Name: Trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a trasplantar células musculares normales y malignas en pez cebra adulto inmunodeprimido rag2. Este método permite analizar la regeneración muscular y la biología tumoral in vivo.

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Este trabajo es apoyado por Alex Limonada Foundation (LMD), la Sociedad Americana del Cáncer (LMD), el MGH Howard Goodman Fellowship (LMD), y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R24OD016761 y 1R01CA154923 (DML). CNY Citometría de Flujo y Análisis de Flujo de imagen, instrumentación compartida número de concesión 1S10RR023440-01A1. IMT es financiado por una beca de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (Fundação para a Ciência e Tecnologia - FCT). QT es financiado por el Consejo de Becas de China. Damos las gracias a Angela Volorio por sus valiosos comentarios y consejos.

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Hospital General de Massachusetts Subcomité de Investigación Animal Care, bajo protocolo # 2011N000127. Sección 1. músculo esquelético Trasplante de células en rag2 Adulto E450fs Homocigótica pez cebra mutante 1. Preparación de adultos de pez cebra donantes células del músculo esquelético <ol><li> Obtener adultos de pez cebra transgénico que han marcado con fluorescencia muscular. En este experimento, 30 α-actina de pescado donante-RFP 25 se utilizaron para trasplantar 1 x 10 6 células por pez destinatario. </li><li> Sacrificio de pez cebra de donantes en 1,6 mg / ml tricaína metanosulfonato (MS222) durante 10 min o hasta que no hay movimiento opérculo es evidente. </li><li> Coloque el pescado donante en una toalla de papel absorbente y los impuestos especiales del músculo dorsal usando una hoja de afeitar limpia. El corte debe hacerse cerca del ano en un ángulo de 45 ° para maximizar la recogida de tejidos (como se indica en la Figura 1A </strong&gt;). Coloque el tejido diseccionado en un lugar limpio 10 cm placa de Petri. </li><li> Añadir 500 l tampón de suspensión (0.9x pre-enfriada de tampón fosfato salino (PBS) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS)) para el tejido diseccionado. Hasta el 10 de pez cebra donante se pueden colocar juntos en este volumen. </li><li> Picar el tejido con una cuchilla de afeitar&gt; 20 veces hasta que las células están en una suspensión uniforme. La musculatura dorsal entero se homogeneiza incluyendo la piel, los huesos y las aletas. Añadir 2 ml de tampón de suspensión. Usando una pipeta de 5 ml, se tritura la suspensión celular ≥20 veces para disociar las células. </li><li> Se filtra la suspensión celular a través de un colador de malla 40 micras en un tubo cónico de 50 ml se colocó en hielo. </li><li> Lavar la placa de Petri con un adicional de 2,5 ml de tampón de suspensión para recoger el tejido restante y filtrar a través de la misma filtro y tubo cónico, a un volumen final de 5 ml (10 peces donante puede ser utilizado por aislamiento). NOTA: la piel, los huesos y aletas serán excluidos después de la filtración. </li&gt; <li> Si procede, se combinan suspensiones similares en el mismo tubo cónico. </li><li> Cuente el número total de células viables utilizando colorante azul de tripano y un hemocitómetro. </li><li> Reserva 500 l para citometría de flujo, si se desea (opcional, paso 2). </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 1000 xg, durante 10 min, a 4 ° C. </li><li> Deseche las células sobrenadante y resuspender en 3,33 x 10 5 células / l (0.9x PBS + 5% FBS). En total, 3 l se inyectará por pez destinatario para un total de 1 x 10 6 células por destinatario (paso 3). NOTA: Menos de 3 l de suspensión celular deben ser trasplantados a los peces receptor. Si el número de células es limitante, tan bajos como 5 x 10 4 células por beneficiario puede llevar a éxito del injerto (Tabla 1). </li></ol> 2. Análisis de citometría de flujo de Donantes del esqueleto de la célula muscular Preparación (Opcional) <ol><li> Aislar muscular de un tipo salvaje, pescado no transgénica como se indica in paso 1.1. Esta muestra sirve como el control negativo y es útil para configurar puertas citometría de flujo. </li><li> Añadir un colorante de viabilidad apropiado. Por ejemplo, añadir 5 l de solución de DAPI (500 ng / l) a 500 l de preparación muscular. Vortex ligeramente antes del análisis. Adquirir 5 x 10 03 al 01 x 10 4 eventos. Analizar las muestras de control de tipo salvaje primero para colocar puertas seguido por análisis de las células musculares aisladas de peces transgénicos. NOTA: citometría de flujo análisis se realiza generalmente dentro de 1 hora después de la disección del tejido muscular, tiempo durante el cual las células disecadas retienen más de 60% ​​de viabilidad (Figura 2). Las células deben mantenerse en hielo en todo momento. La viabilidad celular total puede ser re-evaluado antes del trasplante utilizando colorante azul de tripano y un hemocitómetro. </li></ol> 3. intramuscular El trasplante de células del músculo esquelético en rag2 Adulto Homocigótica pez cebra mutante <ol><li> Limpie a 10 μ; L 26S G micro-jeringa por el dibujo en y expulsar solución de lejía al 10% (5 veces), seguido por etanol al 70% (5 veces), y luego seguido por tampón de suspensión (0.9x PBS + 5% FBS, 10 veces). </li><li> Anestesiar 2-4 meses de edad