Name: Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a preparar suspensiones de células únicas de piel de ratón para análisis citofluorimétrico de poblaciones inmunes residentes. Este método permite identificar linfocitos sin dañar marcadores de superficie.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), la Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 y NANOVAC) y la Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

de aprobación del estudio: Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano (Roma, Italia) de acuerdo con el Decreto Legislativo 27 de Enero de 1992, n. 116 &quot;attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini sperimentali o ad altri Fini scientifici.&quot; 1. Obtención de las muestras de piel <ol><li> La eutanasia el ratón por dislocación cervical. </li><li> Oreja: <ol><li> Cortar la parte sin pelo de las orejas del ratón. </li><li> dorsal separada y parte ventral mediante tracción con fórceps. Eliminar cualquier resto de cartílagos, raspando suavemente la parte interna de las orejas con fórceps. </li></ol></li><li> la piel del tronco: <ol><li> Afeitarse toda la piel del animal, tanto con una máquina de afeitar eléctrica y con la loción depilatoria delicada. </li><li> Cortar la muestra de piel deseado (de 2 cm 2 hasta toda la piel de los animales). <ol><li> Si cortando todo el dorsal y nclusotral de la piel del ratón, haga un corte vertical en el medio del ratón de nuevo y luego se corta a lo largo de las fronteras de las áreas afeitadas de todo el cuerpo del ratón. </li><li> separar suavemente la piel del peritoneo y músculos de la espalda, manteniendo la muestra de piel todavía con el fórceps, mientras que la separación de la muestra de piel con la punta de bordes redondeados cerrado de un tijeras quirúrgicas o un bisturí. </li></ol></li><li> Preparar una placa de cultivo de 100 mm que contiene 10 ml de PBS frío. </li><li> Eliminar la grasa subcutánea sumergiendo la muestra de piel en PBS en la placa preparada en el paso 1.3.3 y raspando la muestra de piel con pinzas. </li></ol></li><li> Cola: <ol><li> Cortar la cola del ratón. </li><li> Hacer un corte vertical en la cola con unas tijeras quirúrgicas o bisturí quirúrgico, a partir de la base de la cola y que llegan hasta la punta de la cola. </li><li> El uso de fórceps para separar la piel de la cola. Agarrar el borde del corte en la base de la cola y tire suavemente hacia la punta, mientras que la celebración de lacuerpo de la cola con unas pinzas. </li><li> Eliminar cualquier exceso de grasa, raspando suavemente la muestra de piel. </li></ol></li><li> Alfombra de pies <ol><li> Cortar todo el pie ratón con tijeras quirúrgicas. Evitar cortar cualquier piel con pelo. </li><li> Cortar la piel del pie longitudinalmente desde el tobillo hasta el comienzo de los dígitos. </li><li> Mantenga los huesos del tobillo con unas pinzas o con la mano, mientras que agarrar la piel con pinzas y tire de la piel hacia los dígitos como si quitándose un guante. </li></ol></li></ol> 2. Digestión <ol><li> Preparar el cóctel de la digestión de la solución madre (preparado como en la Lista de Materiales) con la siguiente receta: Mezcla de Enzimas (ver Lista de Materiales para las especificaciones) 300 g / ml, Dnase1 50 U / ml. Diluir en RPMI 5% de FBS. </li><li> Picar las muestras de piel con tijeras en trozos pequeños en una placa de Petri de 35 mm con 2 ml de digestión de cóctel (Para la piel del tronco: 2 ml de cóctel Digestión cada 2 cm2 de piel, hasta 3 ml en total). </li><li>Se incuba