Evaluación funcional y morfológica de Diafragma Inervación por frénico neuronas motoras
25 de mayo de 2015
El registro del potencial de acción muscular compuesto evalúa cuantitativamente la inervación funcional del diafragma por las neuronas motoras frénicas. La inmunohistoquímica del diafragma de montaje completo evalúa la inervación morfológica en las uniones neuromusculares individuales. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo se pueden utilizar estas dos poderosas metodologías en varios modelos de roedores de enfermedad de la médula espinal.
El objetivo general de este procedimiento es evaluar cuantitativamente la inervación funcional y morfológica del diafragma por las neuronas motoras frénicas de la médula espinal cervical. Esto se logra mediante la realización de un registro del potencial de acción muscular compuesto desde el hemiodiafragma en animales anestesiados después de la estimulación supra máxima del nervio frénico ipsilateral. El siguiente paso es llevar a cabo la inmunohistoquímica del diafragma de montaje completo para evaluar morfológicamente la inervación de las uniones neuromusculares individuales.
En última instancia, la combinación del potencial de acción muscular compuesto y los análisis de la unión neuromuscular proporciona un enfoque poderoso para estudiar cuantitativamente la inervación diafragmática en modelos de roedores de la enfermedad del SNC y el SNP. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las lesiones de la médula espinal, como ¿se pueden utilizar intervenciones terapéuticas para restaurar con éxito la función diafragmática? Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades como la lesión traumática de la médula espinal y el ILS, ya que la función respiratoria diafragmática desempeña un papel clave en el resultado del paciente en ambas afecciones debilitantes. La Dra. Kali, becaria postdoctoral en mi laboratorio, Melanie Martin, estudiante de pregrado en el laboratorio del Dr. Wright, demostrará el procedimiento. y Tamara Holla, técnica de investigación en mi laboratorio.
Después de anestesiar al animal, colóquelo en la tabla quirúrgica, con el lado dorsal hacia abajo y asegure las extremidades delanteras a la tabla. A continuación, afeita la superficie ventral desde la base del cráneo hacia el abdomen a ambos lados de la línea media. Una vez que se haya limpiado la piel, coloque los electrodos, fije el suelo a la cola y coloque el electrodo de referencia en la parte inferior contralateral del abdomen por vía subcutánea.
El electrodo de registro debe prepararse con gel conductor en la parte autoadhesiva y luego fijarse a lo largo del margen costal unilateral. Ahora coloque los electrodos estimulantes, transcutáneos separados medio centímetro, laterales a la tráquea y superiores a la clavícula. Deben entrar perpendiculares a la piel y tener aproximadamente un centímetro de profundidad.
Estos electrodos deben estar bien asegurados, lo mejor es hacerlo a mano. Conecte todos los electrodos a sus estimuladores y amplificadores apropiados. Los datos recopilados deben registrarse en una computadora.
Para el análisis, establezca los parámetros de estímulo de la estimulación unipolar en 0,5 milisegundos, pulsos supermáximos de un hercio. La amplitud puede oscilar entre seis y ocho voltios. Establezca el tiempo de estimulación de interés en 30 segundos y promedie la respuesta de 10 estimulaciones consecutivas utilizando el registro de amplitud de referencia a pico de cada animal aproximadamente una vez por semana si lo desea.
El manejo de los animales se detalla en el protocolo de texto. Después de sacrificar a un animal con una sobredosis de anestesia inyectable, realice una laparotomía con bisturí o tijeras. Haz una incisión de la apófisis xifoides a lo largo de la línea media.
Luego, con un bisturí y fórzas, separe cuidadosamente la piel y el tejido conectivo de la musculatura. Retire el diafragma tirando hacia arriba de la apófisis xifoides y cortando el diafragma del hueso circundante. Tenga cuidado de no dañar el músculo del diafragma.
Transfiera el diafragma con el lado superior hacia arriba a un plato de silicona lleno de aldehído paraformado al 4% en PBS debajo de un estereoscopio. Sujete con alfileres el tejido que rodea el diafragma, estirándolo hasta tensarlo. A continuación, retire el tejido conectivo de la superficie superior con pinzas y tijeras.
Deje que el fijador actúe durante 20 minutos y luego retírelo con tres lavados de 10 minutos en PBS. A continuación, aplique glicina molar 0,1 con 2%BSA en PBS durante 30 minutos. A continuación, incubar el diafragma en una solución de alfa bungalow conjugado con varilla Domine durante 15 minutos.
