Trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo preparar y trasplantar músculo normal y maligno de peces cebra donantes transgénicos a receptores peces cebra inmunodeficientes rag dos. El trasplante muscular implica primero aislar el músculo marcado con fluorescencia mediante la disección de la musculatura dorsal.

Después de la homogenización de las células musculares de pez cebra, se filtran y se preparan en una suspensión de células individuales. Luego, las células se trasplantan por vía intramuscular en peces cebra mutantes rag2, y se utiliza microscopía de epifluorescencia para seguir el injerto tisular en los animales receptores tan pronto como 10 días después del trasplante. De manera similar, se puede obtener un sarcoma primario de rabdomiosarcoma embrionario, prepararlo en suspensión y trasplantarlo por vía intraperitoneal en peces cebra mutantes rag2.

Luego, se utiliza microscopía para seguir el injerto del tejido y las células tumorales propagadas pueden emplearse en aplicaciones posteriores. La principal ventaja del trasplante de células en peces cebra inmunocomprometidos adultos es que proporciona una plataforma universal para el trasplante alogénico de varios tipos de tejidos y tumores. Los tejidos pueden injertarse a partir de una variedad de orígenes genéticos donantes sin necesidad de supresión inmunitaria en los peces receptores.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología de células madre y regenerativa, como la capacidad de autorrenovación de los progenitores. También podemos utilizar estos métodos para inducir tumores en peces con mutación rag dos y luego identificar compuestos químicos novedosos que, por ejemplo, inhiban el crecimiento tumoral. La demostración de la preparación y trasplante de células musculares normales y malignas estará a cargo de Chin, Tang y Anes, dos estudiantes de posgrado talentosos en el laboratorio de LAL. Comience sacrificando peces cebra donantes con músculo marcado fluorescentemente. Uno.

Los peces donantes adultos típicos que expresan actina alfa marcada con RFP producen entre 500.000 y 2 millones de células musculares. En nuestro experimento de ejemplo, utilizamos 30 peces donantes para trasplantar en 20 peces receptores con un millón de células cada uno. Después de la eutanasia del pez donante, seque el animal colocándolo sobre una toalla de papel desechable.

Utilice una cuchilla de afeitar para extraer la musculatura dorsal. El corte debe realizarse en un ángulo de 45 grados en sentido posterior a la región anal, incluyendo huesos y tejido cutáneo. Transfiera 10 secciones musculares dorsales recolectadas a una placa de Petri limpia. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de suspensión frío 0.9 XPBS 5 %FBS.

A continuación, pique el tejido hasta obtener una suspensión uniforme, homogeneizando completamente el tejido utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros; agregue dos mililitros de tampón de suspensión al homogenato y luego pase la suspensión a través de la pipeta 20 veces. A continuación, filtre la suspensión utilizando un filtro de 40 micrones y recoja las células en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Mantenga las células frías durante el resto del procedimiento.

Lave el tejido restante en el filtro con 2,5 mililitros de suspensión, tampón y pase al tubo cónico de 50 mililitros. Ahora, cuente el número total de células viables utilizando azul de tripano y concéntrelas mediante centrifugación a 1000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, re suspenda las células en PBS 0,9 X con 5 %FBS a 333.000 células por microlitro.

Si el número de células donadoras es limitado, tan solo 50.000 células inyectadas también pueden conducir a un injerto exitoso. Comience anestesiando peces deficientes en rag2 de dos a cuatro meses de edad en trica. Cuando los movimientos branquiales sean lentos y el pez esté inmóvil, traslade el pez a una toalla húmeda con el lado izquierdo del pez hacia arriba.

Ahora utilice una microjeringa de 10 microlitros, calibre 26 s, previamente limpiada, para inyectar tres microlitros de la suspensión de células musculares preparada. Las inyecciones deben realizarse en un ángulo de 45 grados e introducirse directamente en la musculatura dorsolateral de los peces receptores. Es importante tener en cuenta que, al realizar el trasplante intramuscular, se debe inyectar un volumen total inferior a tres microlitros en el pez receptor. Luego, transfiera cuidadosamente el pez receptor a un tanque de recuperación que contenga agua limpia del sistema para peces.