a 37 ° C durante 90 minutos. Agitar suavemente la placa de Petri 1-2 veces durante la incubación. </li><li> Verter muestras de piel digeridos en un colador de 70 micras de células en 66 mm plato de Petri que contiene 1 ml de RPMI1640 5% de FBS. </li><li> Lavar el filtro con 5 ml de RPMI 1640 5% de FBS. </li><li> Exprimir la muestra a través del filtro de células con un émbolo de la jeringa. </li><li> émbolo de color, placa de Petri y el filtro con 20 ml de RPMI1640 FBS al 5%, la transferencia en un tubo de 50 ml. </li></ol> 3. Los anticuerpos y Etiquetado <ol><li> Se lava la suspensión obtenida dos veces con 5 ml de PBS 1% de SFB (o BSA). </li><li> Etiqueta de la suspensión celular obtenida con los anticuerpos deseados. <ol><li> Resuspender las muestras en 100 l / muestra de una mezcla que contiene 2 mg / ml de aCD16 / CD32 (clon 2.4G2) diluido en PBS 1% de FBS. </li><li> Incubar durante 15 min a 4 ° C con el fin de bloquear la unión no específica de los anticuerpos deseados a través de receptores de Fc. </li><li> Añadir los anticuerpos indicados en la tabla1. <ol><li> Preparar una mezcla de diluir los anticuerpos deseados en 100 l / muestra de PBS 1% de FBS a una concentración de 4 mg / ml. </li><li> Añadir 100 ml de la mezcla preparada en la etapa 3.2.3.1 a cada muestra de manera que en el tubo, habrá un volumen de 200 l de mezcla de anticuerpos a una concentración final de 2 mg / ml. </li></ol></li><li> Incubar durante 30 minutos a 4 ° C y la cubierta de la luz. </li></ol></li><li> Lavar con 1 ml de PBS 1% de FBS, de centrifugación durante 5 min a 400 xg, descartar el sobrenadante y resuspender en 300 l de PBS 1% de FBS. </li><li> Añadir DAPI a una concentración final de 2 mg / ml y se incuba a 4 ° C, protegido de la luz durante 10 minutos. </li><li> Analizar las muestras obtenidas por FACS. <ol><li> Con el fin de aislar los leucocitos, utilizar la siguiente estrategia gating: <ol><li> En primer lugar eliminar las células muertas, colocando puertas en la población DAPI-. </li><li> Seleccione singletes en el FSC-A vs. parcela FSC W como se indica en la Figura 1 </strong&gt;. </li><li> Puerta de las células en función del tamaño y la granularidad típico de los leucocitos de interés. </li><li> Seleccionar CD45 + células en el FSC-A parcela CD45 como se indica en la Figura 1. </li></ol></li><li> Distinguir las diferentes poblaciones de leucocitos por la expresión de marcadores de superficie como sigue: <ol><li> Identificar los países en desarrollo como células CD11c + II + MHC. Estos pueden ser analizados después para la expresión de CD207 para distinguir las células de Langerhans y CD207 + dérmica DCs de CD207- dérmica DCs. </li><li> Identificar los macrófagos como células CD64 + F4 / 80 +. </li><li> Identificar las células B como las células CD19 + MHCII +. </li><li> Identificar las células T como CD8 + o células CD4 +. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
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<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Hemos descrito un método para la preparación de suspensiones de una sola célula a partir de diferentes regiones de la piel del ratón. El método de la digestión hemos adoptado, no sólo da altos rendimientos sino que también conserva la expresión de marcadores de superficie, que es fundamental para el posterior análisis de FACS. El uso de un cóctel de colagenasa I y II y termolisina, garantiza lote mínimo a las diferencias de lote en la actividad enzimática haciendo de este método altamente re...

