Name: Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a determinar la aptitud de replicación relativa de cepas de VIH-1 mediante ensayos de competición de crecimiento por parejas. Este método utiliza PCR cuantitativa y secuenciación Sanger para medir diferencias de fitness viral con alta sensibilidad.

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Estos estudios fueron financiados por las subvenciones de los Servicios de Salud Pública de EE.UU. P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 y el Núcleo de Perfiles Funcionales y Biología Computacional del Centro de Investigación sobre el SIDA de la Universidad de Washington (P30 AI027757).

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<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
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<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
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<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Las opiniones expresadas aquí son las de los autores y no deben interpretarse como oficial o que representa los puntos de vista del Departamento de Defensa de Estados Unidos o del Departamento del Ejército.

Los protocolos presentados consistían en dos partes principales: la construcción del VIH-1 clones moleculares recombinantes y ensayos de competición crecimiento. A fin de distinguir dos virus en un cultivo celular doblemente infectada, es importante que los clones moleculares que compiten contienen etiquetas de secuencias, que pueden ser detectados por un ensayo de cebador-sonda RT-qPCR o por secuenciación de Sanger. Este protocolo hace uso de las etiquetas Vifa y VifB, que ocupan la misma región del VIH-1 NL4-3 vif y codifican la misma secuencia de aminoácidos pero que difieren por seis mutaciones sinónimas. Estas mutaciones se muestran no afectar gimnasio replicación viral 20. El método de clonación basada en PCR utilizada en este protocolo proporciona una mayor flexibilidad en la selección de sitios de clonación, en comparación con la clonación basada sitio de restricción. Sin embargo, la eficiencia de la clonación PCR disminuye a medida que aumenta el tamaño de inserción. El límite actual del tamaño de inserto es de ~ 5 kb 34. Para la clonación basada en PCR y sitios dirigida mutagenesis, el uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad es crucial para reducir la probabilidad de mutaciones adicionales. También se recomienda el uso del número mínimo de ciclos de PCR necesarios para producir cantidades adecuadas de productos. En nuestra experiencia, no detectamos ningún mutaciones adicionales después de los pasos de clonación y mutagénesis dirigida al sitio basados ​​en PCR que aquí se describen. Sin embargo, los productos de PCR deben ser secuenciados para comprobar que no existen mutaciones indeseadas. Idealmente, toda la región de codificación de VIH debe ser resequenced. Por lo menos tres puntos de tiempo de muestreo deben ser examinados dentro de la fase de crecimiento exponencial 9. La cinética de crecimiento viral primero deben establecerse mediante muestreo diario para determinar el período de la cultura y el tiempo de muestreo apropiadas puntos para el concurso de crecimiento. Un factor que afecta a la cinética de crecimiento viral es la multiplicidad de infección (MOI). Este protocolo utiliza un total de 0,005 MOI tanto para monoinfección y la competencia de crecimiento, como se demostró para producir más roresultados busto que baja MOI 9. No obstante, las MOI inferiores se pueden utilizar para obtener una fase de crecimiento exponencial ya si es necesario, pero a expensas de la consistencia resultado. Este protocolo sugiere una relación de la infección inicial de 50:50, suponiendo que las diferencias de aptitud de los virus son generalmente desconocido de antemano. Sin embargo, el uso de relaciones desiguales de entrada son apropiadas cuando hay datos preliminares que sugieren diferencias significativas en la cinética de la replicación viral. En estos casos, se recomienda una proporción de infección de 70:30 a permitir la detección de una diferencia grande de la aptitud donde el virus menos aptos se coloca en exceso 9. El protocolo para la determinación de la TCID 50, la cinética de crecimiento viral, y para llevar a cabo el crecimiento