homocigotos peces mutantes rag2 o pescado tipo de destinatario salvaje (como controles) añadiendo gotas individuales de metanosulfonato tricaína (MS222, 4 mg / ml solución madre) en una placa de Petri que contiene el pez en el agua del sistema hasta que los movimientos lentos opérculo y el pescado son todavía. NOTA: Dosis de la anestesia tricaína dependerá de la edad y tamaño del pez cebra destinatario. </li><li> Coloque el pez cebra destinatario anestesiado sobre una toalla de papel húmedo o una esponja, con el lado izquierdo hacia arriba. </li><li> Insertar la aguja de la jeringa en la musculatura latero-dorsal (refiérase a la Figura 1A). Asegúrese de que las inyecciones se realizan en un ángulo de 45 °. Inyectar 3 l de la suspensión celular (preparado en la etapa 1.12) por pez para un total de 1 x 10 6 células por receptor.</li><li> Transferir cuidadosamente el pez cebra se inyecta en un tanque limpio usando una cuchara de plástico para recuperarse. </li><li> Evaluar el pez cebra destinatario para las tasas de injerto a los 10, 20, 30 días después del trasplante por imágenes peces anestesiados bajo campo claro y microscopía de epifluorescencia. </li></ol> Sección 2. Rabdomiosarcoma embrionario (SGDEA) Trasplante en adultos Homocigótica rag2 pez cebra mutante 4. ADN microinyección de embriones de pez cebra <ol><li> Linealizar el plásmido rag2-kRASG12D 7 digiriendo 10 g de ADN con XhoI, a 37 ° C durante 6 horas o O / N. </li><li> Se purifica el ADN con fenol estándar: extracción con cloroformo y precipitar con etanol. Resuspender en 20 l de agua desionizada (alternativamente, columnas de purificación de fragmentos de ADN comerciales pueden ser utilizados). </li><li> Ejecutar el ADN no digerido y digerido en un gel de agarosa al 1% y determinar la concentración de ADN bespectrómetro de lectura y. Alternativamente, ejecute muestras a 1: 1, 1: 5, 01:10 y diluciones en un gel de agarosa al 1% y cuantificar en comparación con una escalera de ADN. </li><li> Preparar una mezcla de inyección a una concentración final de 15 ng / l de ADN rag2-kRASG12D digerido en 0.1 M KCl y 0,5x Tris-EDTA. La cantidad final de ADN se inyecta en 2 nl de volumen de inyección será 30 pg. NOTA: Hasta tres construcciones de ADN diferentes pueden ser eficientemente co-inyectados en un máximo de 60 pg de ADN por embrión. Estos transgenes se integran en el genoma y co-expresados ​​en el tumor en desarrollo 26. </li><li> Inyectar linealizado rag2-kRASG12D en embriones etapa de células esencialmente como se describe 27 en una cepa de pez cebra de interés (Figura 1B). Las inyecciones se deben realizar en la célula y no en la yema de huevo para una mayor eficiencia. En este experimento, un transgénico AB-doble cepa; myf5-GFP, se utilizó mylpfa-mCherry. Levante pez cebra mediante la cría estándar protocols 28. NOTA: la supervivencia de inyección es a menudo depende de la cepa utilizada pez cebra. En promedio, 30% de los embriones inyectados desarrollará SGDEA. 300-600 embriones deben ser inyectados por experimento con el fin de garantizar que los tumores primarios suficientes GFP-positivas y mCherry-positivos se generan para el trasplante y el análisis. </li></ol> 5. Detección del SGDEA primarias en pez cebra larvas <ol><li> Observe el pez cebra inyectado desde 10 a 30 días después de la inyección para el surgimiento de SGDEA primarias visibles externamente. </li><li> A los 30 días después de la inyección, anestesiar pez cebra destinatario añadiendo gotas individuales de metanosulfonato tricaína (MS222 4 mg solución / ml) en una placa de Petri que contiene agua del sistema pescado hasta movimientos opérculo lento y el pescado son todavía. NOTA: Dosis de la anestesia tricaína dependerá de la edad y tamaño del pez cebra destinatario. Pez cebra con tumores primarios requieren dosis más bajas de tricaína. </li><li> Seleccione SGDEA portadora primariapeces que son myf5-GFP -positivo y mylpfa-mCherry -positivo, utilizando un microscopio de epifluorescencia. </li></ol> 6. SGDEA Tumor Preparación <ol><li> Sacrificar el pez cebra SGDEA-cojinete primaria seleccionada en 1,6 mg / ml tricaína metanosulfonato (MS222) durante 10 min o hasta que no hay movimiento opérculo es evidente. </li><li> Procesar cada pez cebra portadores de tumor por separado. Coloque el pescado en un plato de Petri limpia y diseccionar alrededor del tumor utilizando una hoja de afeitar y unas pinzas finas (como se muestra en la Figura 1B). Transferir el tejido tumoral diseccionado a una placa de Petri limpia. </li><li> Añadir 100 l de 0.9x pre-enfriada de tampón fosfato salino (PBS) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS). Tejido Pique con una hoja de afeitar limpia&gt; 20 veces hasta que las células se encuentran en una suspensión uniforme. </li><li> Añadir 900 l de la misma solución tampón (0.9x PBS + 5% FBS), pipeta hacia arriba y abajo varias veces para disociar las células utilizando un 1000 l filtrados punta de la pipeta. Filtrar con un 40 &amp;# 956; m colador de malla en el tubo cónico de 50 ml correspondiente. Almacenar en hielo. </li><li> Lavar la placa de Petri con un adicional de 2-4 ml de tampón, y pasar a través del mismo filtro de malla y dentro del tubo cónico correspondiente. </li><li> Centrifugar a 1000 xg, durante 10 min, a 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender