar la superficie del hueso.

Seccione el fémur y la tibia cortando a través de la articulación de la rodilla y coloque el fémur en una placa de cultivo que contenga PBS; incube en hielo. A continuación, retire y deseche la fibula cortando en los puntos donde esta se conecta con la tibia. Luego limpie la tibia.

Retire el pie cortando la tibia donde termina la médula roja, y coloque la tibia en la placa de cultivo junto con el fémur e incube en hielo. Utilice pinzas para sostener el fémur y, con tijeras quirúrgicas, corte cuidadosamente los extremos distales del hueso. Retire la menor cantidad posible de hueso necesaria para exponer la cavidad medular con tres mililitros de PBS estéril.

Llene una jeringa y coloque una aguja de calibre 23. Introduzca cuidadosamente la aguja en la cavidad medular y lave la médula ósea hacia un recipiente de cultivo estéril. Utilice la punta de la aguja para raspar la cavidad medular y asegurar la eliminación de todas las células deseadas tras la extracción.

Asegúrese de que la médula ósea roja ya no sea visible y de que el hueso aparezca ahora blanco. Utilice pinzas para sostener la tibia y, con tijeras quirúrgicas, afeite cuidadosamente el extremo donde la tibia estaba unida a la rodilla. Para exponer la cavidad medular, llene una jeringa con tres mililitros de PBS estéril y coloque una aguja de calibre 25.

Introduzca cuidadosamente la aguja en la cavidad medular y lave la médula ósea hacia el recipiente con médula ósea agrupada procedente de los fémures. Con una punta de pipeta de un mililitro, disocie suavemente la médula ósea para separar las células. Pase la suspensión celular a través de un filtro de malla de 40 micrones hacia un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros.

Use PBS para enjuagar el recipiente y recoger cualquier célula restante, y transfiera el tampón a través del filtro hacia el tubo de centrífuga. Añada PBS al tubo hasta obtener un volumen final de 30 a 40 mililitros y centrifugue a 450 ×g y 4 °C durante cinco minutos. Luego, retire y deseche el sobrenadante.

ReSuspender el precipitado con tres mililitros de tampón de lisis de eritrocitos e incubar en hielo durante 8,5 minutos. Posteriormente, añadir aproximadamente 30 mililitros de PBS estéril para detener la acción del tampón de lisis, centrifugar y desechar el sobrenadante. Utilizar un mililitro de PBS estéril para resuspender el precipitado y mantenerlo en hielo.

Diluya una pequeña cantidad de homogenato celular con PBS y utilice un hemocitómetro para contar las células. Diluya la suspensión celular hasta ocho veces 10 a la seis células por mililitro y incube en hielo hasta la inyección. Para realizar el trasplante de médula ósea, agregue 300 microlitros de la suspensión celular diluida a una jeringa de 0,5 mililitros.

Para cada ratón que vaya a ser inyectado, asegúrese de eliminar cualquier burbuja de aire. Coloque la jaula del ratón con los ratones receptores acondicionados sobre una almohadilla calefactora y permita que las venas caudales laterales se dilaten. Introduzca un ratón receptor en un dispositivo de inmovilización del tamaño adecuado, limpie la cola con gasa quirúrgica empapada en etanol al 70%, sostenga firmemente la cola y, con el bisel hacia arriba, inserte suavemente la aguja en una de las venas caudales laterales e inyecte la suspensión celular.

Mantenga una gasa quirúrgica sobre el sitio de inyección hasta que deje de sangrar. Antes de introducir el ratón en una jaula limpia nueva, aproximadamente dos o tres semanas después del trasplante de médula ósea, coloque el ratón en un tubo de contención y afeite el pelo de la pata posterior para exponer la vena safena lateral. A continuación, aplique una capa fina de vaselina sobre la pata y utilice una aguja de calibre 25 para atravesar la vena safena con un tubo capilar recubierto de heparina.

Recolecte aproximadamente 50 microlitros de sangre, luego use gasa quirúrgica para detener la hemorragia. Una vez que cese la hemorragia, devuelva el ratón a la jaula. Añada la sangre a un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de tampón fax.

Mezcle el tubo mediante inversión y almacénelo en hielo. Centrifugue las muestras de sangre a 900 veces G durante cinco minutos. Después de retirar y desechar el sobrenadante, use 500 microlitros de tampón lisador de eritrocitos para resuspender el precipitado e incube en hielo durante 8,5 minutos. Posteriormente, añada un mililitro de tampón fax para detener la acción del tampón lisador y centrifugue a 900 veces G durante cinco minutos.

Después de lisar y centrifugar por segunda vez, según el protocolo descrito, verifique que el precipitado sea ahora blanco. Si es rojo, repita el paso de lisis por tercera vez resuspendiendo. Suspenda el precipitado en tampón fax y utilice citometría de flujo para cuantificar la proporción de células positivas para GFP.

Este gráfico muestra los niveles de quimerismo cuantificados semanalmente en sangre periférica de ratones condicionados con 100 miligramos por kilogramo de busulfán que recibieron un trasplante exitoso de médula ósea singénica y de ratones condicionados con 80 miligramos por kilogramo de busulfán que recibieron un trasplante fallido de médula ósea alogénica. Niveles de quimerismo superiores al 80 % se establecen típicamente entre las tres y cuatro semanas posteriores al trasplante de médula ósea; aquí se muestran datos representativos de sangre periférica que muestran un trasplante de médula ósea exitoso y otro fallido tres semanas después del procedimiento. Estos datos de citometría de flujo muestran que un alto grado de quimerismo permanece establecido durante al menos un año en la médula ósea, y que el acondicionamiento con vehículo no es suficiente para inducir quimerismo en la médula ósea.

Aunque no existen diferencias significativas en los niveles de quimerismo medular logrados utilizando dosis de 60 a 100 miligramos por kilogramo de busulfán, las células positivas para GFP se acumulan dentro del sistema nervioso central de manera dependiente de la dosis. Esta figura ilustra la acumulación de células derivadas de la médula ósea positivas para GFP en la región lumbar de la médula espinal de un ratón tipo silvestre, y en mayor grado en un modelo murino de la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrófica. Al implementar este procedimiento, es importante utilizar ratones receptores y donantes singénicos del mismo sexo con el fin de minimizar la posibilidad de rechazo del trasplante tras seguir este procedimiento.

Se pueden utilizar otros métodos como la citometría de flujo y la inmunohistoquímica para estudiar los mecanismos mediante los cuales las células derivadas de la médula ósea ingresan al sistema nervioso central.