ensayos de competición se optimizaron usando el VIH-1 subtipo B, NL4-3 COTB-p24, y PBMCs de un único donante cuya PBMC han demostrado susceptibilidad consistente para el VIH 1 infección in vitro. El período de cultivoy los puntos de tiempo de muestreo presentados en este protocolo es probable que sean adecuados para el estudio de VIH-1 grupo M virus en PBMC humanas. El uso de PBMCs de una sola fuente es muy recomendable para obtener resultados consistentes como la replicación viral puede variar en diferentes células del donante 35. Aunque menos deseable, PBMCs agrupados a partir de múltiples donantes se pueden utilizar como una sustitución, siempre que la misma agrupación se utiliza en todos los experimentos. Otra alternativa es el uso de líneas celulares. El protocolo que aquí se presenta se utilizó con éxito con la línea de células T CEMx174 23,36. Sin embargo, es importante que el número de células sembradas son re-optimizados para lograr un crecimiento celular consistente. Cinética de crecimiento viral también deben ser restablecidos, ya que es probable que varíe en diferentes líneas celulares, para determinar los puntos de tiempo de muestreo apropiados en los pasos de competencia crecimiento. Dos métodos diferentes para determinar la relación viral para el cálculo de fitness están incluidas en el protocol. El primero utiliza RT-qPCR para medir el número de copias de ADNc viral en cada punto de tiempo de muestreo. A continuación, la aptitud replicación viral se calcula a partir de la relación viral, basado en el número de copias de ADNc. Alternativamente, la relación viral puede ser determinado basado en la relación de altura del pico del cromatograma en los sitios de la etiqueta VifAB. Los dos métodos dieron resultados comparables (Figura 4). El método de la altura del pico del cromatograma se puede aplicar a otras cepas del VIH-1 sin una etiqueta de secuencia de ingeniería. Para RT-qPCR, el uso de cebadores o sondas para distinguir variantes virales primero debe ser evaluado cuidadosamente (ver 20). Sin embargo, RT-qPCR proporciona una mejor sensibilidad para muestras con una pequeña cantidad de ARN viral, tales como los que desde el primer punto de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial. La medición directa de ADNc viral también permite la detección de los problemas técnicos que puedan surgir de la extracción de RNA y la síntesis de ADNc. Usando clones moleculares con etiquetas de secuencias proporciona una solución rentable to los métodos de RT-qPCR, como sólo se necesitan dos pares de cebadores y sondas para estudiar múltiples virus. Esta estrategia también evita el problema de la variación de altura de pico en la secuencia de cromatogramas debido a bases vecinos 37, como la secuenciación se realiza en el mismo sitio a través de todos los virus en el estudio. Los productos de PCR producidos por RT-qPCR y secuenciación Sanger también pueden estar en uso con otros métodos para determinar la relación viral como la secuenciación mayor parte de clones individuales 12,13, HTA 4,7,17,19, o ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA) 38 .

Aptitud La replicación viral se define como la capacidad de un virus para producir progenie infecciosa en un ambiente dado 1 y es un importante factor que contribuye a determinar la prevalencia de una variante del virus en la población a través del tiempo 2. Al igual que en estudios in vivo de la aptitud no son factibles con virus patógenos humanos, como el VIH-1, varios in vitro y ex vivo ensayos de aptitud de replicación se han desarrollado para estudiar los efectos sobre la aptitud derivadas de resistencia a los medicamentos y las mutaciones de escape inmune, epistasis y la evolución de las poblaciones virales 3-6. Entre los diferentes ensayos de aptitud, ensayos de competición de crecimiento se reconocen para producir medidas más sensibles y válidos de diferencias de aptitud, como dos o más variantes virales compiten por la misma población celular bajo exactamente las mismas condiciones ambientales, como ocurre en vivo 1,7,8. Antes de comenzar los experimentos de competición de crecimiento, varios variables necesita ser determinado, incluyendo el uso de diferentes multiplicidades de infección (MOI), la relación de entrada viral, y el tiempo de muestreo para el