en 100 l de tampón. </li><li> Cuente el número total de células viables utilizando colorante azul de tripano y un hemocitómetro. </li><li> Diluir las células a la concentración deseada en el mismo tampón (0.9x PBS + 5% FBS). Las células deben diluirse a 5 x 10 3 células / l para el trasplante 5 l por pez cebra destinatario en un total de 2,5 x 10 4 células por destinatario. </li><li> Análisis de citometría de flujo también se puede realizar con una pequeña cantidad de la suspensión de la etapa 6.5 para cuantificar las proporciones relativas de células fluorescentes en la muestra. NOTA: Dejar de lado 100 l de suspensión celular (después de filtración en el paso 3.5) y diluir con 400 lde 0.9x PBS + 5% FBS tampón de suspensión para el análisis de citometría de flujo. Para asegurar la selección adecuada, realizar análisis adicionales utilizando tejido tumoral transgénico sola o músculo aislado de tipo salvaje adulto, myf5-GFP y pescado mylpfa-mCherry. Realizar Citometría de Flujo esencialmente como se describe en el paso 2 de la sección 1. </li></ol> 7. El trasplante de SGDEA en adultos rag2 Homocigótica pez cebra mutante <ol><li> Limpiar a 10 l 26S G micro-jeringa por el dibujo en y expulsar 10% de solución de lejía (5 veces), seguido por etanol al 70% (5 veces), y luego seguido por tampón de suspensión (0.9x PBS + 5% FBS, 10 veces ). </li><li> Anestesiar destinatario homocigotos peces mutantes rag2 añadiendo gotas individuales de metanosulfonato tricaína (MS222 4 mg solución madre / ml) en una placa de Petri que contiene el pez en el agua del sistema hasta los movimientos opérculo son lentos y el pescado son todavía. </li><li> Coloque el pez cebra destinatario anestesiado sobre una toalla de papel húmeda o spoENS, con la parte ventral hacia arriba. </li><li> Inyectar 5 l de la suspensión celular en la cavidad peritoneal (2,5 x 10 4 células por recipiente). NOTA: La aguja de inyección se debe limpiar entre las inyecciones de diferentes tumores como se describe en el paso 4.1. 5 a 10 l pueden ser trasplantados de manera eficiente por vía intraperitoneal, dependiendo de receptor tamaño del pescado. El injerto del tumor se puede lograr mediante la inyección de 1 x 04 al 05 octubre x 10 5 células no clasificadas por pez receptor (Tabla 1). </li><li> Con cuidado, coloque el pez cebra destinatario en un tanque limpio con una cuchara de plástico. </li><li> Evaluar el pez cebra destinatario para las tasas de injerto a los 10, 20, 30 días después del trasplante por imágenes peces anestesiados bajo campo claro y microscopía de epifluorescencia. </li><li> Utilizar peces implantada para aplicaciones posteriores, incluyendo clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para evaluar el estado de diferenciación (Figura 3H), Analy histológico estándarsis (Figura 3F), las respuestas de terapia de imagen 15, y / o trasplante de serie enfoques incluyendo análisis de dilución limitante 11. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Injerto eficiente y robusto del músculo esquelético dorsal adulta se alcanza con un método muy simple preparación de células seguido de la inyección de las células en la musculatura dorsal de rag2 peces mutantes homocigotos. En general, los procedimientos de inyección intramuscular fueron muy robusto, con un poco de muerte asociado inmediatamente después del procedimiento de implantación, que van desde 10% a 35% dependiendo del experimento. Optimización adicional que se centrará en la utilización de agujas de calibre más pequeños para inyección y desarrollo de aparato de inyección estacionario utilizando un microscopio y micromanipulador, lo que facilitará la facilidad de la implantación de células. Nuestro enfoque también utiliza células musculares sin ordenar de animales donantes y sólo contenía aproximadamente 30% de células progenitoras de músculo. El uso de líneas transgénicas reportero que etiquetan las células madre y el aislamiento FACS probablemente proporcionar suspensiones de células enriquecidas que conducen a un aumento de injerto en peces destinatario. Esquelético muscular cells también podría ser enriquecido y se cultivaron antes del trasplante, como se describió anteriormente 29. Sorprendentemente, nuestros resultados también indican que las etapas de establecimiento de nicho y la diferenciación del tejido muscular de los donantes se producen antes de 10 días después del trasplante, el establecimiento de este modelo como una plataforma experimental robusto y rápido para evaluar el injerto y la regeneración muscular. Por otra parte, estos experimentos contrastan fuertemente con las realizadas en ratones, donde se requiere antes de la lesión del músculo con cardiotoxina o bario cloruro de dos días antes del injerto 30,31. Es probable que el daño de la aguja producida durante el procedimiento de trasplante potencia el injerto mediante la estimulación de la producción de un entorno regenerativo en el animal receptor 32,33. También Prevemos que nuestro método se adapta fácilmente a el trasplante de tejido de músculo esquelético de pez cebra más joven, lo que permite la evaluación de mutaciones genéticas que afectan al desarrollo del músculo esquelético tempranopero llevar a la letalidad a los estadios larvarios. También hemos proporcionado un protocolo detallado para el injerto de SGDEA pez cebra