Continúe inyectando los peces restantes y colóquelos en un tanque de recuperación. Posteriormente, evalúe las tasas de injerto a los 10, 20 y 30 días posteriores al trasplante utilizando microscopía de campo claro y microscopía de fluorescencia epiescopia. Procese cada tumor por separado.

Sacrifique un pez con rabdomiosarcoma embrionario. Coloque el pez en una placa de Petri limpia y seccione el tumor separándolo de los tejidos no malignos utilizando una cuchilla de afeitar y pinzas finas. Una disección cuidadosa alrededor del tumor dará como resultado una mayor pureza de la suspensión celular obtenida, con mínima contaminación del tejido muscular circundante. Transfiera el tumor diseccionado a una placa nueva y agregue 100 microlitros de tampón de suspensión de PBS 0.9 X frío con 5 % de FBS.

Luego, pique el tejido con una hoja de bisturí hasta obtener una suspensión uniforme. A continuación, agregue 900 microlitros adicionales de tampón utilizando una pipeta de un mililitro, seguido por el triturador. Pase la suspensión a través de la pipeta varias veces para disociar las células.

Ahora filtre las células a través de un filtro celular de 40 micrones. Enjuague la placa añadiendo de dos a cuatro mililitros adicionales de suspensión, tampón y filtre a través del mismo filtro celular. Concentre las células como antes.

Mantenga las células en hielo. Luego, re suspenda las células en 100 microlitros de tampón y cuente las células viables utilizando azul de trian. Ajuste la concentración de la suspensión celular a 5.000 células por microlitro.

A continuación, anestesie a los dos peces cebra receptores inmunocomprometidos y colóquelos sobre una toalla de papel limpia con el lado ventral hacia arriba. Utilizando una aguja de jeringa estéril de calibre 26, inyecte el volumen deseado en la cavidad peritoneal del pez cebra receptor aquí.

Se inyectan 25.000 células en cinco microlitros. Sin embargo, se pueden inyectar con éxito hasta 10 microlitros. Deje que los peces inyectados se recuperen en un tanque de recuperación antes de devolverlos al sistema principal.

Posteriormente, siga los peces receptores para evaluar el injerto mediante microscopía de fluorescencia epiescopia y recolecte las células para estudios posteriores. Mediante el procedimiento descrito, se trasplantaron células del músculo esquelético de donantes transgénicos de alfa actina RFP a peces cebra inmunocomprometidos homocigotos con mutación en rag2. El tejido muscular esquelético produjo una suspensión individual de células que contenía un 84,3 % de células viables, según se evaluó mediante exclusión de DPI.

Tras el análisis mediante citometría de flujo, las células positivas para RFP representaron el 35,3 % de esta suspensión de células donadoras. El trasplante de células en el músculo esquelético dorsal de peces receptores RAG dos mutantes homocigotos produjo un injerto constante y fuerte. Esto se confirmó mediante la formación de fibras musculares multinucleadas fluorescentes en los peces receptores; los peces receptores de tipo salvaje no lograron el injerto de fibras musculares.

Sin embargo, a los 10 días posteriores al trasplante, nueve de los 14 peces cebra mutantes contenían fibras musculares positivas para RFP cerca del sitio de inyección. Es importante destacar que el músculo injertado positivo para RFP persistió al menos hasta los 30 días posteriores al trasplante. De manera similar, se obtuvo un injerto robusto tras el trasplante de peces cebra mutantes RAG2 con rabdomiosarcoma embrionario o ERMS.

Los ERMS injertados compartieron características histológicas con el tumor primario de ERMS, y la heterogeneidad celular del tumor se mantuvo según lo evaluado mediante análisis de fluorescencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar trasplantes musculares y trasplantes intraperitoneales de tejidos normales y malignos utilizando peces adultos receptores inmunocomprometidos. Tras esto, se pueden realizar otros métodos como clasificación de células activadas por fluorescencia, análisis de trasplante por dilución límite y PCR en tiempo real para evaluar las diferencias funcionales y moleculares entre diferentes subpoblaciones tumorales.

En general, nuestro enfoque permite el injerto robusto y a largo plazo de tejido muscular y maligno fluorescente en peces inmunodeficientes con mutación en RAG dos. La ventaja de este enfoque es que el injerto ocurre sin necesidad de supresión inmunitaria previa del pez receptor y no requiere compatibilidad inmunológica entre los animales donantes y receptores.