análisis. Hemos estudiado los efectos de estos parámetros en la cinética de crecimiento virales y sobre los resultados de los experimentos de competición, y hemos identificado los factores clave necesarios para las mediciones robustas de VIH-1 de la aptitud en el cultivo celular 9. Además de las variables de ensayo, hay una variedad de métodos para la cuantificación de variantes virales en experimentos de competición crecimiento. Bulk 10,11 o 12,13 secuenciación clonal se ha utilizado para determinar la relación de los virus que compiten sobre la base de las frecuencias de nucleótidos en el sitio (s) de interés. Aptitud relativa se deriva de cambios en esta relación con el tiempo. Este método es conveniente como servicios de secuenciación de ADN están ampliamente disponibles. El método (PASS) específica de alelo secuenciación paralela permite la secuenciación en múltiples sitios y la detección de recombinantes 14 </sup&gt;, Pero también requiere reactivos desarrollados específicamente y sistemas de detección. Esencialmente, se desarrollaron estos métodos para estudiar las cepas virales con un pequeño número de diferencias de nucleótidos en una región de interés. Otros métodos utilizan un pequeño gen reportero de 15 o sinónimo mutaciones 4,16-18 como etiquetas para distinguir los virus que compiten por la secuenciación, análisis de seguimiento de heterodúplex (HTA) 4,7,17,19 o revertir en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción cuantitativa (RT-qPCR) 15,16,18,20, todos los cuales pueden ser aplicables para estudiar cepas competir independientemente de similitud de secuencia. Se requiere un paso adicional para introducir etiquetas en los genomas virales y el ensayo de RT-qPCR también requiere reactivos e instrumentación específicos. Hemos encontrado que los rendimientos de secuenciación de Sanger a granel resultados comparables 9. A raíz de la competencia el crecimiento, la aptitud replicación viral se presenta como la aptitud relativa, o una relación de la aptitud entre two variantes virales. La aptitud relativa de un virus se puede definir como la proporción final de una variante viral normalizado por su proporción en el inóculo inicial o como la diferencia tasa de crecimiento neto entre los dos virus en competencia. Hemos encontrado que el último método, usando puntos de datos longitudinales sólo dentro de la fase de crecimiento exponencial, produjo los resultados más robustos 9,20. En ensayos in vitro de la aptitud se utilizan principalmente para estudiar clones biológicos 6-8 y clones moleculares infecciosos del VIH-1. Este último, al ser susceptibles de manipulación genética, se emplean a menudo para estudiar el efecto sobre la aptitud de mutaciones particulares o secuencias específicas de interés 3-5,21,22. Los siguientes protocolos describen un flujo de trabajo desde el punto de construcción de nuevo de larga duración infecciosas del VIH-1 clones moleculares usando 1-VIH vectores que contienen una etiqueta de secuencia, la introducción de mutaciones de interés, por lo que las poblaciones virales y el establecimiento de la cinética de crecimiento virales, Para realizar el ensayo de competición crecimiento y el cálculo de la aptitud relativa (Figura 1). El uso de nuestros procedimientos optimizados, creamos tres recombinantes del VIH-1 mutantes y se determinó su estado físico replicación. El clon molecular recombinante se construyó primero mediante la sustitución del VIH-1 gag-p24 región del gen de pNL4-3, un plásmido que contiene una longitud de genoma completo infeccioso del VIH-1 NL4-3 cepa de laboratorio, con un COTB sintético (Center-cina Árbol, subtipo B) secuencia gag-p24 23 para crear la cepa prototipo. Cambios aminoácidos individuales (T186M, T242N, y I256V) se introdujeron a continuación para crear tres clones mutantes. Cada mutante se compitió contra el virus prototipo para observar el impacto de la aptitud de cada mutación en el fondo genético determinado. Los tres mutantes demostraron diferentes niveles de fsitness replicación de leve a significativamente menor que el virus prototipo. La mutación T242N se informó anteriormente para tener un fitne moderadass cuesta 24-26, similar al resultado se muestra en este estudio. El costo de la aptitud de las otras dos mutaciones no había sido informado previamente.