mediante inyección intraperitoneal en, rag2 peces mutantes no condicionado homocigotos. Este enfoque era útil para la expansión de los tumores primarios transgénicos dobles sin la necesidad de generar tumores dentro de una línea transgénica singénico. Nuestro trabajo reciente ha demostrado que los enfoques de trasplante de células proporcionan nuevos modelos experimentales para evaluar la sensibilidad de drogas SGDEA in vivo, donde un solo tumor se puede ampliar en miles de animales y evaluado por sus efectos sobre el crecimiento, la auto-renovación, y neovascularización 15. Además, hemos incorporado con éxito una amplia gama de tumores en rag2 peces mutantes homocigotos incluyendo células T leucemia linfoblástica aguda, el melanoma y SGDEA 23. Mirando hacia el futuro, prevemos estas líneas serán de utilidad para la evaluación de las propiedades funcionales importantes de cáncer envivo incluyendo la evaluación de la heterogeneidad intra-tumoral, invasión, metástasis, angiogénesis, y resistencia a la terapia. Por otra parte, la generación de rag2 homocigoto mutante de pescado en el ópticamente transparente Casper pez cebra cepa 34 probable facilitará formación directa de imágenes de muchas de estas características del cáncer. En total, ofrecemos protocolos detallados para el éxito del injerto de músculo esquelético marcado con fluorescencia normal y maligno en a rag2 adultos homocigotos inmune pez cebra mutante comprometido.

El pez cebra son un excelente modelo para estudios de regeneración, ya que pueden regenerar aletas amputados, así como un cerebro dañado, retina, médula espinal, corazón, músculo esquelético y otros tejidos 1. De células madre y regenerativas estudios en adultos de pez cebra se han centrado en gran medida en la caracterización de la regeneración en respuesta a una lesión, mientras que la identificación de las células madre y progenitoras de diversos tejidos de trasplante de células sólo recientemente se ha explorado 2. El pez cebra también se han convertido en cada vez más utilizado para el estudio del cáncer a través de la generación de modelos de cáncer de transgénicos que imitan la enfermedad humana 3-10. En el caso del cáncer, los enfoques de trasplante de células se han vuelto ampliamente adoptado y permitir la evaluación dinámica de los procesos de cáncer importantes, incluyendo la auto-renovación 11, la heterogeneidad funcional 12,13, neovascularización 14, la proliferación,respuestas de terapia 15, y la invasión 16,17. Sin embargo, las células injertadas a menudo son rechazadas de peces receptores debido a la acogida defensas inmunitarias que atacan y matan el injerto 18. Varios métodos se han utilizado para superar el rechazo de las células injertadas. Por ejemplo, los animales receptores del sistema inmune pueden ser transitoriamente ablación por una baja dosis de irradiación gamma antes del trasplante 18,19. Sin embargo, el sistema inmune del destinatario se recuperará por 20 días después de la irradiación y matar a las células del donante 18. Alternativamente, el tratamiento de dexametasona se ha utilizado para suprimir la función de las células T y B, proporcionando más tiempo de supresión inmune acondicionado y facilitar el injerto de una amplia gama de tumores humanos de hasta 30 días 14. Estos experimentos requieren la dosificación del fármaco constante y se limitan al estudio de los tumores sólidos. Ensayos de injerto a largo plazo han utilizado líneas singénicas genéticamente idénticos 20 a 22, en donde el donante y recipicélulas tes son inmunes emparejado. Sin embargo, estos modelos requieren líneas transgénicas de interés que se cruzaron en el fondo singénica durante más de cuatro generaciones para producir líneas totalmente singénicas. Para obviar los problemas de rechazo inmunológico en los peces receptor, nuestro grupo ha desarrollado recientemente un comprometida rag2 E450fs homocigotos mutantes de línea (ZFIN designación alelo rag2 FB101) que han reducido la función de células T y B y que permiten el injerto de una amplia gama de tejidos 23 inmunológico. Modelos de ratón inmunocomprometidos similares se han utilizado ampliamente para el trasplante de células de ratón y de 24 tejidos humanos. Aquí, se presentan métodos para el trasplante del músculo esquelético y rabdomiosarcoma embrionario (ERMS), un sarcoma pediátrico que comparte características con el músculo esquelético, en el rag2 recién descrito homocigotos pez cebra mutante. La disponibilidad de un pez cebra adultos inmune comprometidoamplía nuestra capacidad para llevar a cabo estudios de trasplante de células a gran escala para visualizar directamente y evaluar células madre auto-renovación dentro de los tejidos normales y malignos. Con este método, la etiqueta fluorescente preparaciones de células del músculo adulto de α-actina-RFP 25 pez cebra transgénico injertar robustamente en rag2 pez cebra mutante homocigótica después de la inyección en la musculatura dorsal. Por otra parte, se demuestra el injerto y la expansión de GFP myf5 primaria; mylpfa- mCherry SGDEA transgénicos después de la inyección intraperitoneal en rag2 E450fs homocigotos pez cebra mutante. La utilidad de estos protocolos va más allá de los ejemplos que se muestran y se puede aplicar fácilmente a los tejidos regenerativos de pez cebra adicionales y cánceres.

