Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

El objetivo general de este procedimiento es preparar una suspensión de una sola célula de la piel del ratón para identificar las diferentes poblaciones de células inmunitarias residentes mediante análisis citofluorimétrico para identificar y aislar las diferentes poblaciones de células inmunitarias residentes en la piel. Con esta técnica, los investigadores pueden digerir fácilmente las muestras de diferentes regiones de la piel del ratón sin dañar la superficie de las células inmunitarias.

Para obtener muestras de piel de la oreja de ratón, corte las partes sin pelo de las orejas y use pinzas para separar los lados dorsal y ventral de los órganos. Luego, raspe suavemente el oído interno para eliminar cualquier cartílago restante. Para obtener muestras de trozos de piel, afeitar todo el pelo del animal con una maquinilla, seguido de la aplicación de una loción depilatoria.

Después de unos minutos, limpie la loción y haga un corte vertical en el centro de la espalda del ratón, continuando la incisión a lo largo de los bordes de las áreas afeitadas alrededor del cuerpo del ratón. Usando pinzas para mantener la piel en su lugar mientras separa la muestra con las puntas cerradas y redondeadas de un par de tijeras quirúrgicas o un bisturí, separe suavemente la piel del peritoneo y los músculos de la espalda. A continuación, sumerja la piel en una placa de cultivo celular de 100 mm que contenga 10 ml de PBS helado y utilice pinzas para raspar la grasa subcutánea.

Para obtener una muestra de piel de la cola, corte la cola y use unas tijeras quirúrgicas para hacer un corte vertical desde la base de la cola hasta la punta. Con pinzas, agarre el borde de la incisión en la base de la cola, luego, agarrando el cuerpo de la cola con otro par de pinzas, tire suavemente de la piel hacia la punta. Elimine el exceso de grasa raspando suavemente la muestra de piel.

Se corta el pie del ratón y, a continuación, para obtener una muestra de piel de la almohadilla del pie, utilice unas tijeras quirúrgicas para cortar la piel del pie longitudinalmente desde el tobillo hasta el comienzo de los dedos, teniendo cuidado de evitar cortar ningún pelo. A continuación, agarre los huesos del tobillo con pinzas mientras agarra la piel con el otro y tire de la piel hacia los dedos como cuando se quita un guante. Para etiquetar las células de la piel, para cada muestra, a su vez, transfiera el tejido a una placa de Petri de 35 milímetros que contiene 2 mililitros de cóctel de digestión recién preparado.

Con unas tijeras, picar la muestra en trozos pequeños e incubar los fragmentos de tejido a 37 grados centígrados durante 90 minutos con una o dos sacudidas suaves durante el período de incubación. A continuación, vierta el tejido cutáneo digerido en un colador de células de 70 micras en una placa de Petri de 66 milímetros que contenga 1 mililitro de RPMI 1640 suplementado con FBS por placa. Lave el colador con cinco mililitros de medio fresco y luego use un émbolo de jeringa para exprimir las muestras a través de la malla del colador.

Enjuague el émbolo, el plato y el colador con 20 mililitros de medio fresco y transfiera la suspensión de pañuelos a un tubo cónico de 50 mililitros. Una vez que se hayan procesado todas las muestras, centrifugar las células y volver a suspender los gránulos en 100 microlitros por muestra de dos microgramos por mililitro de anticuerpo bloqueante anti CD16 CD32 en PBS más 1% de FBS. Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados, agregue 100 microlitros de anticuerpo, como se indica en la tabla, a las muestras apropiadas durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz.

Al final de la incubación, lavar las células en un mililitro de PBS más FBS y volver a suspender los pellets en 300 microlitros de FBS PBS. A continuación, etiquete las células con 2 microgramos por mililitro de DAPI durante 10 minutos a cuatro grados centígrados protegidas de la luz. Para aislar los leucocitos, primero hay que controlar la población positiva para DAPI y eliminar las células muertas.

A continuación, seleccione los singletes en un área de dispersión directa mediante un gráfico de ancho de dispersión directa y limite las celdas en función del tamaño y la granularidad de los leucocitos de interés. A continuación, seleccione las células CD45 positivas y, a continuación, identifique para cada muestra las poblaciones de células dendríticas de la piel por su expresión de CD11C y MHC de clase dos. Identificar los macrófagos por su expresión de CD64 y F480, los linfocitos B por su expresión de CD19 y MHC clase dos, y los linfocitos T por la expresión de CD4 o CD8.

El aislamiento de las células inmunitarias de la piel, como se acaba de demostrar, produce una población de más del 50% de células viables de todas las regiones de la piel, de las cuales entre 5.000 y 15.000 por centímetro cuadrado son CD45 positivas. También se puede obtener un número suficiente de células dendríticas, macrófagos, células B y células T para el análisis posterior a partir de un centímetro cuadrado de piel de ratón, como se indica. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo digerir un tejido de piel no inflamado y aislar los leucocitos para el análisis por fax.