Lave la toxina del bungalow con PBS como se hizo con el fijador. A continuación, cambie el baño a metanol frío y enfríe el tejido durante cinco minutos a 20 grados centígrados negativos. Después de cinco minutos, retire el metanol y lave el pañuelo con PBS como antes.
Ahora, aplique un bloque con una solución de 0,2%TBP durante una hora. Cambie la solución al anticuerpo primario en TBP al 0,2% y deje que el tejido se incube durante la noche a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Al día siguiente, use tres lavados de 10 minutos en 0.2% TBP para eliminar el anticuerpo primario, y luego incube el tejido en la solución de anticuerpos secundarios durante una hora con balanceo y en la oscuridad más tarde, use tres lavados en PBS para eliminar el anticuerpo secundario y mantener el tejido en la oscuridad.
Luego, bajo un estereoscopio, extirpe más tejido conectivo en la superficie superior del músculo. Una vez limpio, monte y obtenga imágenes del tejido bajo un microscopio de epifluorescencia vertical, analice cuantitativamente la morfología del hemiodiafragma teñido. Utilice un aumento de 20 y 40x porque el diafragma se analiza como una montura completa.
La mayor parte de la tinción fluorescente está desenfocada. Con un microscopio estándar, lo mejor es realizar el análisis en tiempo real. Con el fin de puntuar correctamente la morfología del NM js individual, divida el músculo en tres secciones para su análisis basado en los patrones topográficos de inervación de la médula espinal.
Comenzando en la región de la mayoría ventral, analice todas las njs visibles a lo largo de las fibras musculares, no analice más profundamente que las primeras tres o cuatro fibras de la superficie porque la penetración de los anticuerpos nunca es completa. Una NMJ intacta tiene un axón preterminal que es grueso y todas las regiones de la terminal nerviosa se superponen completamente con los receptores de acetilcolina musculares subyacentes. Un NMJ parcialmente desnervado tendrá algunas regiones de los receptores de acetilcolina subyacentes desocupadas.
Una NMJ completamente denervada no mostrará correspondencia con los receptores de acetilcolina en la terminal nerviosa. Otros njs de la región deberían mostrar otra morfología o el éxito de los anticuerpos La penetración estaría en duda si más de un axón preterminal inerva un NMJ. El NMJ se multiplica.
En este caso puede haber ocurrido denervación inervada, seguida de reinervación. Si hay superposición en la terminal nerviosa con los receptores de acetilcolina subyacentes y el axón preterminal es muy delgado, entonces la NMJ está finamente inervada. Esto también es una indicación de reación.
En un experimento con espra adulta, los controles de ratas Dolly recibieron una laminectomía, mientras que otros recibieron una lesión hemiaxial SCI. En C cuatro. Cinco semanas más tarde, se registró la amplitud máxima del cmap desde el hemidiafragma ipsilateral hasta la laminectomía o el sitio de la lesión.
Se redujo significativamente en las ratas SCI en comparación con las ratas de control de laminectomía única en un experimento diferente que involucró ratas que expresaban una proteína humana mutada, por lo que D una proteína sirvió como modelo de un LS. La morfología de NMJ en el hemiodiafragma estaba completamente intacta en los animales de control de tipo salvaje. Sin embargo, en las ratas transgénicas, las njs mostraron una patología significativa. Algunos mostraban una denervación completa marcada por la punta de flecha.
Otros njs estaban parcialmente denervados como lo marca la punta de flecha, y como se ve en el NMJ de la derecha, otros njs estaban inervados múltiplemente, y otros tenían axones preterminales delgados aquí marcados con una punta de flecha. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar cuantitativamente la inervación funcional y morfológica del diafragma por las neuronas motoras frénicas. Gracias por mirar y buena suerte con todos tus experimentos.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo evalúa cuantitativamente la inervación del diafragma por neuronas motoras frénicas mediante el registro del potencial de acción muscular compuesto y la inmunohistoquímica del diafragma en montaje completo. Estas metodologías son aplicables en diversos modelos roedores de enfermedades de la médula espinal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Inmunohistoquímica
Antecedentes
- Las neuronas motoras frénicas inervan el diafragma, esencial para la función respiratoria.
- Comprender la inervación del diafragma es fundamental para abordar las lesiones de la médula espinal.