<table><tbody><tr><td>Solución tampón Tris-EDTA 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283-100ML</td><td>Microinyección. Mezcla de inyección.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Science Education</td><td>S77375-1</td><td>Microinyección. Mezcla de inyección.</td></tr><tr><td>Enzima de restricción XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Microinyección. Linealización de plásmidos.</td></tr><tr><td>Kit de purificación QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104 (50) o 28106 (250)</td><td>Microinyección. Para la purificación de plásmidos linealizados hasta 10 kb.</td></tr><tr><td>Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico</td><td>Microinyección de Fisher Scientific</td><td>BP1753I-100</td><td>. Para la purificación de plásmidos linealizados.</td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura, 500&nbsp; g</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Microinyección. Cuantificación lineal de plásmidos.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx</td><td>Microinyección. Cuantificación lineal de plásmidos.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>citometría de flujo/FACS</td></tr><tr><td>5 ml tubo de poliestireno de fondo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td>tubo de recolección de citometría</td></tr><tr><td>de flujo BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>Programa de productos de investigación de pedido especial (SORP)</td><td>FACS</td></tr><tr><td>5 ml tubo de fondo redondo de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Tubo de recolección FACS</td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td>Programa de productos de investigación de pedido especial (SORP)</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Omega Scientific</td><td>Trasplante FB-01</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonato de tricaína (MS-222)</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html</td><td>Trasplante. Anestésico. Precaución: Irritante. Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel.</td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes de banco VWR</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td>Trasplante. Se pueden usar toallas de papel o esponjas regulares como alternativa.</td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar industriales Singe Edge</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>placa de Petri de trasplante</td></tr><tr><td>, poliestireno Desechable estéril</td><td>VWR</td><td>25384-302 filtro de</td> células de <td>trasplante</td></tr><tr><td>, 40 y micro; m Nylon</td><td>Falcon-Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>50 ml Tubo de centrífuga</td><td>Corning Incorporated</td><td>430828</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>Tinción azul de tripán (0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>Juego de hemacitómetro&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>jeringa Hamilton, aguja fija, volumen 10 y micro; l, tamaño de aguja 26s ga (punta bisel)</td><td>Trasplante Hamilton</td><td>80366</td><td></td></tr><tr><td>Lejía A-1 de Austin, trasplante comercial</td><td>de James Austin Company</td><td></td><td>. Se puede utilizar cualquier solución comercial.</td></tr><tr><td>Etanol 190 Proof Decon Labs</td><td>, Inc.</td><td>DSP-MD.43</td><td>Microinyección (purificación lineal de plásmidos) y trasplante. Cualquier comercial&nbsp; se puede utilizar la solución.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de alta velocidad, microcentrífuga digital 300D</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C0265-24</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004539&nbsp;</td><td>trasplante. Número de catálogo para 120 V, 60 Hz (EE. UU.).</td></tr><tr><td>5 ml pipetas serológicas</td><td>BD Falcon</td><td>357529</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>Corning Stripettor Plus Pipeteo Controlador</td><td>Corning Incorporated</td><td>4090</td><td>Transplantation. Se puede utilizar cualquier controlador de pipeteo automático.</td></tr><tr>Guantes <td></td><td></td><td>de examen sin polvo</td><td>Todos los pasos. Se puede utilizar cualquier marca comercial.</td></tr><tr><td>Filtre las puntas de las pipetas y las micropipetas</td> en todos los <td></td><td></td><td>pasos. Se puede utilizar cualquier marca comercial.</td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11205-20</td><td>trasplante</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico fluorescente</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Puntuación. Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico fluorescente adecuado.</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus DP72 cámara digital</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>Scoring. Se pueden utilizar varias cámaras adecuadas para el sistema de imagen seleccionado.</td></tr></tbody></table>

trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

El pez cebra se han convertido en una herramienta poderosa para evaluar el desarrollo, la regeneración, y el cáncer. Más recientemente, los protocolos de trasplante de células de aloinjerto se han desarrollado que el injerto permiso de células normales y malignas en irradiado, singénico, y adultos de pez cebra inmune comprometido. Estos modelos cuando junto con los protocolos de trasplante de células optimizados permiten la rápida evaluación de la función de células madre, la regeneración después de una lesión, y el cáncer. A continuación, presentamos un método para el trasplante de células de pez cebra adultos músculo esquelético y rabdomiosarcoma embrionario (SGDEA), un sarcoma pediátrico que comparte características con el músculo embrionario, en inmunológico comprometido adulto rag2 E450fs homocigotos pez cebra mutante. Es importante destacar que estos animales carecen de células T y han reducido la función de células B, facilitar el injerto de una amplia gama de tejidos de animales donantes no relacionados. Nuestros protocolos optimizados muestran que marcaron fluorescentemente prepar célula muscularciones de pez cebra transgénico α-actina-RFP injertan robusta cuando se implanta en la musculatura dorsal de rag2 peces mutantes homocigotos. También demostramos injerto de SGDEA fluorescentes transgénico donde la fluorescencia se limita a las células basadas en el estado de diferenciación. Específicamente, SGDEA se crearon en AB-deformación myf5-GFP; mylpfa-mCherry animales transgénicos dobles y tumores inyectados en el peritoneo de peces adultos inmune comprometido. La utilidad de estos protocolos se extiende a injerto de una amplia gama de células normales y malignas donantes que se puede implantar en la musculatura dorsal o el peritoneo de adultos de pez cebra.