La piel es uno de los órganos más grandes del cuerpo y su gran superficie está continuamente expuesta al entorno externo. Por lo tanto, la piel tiene que proteger al organismo de posibles amenazas para mantener la homeostasis, tanto por medios físicos como proporcionando una protección activa contra la posible entrada de patógenos. De manera similar a la mucosa intestinal y pulmonar, la piel alberga una variedad de células inmunitarias que interactúan continuamente con el epitelio para mantener la vigilancia inmunitaria. Este complejo sistema que involucra tanto a las células inmunitarias como a las no inmunitarias de la piel ha sido reconocido desde los primeros días de la inmunología, cuando en 1978 se acuñó por primera vez el término "tejido linfoide asociado a la piel" (SALT) 1 para describir dicha complejidad. 
El gran número de células inmunitarias que residen en la piel ayuda al organismo no solo a combatir posibles invasiones, sino también a orquestar la cicatrización de heridas y a mantener la tolerancia hacia los autoantígenos y la microbiota cutánea 2,3. 
Entre las células inmunitarias residentes en la piel, las células dendríticas (CD) tienen un papel crucial en la formación de las respuestas inmunitarias y en el mantenimiento de la homeostasis 4. Las células dérmicas DC y las células de Langerhans responden fácilmente a las invasiones de patógenos y, al migrar a los ganglios linfáticos, activan las células T e inducen la expresión de receptores de localización de la piel en las células T efectoras recién generadas 5. Las CD también tienen un papel fundamental en la regulación de la homeostasis de la piel. Las CD que migran de la dermis a los ganglios linfáticos en condiciones homeostáticas transportan antígenos secuestrados de la piel con el propósito de inducir tolerancia a las células T, principalmente a través de la diferenciación de células T reguladoras (Tregs) específicas para los antígenos de la piel 6-8. 
 'jove_content representan la población más abundante de células inmunitarias en la piel. No solo se infiltran en la piel durante una infección, sino que también representan una población estable entre los linfocitos residentes en la piel 9,10. Tanto las células T de memoria (rm) residentes CD8+ como las CD4+ residen en la piel y, después de una infección, pueden responder mucho antes de que las células T efectoras se recluten de la sangre. En la piel, también reside una población de Tregs residentes en el tejido capaces de mantener la tolerancia hacia los antígenos de la piel y la homeostasis de los tejidos. Estas células se activan rápida y potentemente después de la exposición a su antígeno afín y, por lo tanto, se han definido como Tregs de memoria 11,12. 
Junto con las DC y las células T, muchas células inmunitarias innatas, como las células NK, las células T gamma delta, las ILC del grupo 2 13, los mastocitos y los macrófagos, pueblan la piel y contribuyen a la protección del huésped. Para analizar un entorno tan complejo, es obligatorio obtener suspensiones unicelulares a partir de muestras de piel con alta eficiencia y, al mismo tiempo, preservar la expresión de marcadores de superficie para el análisis o clasificación por citoferimetría de flujo. 
La piel murina presenta una capa epidérmica externa, constituida principalmente por queratinocitos, células de Langerhans y células T epidérmicas dendríticas; y la capa dérmica inferior. La dermis alberga la mayoría de las células inmunitarias y está formada por una matriz extracelular en la que las fibras de colágeno son las más abundantes, especialmente el colágeno-I y el colágeno-IV. A diferencia de la piel humana, la piel del ratón está cubierta de pelo y, por lo tanto, está más poblada de folículos pilosos. Es, además, mucho más delgada que la piel humana y contiene una capa muscular, el panículo carnoso, que ayuda a la cicatrización de heridas 14. Estas características hacen que sea más difícil interrumpir de manera eficiente la red de colágeno de la dermis para extraer las células inmunitarias.
En este artículo proporcionamos un método adecuado para digerir la matriz extracelular que se basa en un cóctel de colagenasa 1 y 2 de alta pureza y termolisina. Además, dado que el análisis de la piel de diferentes regiones requiere diferentes procedimientos experimentales, mostraremos diferentes métodos para obtener de manera eficiente muestras de piel de la almohadilla del pie, la cola, la oreja y el tronco. A continuación, etiquetaremos las muestras para evaluar la presencia de DC (MHCII+CD11c+CD45+), macrófagos (CD11b+F4/80+CD45+), linfocitos T CD8+ y CD4+.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>Suplementado RPMI 1640 medio&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 suplementado con L-glu, pen-strep sin beta mercapto etanol</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (Enzyme Mix)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>resuspender [2.5&nbsp; mg/ml] en dH2O; almacenar alícuotas a -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D4263-1VL</td><td>resuspender en RPMI 1640 sin suero [1,000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materiales</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>quirúrgicas</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td></td><td></td><td></td>quirúrgico</tr><tr><td>35 mm Placas</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Petri de 66 mm Placas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>de Petri de 100 mm<td>70 y micro; m Filtros de celdas</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Cóctel de digestión</fuerte></td><td></td><td></td><td>Diluido en RPMI 5% FBS</td></tr><tr><td>LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Clon</fuerte></td><td><fuerte>Etiqueta</fuerte></td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

