Un modelo murino de irreversible y reversible obstrucción ureteral unilateral

Este video presenta un modelo de ratón de neuropatía obstructiva inducida por obstrucción ureteral unilateral que puede ser irreversible o reversible; se muestran datos histológicos que destacan el daño estructural resultante y su recuperación tras la reversión. Este dibujo esquemático ilustra los pasos principales de este modelo. Aquí observamos el uréter izquierdo, el riñón y la vejiga.

Se induce una obstrucción ureteral unilateral estándar mediante la ligadura del uréter. Con el tiempo, el uréter se dilata y el riñón se vuelve hidronefrótico. Para realizar una obstrucción ureteral unilateral reversible, se liga el uréter cerca de la vejiga y se coloca un tubo plástico de pared blanda, mostrado en gris, alrededor del uréter en el punto de obstrucción.

Con el fin de limitar la dilatación excesiva de la uretra, el riñón se vuelve hidronefrótico con el tiempo y luego se desobstruye en un punto temporal adecuado para el estudio. Siete días en este experimento, se retira el tubo de pared blanda y se secciona la uretra justo por encima del nivel de ligadura. La uretra desobstruida se anastomosa en la vejiga para permitir el flujo de orina, y el riñón generalmente se descomprime durante varios días.

El modelo de obstrucción ureteral unilateral conocido como UUO puede utilizarse para estudiar el desarrollo del daño tisular y la fibrosis tras la nefropatía obstructiva. El modelo de obstrucción ureteral reversible abreviado como RUUO puede emplearse para obtener información sobre la remodelación tisular que podría seguir al daño. A continuación se muestra una representación de un experimento típico que incluye tanto los procedimientos UUL como nuestros procedimientos UUL.

A los ratones se les realiza una LUL el día cero y siete días después. Los ratones se sacrifican para evaluar el grado de lesión o se desobstruyen los uréteres para realizar una RLUU. Luego, se permite que los riñones se descompriman durante siete días antes de obtener el tejido.

El tejido puede evaluarse en busca de lesiones estructurales, infiltración de macrófagos, acumulación de miofibroblastos y fibrosis. A continuación se muestra un entorno quirúrgico típico. El procedimiento se realiza utilizando instrumentos y materiales desechables esterilizados en autoclave, colocados dentro de un campo quirúrgico estéril.

Si se opera a varios animales, los instrumentos deben esterilizarse entre procedimientos mediante un esterilizador de perlas o se debe utilizar un juego nuevo de instrumentos para cada procedimiento. Los operadores deben usar bata estéril, mascarilla, gorro y guantes. Este ratón macho C57BL/6 de ocho semanas de edad ha sido anestesiado mediante una inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina y meine.

La profundidad de la anestesia se ha confirmado mediante la pérdida de reacción a un pellizco en el dedo del pie. Se ha afeitado y sanitizado el área quirúrgica utilizando una solución diluida de clorhexidina. Se ha aplicado lubricante ocular para prevenir el secado corneal.

Se ha administrado clorhidrato de buprenorfina, un analgésico, mediante inyección subcutánea. La boca se ha colocado sobre una almohadilla quirúrgica estéril cubierta y calentada, y las extremidades se han inmovilizado utilizando tijeras separadoras de tejidos; luego se realiza una laparotomía media y se hace una incisión a lo largo de la línea avascular del codo. En este próximo capítulo se detallará cómo realizar una UUOA irreversible; se inserta un retractor calibrador en la incisión y se cubre al ratón con campos estériles.

Se desplazan los intestinos y se cubren con gasa estéril humedecida para exponer el uréter izquierdo. Se expone y aísla el uréter utilizando fórceps angulados para inducir la obstrucción. El uréter se liga dos veces utilizando sutura de seda negra trenzada 6-0.

La uretra puede obstruirse en cualquier punto entre la vejiga y la pelvis renal. A continuación, la uretra se divide entre las suturas. El siguiente capítulo detallará cómo realizar una obstrucción ureteral que pueda revertirse.