Un procedimiento para la preparación y el trasplante de células del músculo esquelético de los donantes transgénicos α-actina-RFP en inmunológico comprometido homocigotos pez cebra mutante rag2 se ha demostrado (sección Protocolo 1, la Figura 1A y Figura 2). Tejido muscular esquelético se preparó a partir donantes transgénicas α-actina-RFP y la suspensión de una sola célula resultante contenía 84,3% de células viables como se evaluó mediante exclusión DAPI siguiente análisis de citometría de flujo (Figura 2B). RFP-células positivas comprendían 35,3% de esta suspensión de células individuales (Figura 2C). El trasplante de células en el músculo esquelético dorsal de rag2 peces receptores homocigotos mutantes llevó al injerto consistente y fuerte según la evaluación de la diferenciación de las células individuales en fibras multinucleadas (1 x 10 6 células inyectadas por pez, Tabla 1, Figura 2D-I). Wild tipobeneficiario los peces no se injertan las fibras musculares durante el experimento de 30 días (n = 13). A los 10 días después del trasplante, 9 de cada 14 rag2 homocigotos pez cebra mutante contenía fibras musculares RFP-positivo cerca del sitio de la inyección (64,3%, Figura 2E, F). Es importante destacar que, músculo RFP-positivo injertado persistió a 30 días post-trasplante (Figura 2G-I), con un subconjunto de animales que se seguido por 115 días post-injerto y exhibiendo el injerto muscular robusto y persistente (datos no mostrados). Estos resultados son similares a los reportados previamente por nuestro grupo 23 utilizando el mismo protocolo (Tabla 1). También hemos presentado un método para la generación, la preparación y el trasplante de células tumorales SGDEA en la cavidad peritoneal de los peces receptor rag2 homocigotos mutantes (Sección Protocolo 2, Figura 1B y la Figura 3). SGDEA se generaron en double transgénico myf5-GFP; pescado mylpfa-mCherry que se han mostrado para permitir la visualización de la heterogeneidad intra-tumoral y el análisis funcional de las subpoblaciones de células tumorales después del trasplante 11. Sin embargo, una mayor caracterización molecular de cada subpoblación es difícil porque los peces son pequeños cuando se desarrollan SGDEA entre 10 a 30 días de vida y el número de células tumorales son limitante para aplicaciones posteriores. Una solución es ampliar el número de células tumorales injertando SGDEA en pez cebra receptor adulto. Hasta la fecha, los experimentos similares se han completado usando CG1-deformación peces singénico y requerida en exceso de 4 generaciones de retrocruzamiento para desarrollar líneas singénicos que eran transgénicos para myf5-GFP; mylpfa-mCherry. Para evitar estos problemas, hemos demostrado la utilidad de rag2 comprometida homocigotos pez cebra receptor mutante inmune a injertarse SGDEA primarias de un pez cebra AB-deformación. Todos SGDEA primarios injertados en rag2 animales mutantes homocigotos, lo que facilita la expansión del tumor (Tabla 1). Resultados similares fueron reportados recientemente donde 24 de 27 rag2 pez cebra mutante homocigotos SGDEA injertadas, mientras que 0 de 7 hermanos de tipo salvaje injertados enfermedad 23. Un ejemplo representativo de un SGDEA injertado se muestra a los 30 días post-trasplante en la figura 3E. Injertadas SGDEA comparten características histológicas de rabdomiosarcoma embrionario, similar a la encontrada en el tumor primario (Figura 3B y 3F). FACS análisis confirmó que SGDEA contenían funcionalmente tumor distinto propagar células y las células diferenciadas que expresan myf5-GFP y / o mylpfa-mCherry. Las tasas de supervivencia tras el procedimiento de inyección intraperitoneal fueron más de 95%. Pez cebra destinatario comúnmente sucumben de carga tumoral después del punto 30 días el tiempo post-trasplante. Figura 1. Protocolo esquemático para (A) normal y (B) maligno esquelético trasplante de células del músculo en rag2 mutante homocigoto el pez cebra. Los pasos opcionales están marcados con (*). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2. injerto muscular esquelético en rag2 homocigotos pez cebra mutante. (A) transgénico pez cebra donante α-actina-RFP. (B) La viabilidad celular de aislados de la suspensión de células de músculo evaluada por exclusión de colorante DAPI y citometría de flujo. (C) Proporción de células RFP-positiva se encuentran dentro de la suspensión de células de músculo desde el donante α-actina-RFP (rojo), en comparación con un control de tipo salvaje(Gris). (DE) Fusionada campo brillante y las imágenes fluorescentes de animales salvajes de tipo (D) o rag2 peces mutantes homocigotos (E) a los 30 días post-trasplante. tarifas (F) el injerto en el tiempo. Red denota número de animales injertados mientras gris muestra peces no injertado. Número de animales analizados en cada punto de tiempo se indican. (GI) Imágenes de magnificación de alta de la región de caja en el panel E se muestran a 10 (G), 20 (H) y 30 (I) días post-trasplante, que muestra la retención de las fibras musculares diferenciadas en el tiempo (puntas de flecha). Las barras de escala son iguales a 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" width="700px" /> Figura 3. Trasplante de myf5-GFP; mylpfa-mCherry SGDEA en homocigotos mutantes rag2 . pez cebra (AD) rag2-kRASG12D SGDEA primarias inducidas surgen en