preparación de suspensiones de una sola célula para el análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

La piel es un órgano barrera que interactúa con el entorno externo. Al estar continuamente expuestas a una posible invasión microbiana, la dermis y la epidermis albergan una variedad de células inmunitarias tanto en condiciones homeostáticas como inflamatorias. Por lo tanto, las herramientas para obtener la liberación de células de la piel para los análisis citofluorimétricos son muy útiles para estudiar la compleja red de células inmunitarias que residen en la piel y su respuesta a los estímulos microbianos. En este trabajo describimos una metodología eficiente para la digestión de la piel de ratón con el fin de obtener suspensiones unicelulares de forma rápida y eficiente. Este protocolo permite mantener la máxima viabilidad celular sin comprometer la expresión de antígenos de superficie. También describimos cómo tomar y digerir muestras de piel de diferentes lugares anatómicas, como la oreja, el tronco, la cola y la almohadilla de la pata. A continuación, las suspensiones obtenidas se tiñen y se analizan mediante citometría de flujo para discriminar entre diferentes poblaciones de leucocitos.

La piel de diferente región del cuerpo se digirió de acuerdo con el protocolo descrito y se tiñeron con los anticuerpos indicados. La estrategia gating se representa en la Figura 1. En primer lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), entonces la puerta en singletes (FSC-A vs. FSC-W) y en células con morfología de linfocitos (FSC frente a SSC-A-A). Cuando esté indicado, se seleccionan las células CD45 + de origen hematopoyético. <p class="jove_conten...

La piel alberga una compleja red de células inmunitarias. Describimos una metodología eficiente para la digestión de piel de ratón, procedente de diferentes partes del cuerpo del animal, con el fin de obtener una suspensión unicelular y analizar las diferentes poblaciones de leucocitos residentes en la piel mediante citometría de flujo.

Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar una suspensión de células individuales a partir de la piel de ratón para identificar las diferentes poblaciones de células inmunitarias residentes mediante análisis citofluorimétrico, con el fin de identificar y aislar las distintas poblaciones de células inmunitarias residentes en la piel. Mediante esta técnica, los investigadores pueden digerir fácilmente muestras de distintas regiones de la piel de ratón sin dañar los marcadores superficiales de las células inmunitarias de interés.Para obtener muestras de piel de la oreja del ratón, corte las partes sin pelo de las orejas y use pinzas para separar los lados dorsal y ventral de los órganos. Luego, raspe suavemente el interior de la oreja para eliminar cualquier cartílago residual. Para obtener muestras de piel en trozos, afeite todo el pelo del animal con una máquina cortapelos, seguido de la aplicación de una loción depilatoria.Tras unos minutos, retire la loción y realice un corte vertical en el centro de la espalda del ratón, continuando la incisión a lo largo de los bordes de las áreas afeitadas alrededor del cuerpo del animal. Utilice pinzas para sostener la piel en su lugar mientras separa la muestra con las puntas cerradas y redondeadas de un par de tijeras quirúrgicas o un escalpelo, y separe suavemente la piel del peritoneo y de los músculos de la espalda. A continuación, sumerja la piel en una placa de cultivo celular de 100 mm que contenga 10 ml de PBS frío con hielo y use pinzas para raspar la grasa subcutánea.Para obtener una muestra de piel de la cola, corte la cola y use tijeras quirúrgicas para hacer un corte vertical comenzando desde la base de la cola hasta la punta. Usando pinzas, tome el borde de la incisión en la base de la cola; luego, sujetando el cuerpo de la cola con otro par de pinzas, tire suavemente de la piel hacia la punta. Retire cualquier grasa excesiva raspando suavemente la muestra de piel.Se corta el pie del ratón y, a continuación, para obtener una muestra de piel de la almohadilla del pie, se utilizan tijeras quirúrgicas para cortar longitudinalmente la piel del pie desde el tobillo hasta el inicio de los dedos, teniendo cuidado de evitar cortar cualquier vello. Luego se sujetan los huesos del tobillo con pinzas mientras se agarra la piel con la otra mano y se tira de ella hacia los dedos, como si se quitara un guante. Para etiquetar las células de la piel, transfiera cada muestra sucesivamente a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga 2 mililitros de una mezcla de digestión recién preparada.Con tijeras, corte la muestra en trozos pequeños e incube los fragmentos de tejido a 37 grados celsius durante 90 minutos, con uno o dos agitados suaves durante el período de incubación. A continuación, vierta el tejido cutáneo digerido sobre un filtro celular de 70 micrones en una placa de Petri de 66 milímetros que contenga 1 mililitro de RPMI 1640 suplementado con FBS por placa. Lave el filtro con cinco mililitros de medio fresco y luego use el émbolo de una jeringa para pasar las muestras a través de la malla del filtro.Lave el émbolo, el recipiente y el colador con 20 mililitros de medio fresco y transfiera la suspensión de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros. Una vez que se hayan procesado todas las muestras, centrifugue las células y re-suspenda los pellets en 100 microlitros por muestra de dos microgramos por mililitro de anticuerpo bloqueante anti-CD16/CD32 en PBS más 1% de FBS. Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados, agregue 100 microlitros de anticuerpo según lo indicado en la tabla a las muestras correspondientes durante 30 minutos a cuatro grados centígrados protegidas de la luz.Al final de la incubación, lave las células con un mililitro de PBS más FBS y re-suspenda los pellet en 300 microlitros de PBS con FBS. A continuación, marque las células con 2 microgramos por mililitro de DAPI durante 10 minutos a cuatro grados centígrados protegidas de la luz. Para aislar los leucocitos, primero seleccione la población positiva para DAPI con el fin de eliminar las células muertas.Luego, seleccione los eventos simples en un área de dispersión directa mediante un gráfico de anchura de dispersión directa y delimite las células según el tamaño y la granularidad de los leucocitos de interés. A continuación, seleccione las células positivas para CD45 y, para cada muestra, identifique las poblaciones de células dendríticas de la piel por su expresión de CD11C y de la clase II del MHC. Identifique los macrófagos por su expresión de CD64 y F480, las células B por su expresión de CD19 y de la clase II del MHC, y las células T por su expresión de CD4 o CD8.El aislamiento de células inmunitarias de la piel, tal como se acaba de demostrar, produce una población con más del 50 % de viabilidad procedente de todas las regiones de la piel, entre 5.000 y 15.000 por centímetro cuadrado, de las cuales son positivas para CD45. También es posible obtener un número suficiente de células dendríticas, macrófagos, células B y células T para análisis posteriores a partir de un centímetro cuadrado de piel de ratón, como se indica. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo digerir un tejido cutáneo no inflamado y aislar los leucocitos para análisis por citometría de flujo.

