De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de las interacciones de las células precursoras neurales o NPC trasplantadas marcadas con fluorescencia con axones fluorescentes en la médula espinal del ratón en tiempo real. Esto se logra retirando e incrustando cuidadosamente la médula espinal de ratones trasplantados con NPC en 5%aros y uniéndola a un cubreobjetos. La orientación de la médula espinal se puede alterar para ver la fluorescencia en cualquier región de la médula espinal.

En el segundo paso, la preparación de la médula espinal se coloca en la etapa de imágenes de dos fotones para obtener imágenes de NPC viables mientras se fusiona con medios RPMI oxigenados calientes durante un máximo de 10 horas. Se utiliza un divisor de haz diic de un solo borde apropiado para separar las emisiones YFP y GFP. En última instancia, la obtención de imágenes de dos fotones permite la visualización de las interacciones de las NPC que expresan GFP con los axones que expresan YFP en la médula espinal dañada en tiempo real.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogeneración, como ¿cuáles son las señales de señalización molecular y celular necesarias para la remielinización de NPC trasplantados de axones dañados, y cuáles son la cinética de estos eventos de remielinización? La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la imagen intermareal de dos fotones, que solo se puede utilizar para obtener imágenes de la médula espinal dorsal, es que este método permite obtener imágenes de NPC trasplantadas que han migrado a lo profundo de la región ventral de la médula espinal. Después de confirmar la eutanasia por transección espinal, humedezca el ratón con etanol al 70%, luego use tijeras finas y afiladas para quitar el pelo y la piel del dorso del animal, exponiendo la columna vertebral desde aproximadamente la lámina cervical uno o C uno hasta la lámina sacra cuatro o S cuatro.

A continuación, con un bisturí con una hoja número 10, haga incisiones a la izquierda y a la derecha de la columna vertebral para separarla del músculo circundante y del tejido graso y cortar el exceso de tejido alrededor y encima de la columna vertebral. Esto permitirá una extracción más fácil de las vértebras. Luego, mientras sostiene la parte superior de las vértebras espinales con pinzas grises dentadas, inserte unas tijeras de van curvadas de titanio con el lado curvo hacia arriba en la columna vertebral expuesta en C uno, teniendo cuidado de no tocar la médula espinal.

Desliza las tijeras completamente hacia la derecha y haz un pequeño corte. Se debe escuchar y sentir un pequeño crujido mientras las tijeras cortan las vértebras. Repita este corte en el extremo izquierdo del cordón, teniendo cuidado de no trabajar demasiado rápido o hacer un corte demasiado grande, ya que esto correrá el riesgo de dañar el cordón.

Una vez que se cortan los lados de las vértebras, la lámina individual debe poder levantarse con las pinzas. Repita los cortes izquierdo y derecho para cada lámina hasta llegar a S cuatro. Continuar sosteniendo y tirando hacia atrás las vértebras de la médula espinal.

Las vértebras sobre el trasplante pueden desprenderse una vez que la columna vertebral se corta hasta el sitio del trasplante. Una vez que las vértebras se hayan reducido a S cuatro, coloque las vértebras para ayudar a visualizar dónde está el sitio del trasplante y corte aproximadamente 20 milímetros rostral y mime hasta el sitio del trasplante. Ahora use un bisturí con una hoja número 11 para cortar cuidadosamente los ganglios a la derecha y a la izquierda del lado ventral de la médula espinal, comenzando en el extremo rostral.

Luego, invierta y sostenga al animal de modo que la médula espinal quede hacia abajo y use pinzas dentadas cerradas para despegar cuidadosamente la médula espinal del extremo del cuco. Luego, sin cortar la médula espinal, corte con cuidado los ganglios restantes para permitir que la médula espinal se levante en una sola pieza intacta, y coloque la médula en un medio sobre hielo para preparar la médula espinal para la toma de imágenes. Transfiera el tejido nervioso a una lámina de param con el lado ventral hacia arriba.