AB-deformación myf5-GFP; pez cebra mylpfa-mCherry a los 30 días de vida. (EH) rag2 homocigotos pez cebra mutante injertado con SGDEA y analizados a los 30 días post-trasplante. (A, E) Fusionada campo brillante y las imágenes fluorescentes de SGDEA primarias y trasplantados. El área tumoral se describe y punta de flecha indica el sitio de inyección en E. (B, F) hematoxilina y eosina secciones de parafina de teñido primario (B) y SGDEA injertadas (F) muestra las zonas de aumento de celularidad asociado con el cáncer. (C,G) La viabilidad celular, evaluada por exclusión de colorante DAPI y citometría de flujo. (D, H) subpoblaciones de células tumorales fluorescentes, según lo evaluado por citometría de flujo. Las barras de escala son iguales a 2 mm (A, E) y 50 m (B, F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" width="700px" /> Tabla 1. Resultados de injerto para el músculo y el trasplante de células SGDEA. (*) Indica los datos reportados previamente usando las mismas técnicas 23. Los datos se reimprime con permiso de Nature Methods. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla</a>.

Aquí, presentamos un protocolo para el trasplante de células de músculo esquelético de pez cebra y rabdomiosarcoma embrionario (ERMS) en pez cebra mutante homocigoto rag2E450fs adulto inmunocomprometido. Este protocolo permite el análisis eficiente de la regeneración y transformación maligna de las células musculares.

Trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo preparar y trasplantar músculo normal y maligno de peces cebra donantes transgénicos a receptores peces cebra inmunodeficientes rag dos. El trasplante muscular implica primero aislar el músculo marcado con fluorescencia mediante la disección de la musculatura dorsal.Después de la homogenización de las células musculares de pez cebra, se filtran y se preparan en una suspensión de células individuales. Luego, las células se trasplantan por vía intramuscular en peces cebra mutantes rag2, y se utiliza microscopía de epifluorescencia para seguir el injerto tisular en los animales receptores tan pronto como 10 días después del trasplante. De manera similar, se puede obtener un sarcoma primario de rabdomiosarcoma embrionario, prepararlo en suspensión y trasplantarlo por vía intraperitoneal en peces cebra mutantes rag2.Luego, se utiliza microscopía para seguir el injerto del tejido y las células tumorales propagadas pueden emplearse en aplicaciones posteriores. La principal ventaja del trasplante de células en peces cebra inmunocomprometidos adultos es que proporciona una plataforma universal para el trasplante alogénico de varios tipos de tejidos y tumores. Los tejidos pueden injertarse a partir de una variedad de orígenes genéticos donantes sin necesidad de supresión inmunitaria en los peces receptores.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología de células madre y regenerativa, como la capacidad de autorrenovación de los progenitores. También podemos utilizar estos métodos para inducir tumores en peces con mutación rag dos y luego identificar compuestos químicos novedosos que, por ejemplo, inhiban el crecimiento tumoral. La demostración de la preparación y trasplante de células musculares normales y malignas estará a cargo de Chin, Tang y Anes, dos estudiantes de posgrado talentosos en el laboratorio de LAL. Comience sacrificando peces cebra donantes con músculo marcado fluorescentemente. Uno.Los peces donantes adultos típicos que expresan actina alfa marcada con RFP producen entre 500.000 y 2 millones de células musculares. En nuestro experimento de ejemplo, utilizamos 30 peces donantes para trasplantar en 20 peces receptores con un millón de células cada uno. Después de la eutanasia del pez donante, seque el animal colocándolo sobre una toalla de papel desechable.Utilice una cuchilla de afeitar para extraer la musculatura dorsal. El corte debe realizarse en un ángulo de 45 grados en sentido posterior a la región anal, incluyendo huesos y tejido cutáneo. Transfiera 10 secciones musculares dorsales recolectadas a una placa de Petri limpia. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de suspensión frío 0.9 XPBS 5 %FBS.A continuación, pique el tejido hasta obtener una suspensión uniforme, homogeneizando completamente el tejido utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros; agregue dos mililitros de tampón de suspensión al homogenato y luego pase la suspensión a través de la pipeta 20 veces. A continuación, filtre la suspensión utilizando un filtro de 40 micrones y recoja las células en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Mantenga las células frías durante el resto del procedimiento.Lave el tejido restante en el filtro con 2,5 mililitros de suspensión, tampón y pase al tubo cónico de 50 mililitros. Ahora, cuente el número total de células viables utilizando azul de tripano y concéntrelas mediante centrifugación a 1000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, re suspenda las células en PBS 0,9 X con 5 %FBS a 333.000 células por microlitro.Si el número de células donadoras es limitado, tan solo 50.000 células inyectadas también pueden conducir a un injerto exitoso. Comience anestesiando peces deficientes en rag2 de dos a cuatro meses de edad en trica. Cuando los movimientos branquiales sean lentos y el pez