- La combinación de evaluaciones funcionales y morfológicas mejora las capacidades de investigación.
- Este estudio utiliza modelos en roedores para explorar intervenciones terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Evaluar la inervación funcional y morfológica del diafragma.
- Evaluar la eficacia de intervenciones terapéuticas para restaurar la función diafragmática.
- Proporcionar información sobre lesiones de la médula espinal y enfermedades relacionadas.
Métodos Utilizados
- Registro del potencial de acción muscular compuesto del diafragma hemi.
- Estimulación supra máxima del nervio frénico ipsilateral.
- Inmunohistoquímica de montaje completo del diafragma para el análisis de las uniones neuromusculares.
- Combinación de ambas metodologías para una evaluación integral.
Resultados principales
- Se obtuvieron con éxito datos cuantitativos sobre la inervación del diafragma.
- La metodología demostró eficacia en modelos de roedores.
- Se obtuvieron conocimientos sobre el potencial de restauración terapéutica de la función diafragmática.
- Mejor comprensión de la morfología de la unión neuromuscular.
Conclusiones
- El enfoque combinado proporciona una herramienta potente para estudiar la inervación del diafragma.
- Los resultados tienen implicaciones para las terapias en lesiones de la médula espinal y afecciones relacionadas.
- Este protocolo puede orientar investigaciones futuras en la restauración de la función respiratoria.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa de la inervación del diafragma por neuronas motoras frénicas permite una evaluación con alta confianza de la función neuromuscular en modelos preclínicos de enfermedades del SNC y SNP. La integración de registros del potencial de acción muscular compuesto (CMAP) con el análisis morfológico de la unión neuromuscular (NMJ) apoya la reducción predictiva de riesgos para estrategias terapéuticas dirigidas a la función respiratoria. Este enfoque de doble modalidad fortalece la continuidad traslacional desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica en carteras de enfermedades respiratorias y neurodegenerativas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías de las neuronas motoras frénicas fundamentales para la función respiratoria.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al distinguir entre déficits funcionales y morfológicos en la unión neuromuscular (NMJ).
- Facilita la confianza predictiva en la interacción con el objetivo y en las hipótesis mecanicistas para las terapias respiratorias.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona puntos finales electrofisiológicos y morfológicos validados para la selección de compuestos en modelos de roedores.
- Permite la medición cuantitativa y reproducible del estado de inervación del diafragma entre cohortes experimentales.
- Facilita la estandarización de ensayos para la comparabilidad entre estudios y entre laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona biomarcadores funcionales y morfológicos con puntos finales relevantes para la enfermedad en modelos de lesión de la médula espinal y de ELA.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos terapéuticos basado en la restauración de la función del diafragma.
- Apoya la continuidad desde estudios mecanicistas hasta la evaluación preclínica de eficacia en líneas de investigación de enfermedades respiratorias.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial, la validación del blanco y la evaluación de la eficacia preclínica de terapias dirigidas a trastornos neuromusculares y respiratorios.
- Biología del Descubrimiento: El análisis cuantitativo de CMAP y de la unión neuromuscular aclara la función de las vías y reduce el riesgo de las hipótesis sobre dianas.
- Selección: Las mediciones electrofisiológicas y morfológicas permiten plataformas de ensayo robustas y reproducibles.
- Analítica: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes para comparar los efectos de las intervenciones.
- Investigación Traducional: Alinea los puntos finales preclínicos con resultados clínicamente relevantes de la función respiratoria.
- Reutilización Empresarial: La metodología es adaptable a modelos de enfermedades del SNC y SNP para su aplicación en toda la cartera.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuromusculares.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de evaluación funcional y morfológica para lograr escalabilidad y reproducibilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la asignación de capital al vincular hallazgos mecanicistas con resultados funcionales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas para enfermedades respiratorias y neurodegenerativas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología e inmunohistoquímica para la adquisición e interpretación precisas de los datos.
- Exige acceso a instrumentación especializada para la grabación de potenciales de acción compuestos y microscopía de fluorescencia.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de estimulación, grabación y procesamiento de tejidos.
- La adaptación entre modelos de roedores puede requerir la optimización de la colocación de electrodos y la penetración de los anticuerpos.
- La limitada penetración de los anticuerpos restringe el análisis a las uniones neuromusculares superficiales, afectando la profundidad de la evaluación morfológica.