A continuación, pipetee aproximadamente cinco mililitros de solución recién preparada a 37 grados centígrados, al 5% de agro sobre el cordón, y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Después de unos cinco minutos, aplique una capa ligera de adhesivo para tejidos en un cubreobjetos cuadrado de 22 milímetros e invierta el lado ventral de la médula espinal incrustado hacia abajo en una nueva pieza de perfil. Adherir el cubreobjetos a la parte dorsal expuesta y sumergir toda la preparación en medio fresco para solidificar el adhesivo.

A continuación, utilice una cuchilla de afeitar para eliminar el exceso de aga rose solidificado. A continuación, inserte el tubo conectado a la bomba de tubos en una botella de medios, mantenida en un baño de agua para fusionar a 37 grados centígrados. Medios bastante calentados a través de un pozo de imágenes personalizado en la platina del microscopio a tres mililitros por minuto.

A continuación, coloque la preparación de la médula espinal en el pocillo con el lado ventral hacia arriba, hacia el objetivo de inmersión de 25 x. Para obtener imágenes de la médula espinal ventral mediante microscopía de dos fotones, utilice un láser de zafiro ultra titanio ajustado a 900 nanómetros con la potencia del láser atenuada en la muestra a menos del 5% para garantizar una fototoxicidad mínima. A continuación, utilizando el ocular y una fuente de luz de campo claro, enfoque el objetivo de inmersión en el borde ventral de la médula espinal.

Para establecer un punto de referencia, asegúrese de que la fuente de luz ambiental esté apagada. A continuación, abra el obturador láser para cambiar las dos citas fotónicas si están disponibles. Al buscar áreas de interés en el tejido, utilice una resolución más baja, un volumen más alto sin zoom digital y una velocidad de escaneo más alta que al adquirir las imágenes finales.

Para encontrar las células, lo mejor es enfocar la muestra bajo iluminación de campo claro en el borde del tejido, primero en el sitio del trasplante y luego cambiar a fluorescencia. A continuación, se puede utilizar un gran campo X e Y con una resolución baja para permitir la visualización rápida de un área grande a medida que el enfoque se adentra más en el tejido. Observe los axones EYFP cerca del borde ventral de la médula espinal.

La segunda señal armónica del colágeno que se observa aquí en azul será la más brillante en el borde del tejido de la médula espinal. Ahora, utilice el software de captura de imágenes adecuado para adquirir las imágenes finales de mayor resolución en planos focales secuenciales en incrementos de 2,5 micras para compilar pilas Z. En esta representación, los NPC GFP se observan como azules y los axones YFP dañados se observan como amarillos, la pseudocoloración se puede realizar más tarde utilizando un software de edición y luego realizar un escaneo bidireccional con el desplazamiento de interlaya adecuado para garantizar la cuantificación rápida de cualquier objeto migratorio en la médula espinal, asegurando que la velocidad de fotogramas de adquisición ideal para determinar la velocidad celular dentro de la médula espinal se establezca en aproximadamente 1,7 fotogramas por segundo.

Por último, analice el recorte, la suavidad y el pseudocolor de los archivos de imagen con el software adecuado, y utilice los procesos automatizados para peinar los volúmenes de imágenes consecutivos para producir los vídeos finales de lapso de tiempo. Si bien este protocolo de imágenes de médula espinal explantada se puede utilizar para visualizar cualquier fluorescencia dentro de la médula espinal, estas imágenes demuestran interacciones representativas de las células precursoras neurales de EGFP con los axones de EYFP en una sola pila Z dentro de la médula espinal ventral. La adquisición de Zacks consecutivos se puede compilar para producir videos de lapso de tiempo para analizar la dinámica celular en tiempo real dentro del tejido intacto.

De hecho, el uso de un divisor de haz dicroico de un solo borde de 520 nanómetros y un divisor de haz dicroico de un solo borde de 560 nanómetros puede separar las señales EGFP y EYFP, lo que permite la pseudocoloración de los canales individuales en verde y amarillo con el software de imágenes como se demuestra aquí, Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de la extracción adecuada de la médula espinal del ratón sin un estiramiento excesivo. compresión o corte accidental del tejido nervioso. Con este procedimiento, se pueden obtener imágenes en tiempo real de cualquier combinación de células o axones marcados con fluorescencia para responder preguntas adicionales, incluida la cinética de migración o remielinización bajo diversos tratamientos o afecciones farmacológicas.