esté inmóvil, traslade el pez a una toalla húmeda con el lado izquierdo del pez hacia arriba.Ahora utilice una microjeringa de 10 microlitros, calibre 26 s, previamente limpiada, para inyectar tres microlitros de la suspensión de células musculares preparada. Las inyecciones deben realizarse en un ángulo de 45 grados e introducirse directamente en la musculatura dorsolateral de los peces receptores. Es importante tener en cuenta que, al realizar el trasplante intramuscular, se debe inyectar un volumen total inferior a tres microlitros en el pez receptor. Luego, transfiera cuidadosamente el pez receptor a un tanque de recuperación que contenga agua limpia del sistema para peces.Continúe inyectando los peces restantes y colóquelos en un tanque de recuperación. Posteriormente, evalúe las tasas de injerto a los 10, 20 y 30 días posteriores al trasplante utilizando microscopía de campo claro y microscopía de fluorescencia epiescopia. Procese cada tumor por separado.Sacrifique un pez con rabdomiosarcoma embrionario. Coloque el pez en una placa de Petri limpia y seccione el tumor separándolo de los tejidos no malignos utilizando una cuchilla de afeitar y pinzas finas. Una disección cuidadosa alrededor del tumor dará como resultado una mayor pureza de la suspensión celular obtenida, con mínima contaminación del tejido muscular circundante. Transfiera el tumor diseccionado a una placa nueva y agregue 100 microlitros de tampón de suspensión de PBS 0.9 X frío con 5 % de FBS.Luego, pique el tejido con una hoja de bisturí hasta obtener una suspensión uniforme. A continuación, agregue 900 microlitros adicionales de tampón utilizando una pipeta de un mililitro, seguido por el triturador. Pase la suspensión a través de la pipeta varias veces para disociar las células.Ahora filtre las células a través de un filtro celular de 40 micrones. Enjuague la placa añadiendo de dos a cuatro mililitros adicionales de suspensión, tampón y filtre a través del mismo filtro celular. Concentre las células como antes.Mantenga las células en hielo. Luego, re suspenda las células en 100 microlitros de tampón y cuente las células viables utilizando azul de trian. Ajuste la concentración de la suspensión celular a 5.000 células por microlitro.A continuación, anestesie a los dos peces cebra receptores inmunocomprometidos y colóquelos sobre una toalla de papel limpia con el lado ventral hacia arriba. Utilizando una aguja de jeringa estéril de calibre 26, inyecte el volumen deseado en la cavidad peritoneal del pez cebra receptor aquí.Se inyectan 25.000 células en cinco microlitros. Sin embargo, se pueden inyectar con éxito hasta 10 microlitros. Deje que los peces inyectados se recuperen en un tanque de recuperación antes de devolverlos al sistema principal.Posteriormente, siga los peces receptores para evaluar el injerto mediante microscopía de fluorescencia epiescopia y recolecte las células para estudios posteriores. Mediante el procedimiento descrito, se trasplantaron células del músculo esquelético de donantes transgénicos de alfa actina RFP a peces cebra inmunocomprometidos homocigotos con mutación en rag2. El tejido muscular esquelético produjo una suspensión individual de células que contenía un 84,3 % de células viables, según se evaluó mediante exclusión de DPI.Tras el análisis mediante citometría de flujo, las células positivas para RFP representaron el 35,3 % de esta suspensión de células donadoras. El trasplante de células en el músculo esquelético dorsal de peces receptores RAG dos mutantes homocigotos produjo un injerto constante y fuerte. Esto se confirmó mediante la formación de fibras musculares multinucleadas fluorescentes en los peces receptores; los peces receptores de tipo salvaje no lograron el injerto de fibras musculares.Sin embargo, a los 10 días posteriores al trasplante, nueve de los 14 peces cebra mutantes contenían fibras musculares positivas para RFP cerca del sitio de inyección. Es importante destacar que el músculo injertado positivo para RFP persistió al menos hasta los 30 días posteriores al trasplante. De manera similar, se obtuvo un injerto robusto tras el trasplante de peces cebra mutantes RAG2 con rabdomiosarcoma embrionario o ERMS.Los ERMS injertados compartieron características histológicas con el tumor primario de ERMS, y la heterogeneidad celular del tumor se mantuvo según lo evaluado mediante análisis de fluorescencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar trasplantes musculares y trasplantes intraperitoneales de tejidos normales y malignos utilizando peces adultos receptores inmunocomprometidos. Tras esto, se pueden realizar otros métodos como clasificación de células activadas por fluorescencia, análisis de trasplante por dilución límite y PCR en tiempo real para evaluar las diferencias funcionales y moleculares entre diferentes subpoblaciones tumorales.En general, nuestro enfoque permite el injerto robusto y a largo plazo de tejido muscular y maligno fluorescente en peces inmunodeficientes con mutación en RAG dos. La ventaja de este enfoque es que el injerto ocurre sin necesidad de supresión inmunitaria previa del pez receptor y no requiere compatibilidad inmunológica entre los animales donantes y receptores.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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