Esta es la primera etapa de un RUUL. Se expone y aísla el uréter utilizando fórceps angulados para inducir obstrucción. El uréter se liga dos veces utilizando sutura de seda negra trenzada 6.0.

La uretra debe obstruirse cerca de la vejiga para preservar una longitud adecuada de uretra para la anastomosis a la vejiga. Durante el procedimiento de reversión, se recortan los puntos de sutura, pero se deja uno largo para su uso posterior, y se corta una longitud de aproximadamente cinco milímetros de tubo plástico de pared blanda. Luego se realiza una hendidura longitudinal de manera que pueda abrirse en abanico para permitir que se coloque alrededor de la uretra.

El tubo plástico de pared blanda debe tener un diámetro interno de un milímetro y un diámetro externo de dos milímetros. Luego, el tubo plástico de pared blanda se coloca cuidadosamente alrededor del uréter, asegurando que, una vez cerrado, la sutura larga emerja desde el centro de la hendidura. A continuación, se pasa una longitud de seis puntos de sutura de seda negra trenzada alrededor del tubo y se anuda.

Una vez que la sutura larga que emerge desde el centro del tubo se incorpora luego al siguiente nudo. Este paso se realiza para fijar firmemente el uréter y el tubo en su lugar. El tubo colocado alrededor del uréter evitará una dilatación excesiva del uréter al final de los procedimientos UUO y RUUO.

Se reemplazan los intestinos y se sutura el peritoneo, y la piel se cierra con clips metálicos. También se aplica yodo al área quirúrgica. La anestesia se revierte parcialmente mediante una inyección subcutánea de aamaz.

Se administra clorhidrato y líquidos mediante una inyección subcutánea de un mililitro de solución salina tibia. Los ratones se monitorean hasta que recuperen la conciencia y luego se les permite recuperarse en una caja térmica mantenida a 29 grados durante 24 horas. Los riñones se vuelven hidronefróticos en los días siguientes a la obstrucción uterina.

Los ratones pueden sacrificarse en diferentes momentos durante la fase de lesión o tras la reversión de la obstrucción. El siguiente capítulo detalla cómo realizar una reversión, que es la segunda etapa del procedimiento RUUO. El ratón se anestesia y prepara como se describió anteriormente.

Se retiran los clips metálicos de la piel y se realiza una laparotomía. Se eliminan las suturas peritoneales y el peritoneo puede abrirse suavemente con fórceps de dientes de rata. Luego se prepara el ratón y se expone el uréter izquierdo como se describió previamente, utilizando fórceps angulados.

Se aísla el uréter y el tubo plástico de pared blanda del tejido circundante. Con el bisturí se cortan las suturas que mantienen en su lugar el tubo de pared blanda, y luego se retiran. A continuación, se retira cuidadosamente el tubo plástico de pared blanda y se observa un uréter dilatado.

El uréter es frágil en el punto de obstrucción y podría romperse por encima de la obstrucción, tal como ocurrió en este clip. Sin embargo, las suturas colocadas previamente cerca de la vejiga durante la primera etapa de la OOU permanecerán intactas, lo que garantizará que no haya escape de orina desde la vejiga hacia la cavidad peritoneal. Se coloca un trozo de gasa estéril debajo del uréter para recoger cualquier sedimento urinario que drene desde el uréter previamente obstruido.

La longitud restante del uréter obstruido debe dejarse drenar hasta que se produzca orina clara, para asegurar que la luz del uréter quede libre de cualquier material residual. Una vez que se ha drenado el uréter y la pelvis renal, se coloca una sutura larga de seda negra trenzada número seis en el extremo del uréter. Esta sutura se utiliza para facilitar la posterior anastomosis entre el uréter y la vejiga.

Entonces, se gira el uréter de manera que quede anterior a su posición original y sobre el riñón. Se coloca una sola sutura monofilamento de nano poliamida TAing en el extremo del uréter. Se tiene cuidado para asegurar que la sutura permanezca en la capa muscular y no ingrese al lumen ureteral.