preparation-single-cell-suspensions-for-cytofluorimetric-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Cáncer de fibroblastos asociados (CAF) facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación, la angiogénesis y la inflamación. Aquí se describe un método para aislar poblaciones puras de los fibroblastos normales y CAFS de ratón fresco y tejidos humanos por clasificación de células, usando PDGFR como un marcador de superficie.

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

Este video describe el método rápido para aislar y cultivar los melanocitos y fibroblastos simultáneamente de la piel de la cría de ratón postnatal. Estas células se pueden mantener y manipular in vitro para estudiar la biología de las células de la piel, la cicatrización de heridas y el melanoma.

Cultivo rápido de melanocitos y fibroblastos murinos primarios: aislamiento de melanocitos y fibroblastos de muestras de piel murina completa

El video muestra la preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de un tejido cerebral murino. Implica la digestión enzimática para liberar células del tejido cerebral, seguida de la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las células inmunitarias en función de sus densidades para obtener la suspensión unicelular.

Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

Describimos un protocolo para aislar eficientemente las células T residentes en la piel de biopsias de piel humana. Este protocolo proporciona un número suficiente de linfocitos residentes viables en la piel humana para el análisis de citometría de flujo y el cultivo ex vivo.

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Un modelo ideal para estudiar la biología de las células madre adultas es el folículo piloso del ratón. En este trabajo se presenta un protocolo para aislar diferentes poblaciones de células madre de folículos pilosos y queratinocitos epidérmicos, empleando la digestión enzimática de la piel dorsal del ratón seguida de un análisis FACS.

El aislamiento de células madre del folículo piloso y queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratón

Este informe describe un protocolo cúbico a aclarar las biopsias de espesor completo de piel de ratón, y visualizar los patrones de expresión de proteínas, células proliferantes, y sebocitos en la resolución de una sola célula en 3D. Este método permite una evaluación precisa de la anatomía y la patología de la piel y de los fenotipos anormales en la epidermis líneas de ratones modificados genéticamente.

Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

Este protocolo describe cómo aislar los queratinocitos de la piel de los modelos de ratón, para manchar con anticuerpos etiquetados con metal, y analizar las células manchadas por citometría de masa para perfilar el patrón de expresión de proteínas de interés en las diferentes fases del ciclo celular.

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&amp;RUN).

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Describimos protocolos para la preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.

Preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y tinción de moléculas intracelulares para análisis citométrico de flujo

Este protocolo presenta un método detallado para aislar suspensiones unicelulares de alta calidad tanto de tejido pulmonar murino sano como tumoral. Este protocolo puede aplicarse a scRNA-seq, análisis de citometría de flujo y aislamiento de células primarias.

Preparación optimizada de tejido pulmonar completo con tumores de murino para citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular

Aprende a preparar suspensiones de células únicas de piel de ratón para análisis citofluorimétrico de poblaciones inmunes residentes. Este método permite identificar linfocitos sin dañar marcadores de superficie.

Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

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