La sutura se utiliza para anclar el uréter en la vejiga posteriormente, preparando así la vejiga para la anastomosis; se crea un conducto a través de la vejiga pasando una aguja de calibre 21 diagonalmente a través de ella. Luego, la aguja de calibre 21 se utiliza para guiar una aguja de ojo a través de la vejiga. La sutura de Nino previamente colocada en el uréter se pasa entonces a través de la primera incisión en la vejiga y hacia afuera a través de la pared de la vejiga adyacente al punto de entrada, para introducir el uréter dentro de la vejiga.

La sutura larga de seis ceros colocada al final del uréter se pasa a través del ojo de la aguja. A continuación, la aguja con ojo se retira lentamente a través de la vejiga, asegurándose de que el uréter también sea arrastrado dentro de la vejiga. Una vez que el uréter se encuentra dentro de la vejiga, las nano suturas colocadas en la pared del uréter y de la vejiga se anudan para fijar el uréter en su lugar y asegurarlo firmemente.

Se coloca una segunda sutura otax. Esta se pasa nuevamente a través del uréter, asegurando que permanezca dentro de la capa muscular, luego a través de la incisión de la vejiga y hacia afuera a través de la pared de la vejiga. A continuación, se anuda de manera similar.

También se coloca una tercera sutura de náilon en la parte posterior de la vejiga. A continuación, se utilizan los dorsos de unas tijeras abiertas para empujar ligeramente hacia atrás la pared de la vejiga y exponer la longitud del uréter. Luego, el uréter se secciona por encima de la sutura del ligamento.

La uretra pintada se retraerá entonces hacia dentro de la vejiga en ángulo. Se utilizan cuatro consejos para asegurar que la uretra se ha retraído completamente dentro de la vejiga. Finalmente, la herida de salida en la vejiga se cierra con una sutura de poliamida monofilamento de calibre 9-0 antes del cierre, asegurándose de que la uretra esté firmemente anclada dentro de la vejiga, cerca.

El peritoneo y la piel, como se describió previamente, proporcionan cuidados postoperatorios como se describió anteriormente. En este estudio, a todos los ratones con OOU se les permite recuperarse durante siete días para permitir que el riñón desobstruido se descomprima, aunque pueden estudiarse puntos temporales más tempranos o tardíos. A continuación se presentan datos que ilustran el aspecto de los riñones obstruidos y desobstruidos y la lesión resultante.

Esta figura ilustra el aspecto de los riñones, pelvis renal y uréteres U-U-L-U-U-O nativos en comparación con el riñón nativo. El riñón UUO que ha estado obstruido durante siete días presenta un aspecto hidronefrótico y un color pálido. Tras siete días de desobstrucción, el riñón RUO se ha descomprimido, con la pelvis renal y el uréter recuperando un tamaño y color similares a los del riñón nativo.

Téngase en cuenta que el uréter IUO es más corto que los uréteres de los riñones UUO y nativos debido a la técnica de desestructuración y a la anastomosis en la vejiga. Esta figura muestra imágenes representativas de secciones renales teñidas con H y E de riñones nativos, UUO y RUUO. El intersticio sano del riñón normal consta de cortes transversales de túbulos sanos y compactos.

Varios túbulos indicados por las flechas negras presentan una dilatación notable al séptimo día. Tras la LQU en contraste con el tubo, la dilatación se reduce marcadamente a los siete días posteriores a la reversión de la LUU. El modelo de ratón de nefropatía obstructiva presentado aquí se induce mediante obstrucción ureteral unilateral, que puede ser irreversible o reversible.

El modelo reversible detallado aquí permite la eliminación de la obstrucción uréteral y la anastomosis del uréter a la vejiga para restaurar completamente el flujo urinario. La consiguiente descompresión renal posibilita el estudio del remodelado del tejido en experimentos posteriores a la lesión. La incorporación de modelos de nefropatía obstructiva tanto irreversible como reversible proporciona a los investigadores una visión poderosa de los procesos de la enfermedad y de cómo las intervenciones terapéuticas modulan tanto el desarrollo de la lesión como el posterior remodelado del tejido.