<table><tbody><tr><td>Construcción de clones</td><td></td><td></td><td></td>recombinantes</tr><tr><td>Imprimación quimérica/Mutagénica/Secuenciación</td><td>IDT</td><td></td><td>Oligonucleótidos de ADN personalizados</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA y pNL4-3VifB Plásmido</td><td></td><td></td><td>Póngase en contacto con el Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td> <td>de alta fidelidadTermociclador Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Life</td><td>Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg; GeneAmp&reg; Sistema de PCR 9700</td></tr><tr><td>Colorante de carga de ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus escalera de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAkit de extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzima DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 químicamente competente Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Caldo base en polvo</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Reactivo de transfección de ADN</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0.22 &#956; tubo superior de filtro m</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo</td><td></td><td></td><td></td>celular</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime; s Dulbecco modificado; s Medio (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medios</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutinina (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2 humana Roche</td><td></td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>placa de 48 pocillos</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>placa de fondo plano de 96 pocillos</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td>placa</tr><tr><td>de fondo redondo de 96 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo de microcentrífuga</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml con junta tórica</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-VIH-1 SF2 p24 antisuero</td><td>NIH Programa de reactivos</td> para el SIDA <td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo HRP KPL</td><td></td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato de peroxidasa para micropocillos TMB</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Causa quemaduras graves por todas las vías de exposición. Usar equipo de protección personal. Úselo solo debajo de una campana de gases químicos. Lavar inmediatamente con abundante agua durante al menos 15 min.</td></tr><tr><td>Programa estándar del VIH p24</td> contra <td>el SIDA y el Virus del Cáncer (NCI-Frederick)</td><td>Para obtener detalles sobre el pedido, comuníquese con Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>Lector de microplacas Molecular Devices VMax Kinetic ELISA Lector de microplacas Aislamiento de ARN Síntesis de ADNc QIAxtractor Qiagen <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de primera hebra&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la rnasa</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de qPCR en tiempo real</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 PCR en tiempo real;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; Expresión génica Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación directa, inversa</td><td>IDT</td><td></td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>placa de reacción óptica de 96 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+secuenciación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa (Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Tampón NH4&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación de secuenciación</td><td>IDT</td><td></td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>proveedor de servicios de secuenciación de ADN</td>, <td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramienta web GRC</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Herramienta web ChromatQuan</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crecimiento por parejas ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia humanos

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Los ensayos de aptitud in vitro son herramientas esenciales para determinar la aptitud para la replicación viral de virus como el VIH-1. Se han utilizado varias mediciones para extrapolar la aptitud de replicación viral, que van desde el número de partículas virales por unidad infecciosa, la tasa de crecimiento en cultivo celular y la aptitud relativa derivada de ensayos de competencia de crecimiento de ciclos múltiples. Los ensayos de competencia de crecimiento proporcionan una medición particularmente sensible de la aptitud, ya que los virus compiten por objetivos celulares en condiciones de crecimiento idénticas. Hay varios factores experimentales a tener en cuenta al realizar ensayos de competencia de crecimiento, incluida la multiplicidad de infecciones (MOI), los tiempos de muestreo y los métodos de detección viral y cálculo de la aptitud. Cada factor puede afectar el resultado final y, por lo tanto, debe considerarse cuidadosamente durante el diseño experimental. El protocolo que se presenta aquí incluye pasos desde la construcción de un nuevo clon recombinante del VIH-1 hasta la realización de ensayos de competencia de crecimiento y el análisis de los resultados experimentales. Este protocolo utiliza valores de parámetros experimentales que se ha demostrado previamente que producen resultados consistentes y robustos. Se discuten alternativas, ya que algunos parámetros deben ajustarse de acuerdo con el tipo de célula y los virus que se estudian. El protocolo contiene dos métodos alternativos de detección viral para proporcionar flexibilidad, ya que la disponibilidad de instrumentos, reactivos y experiencia varía entre los laboratorios.

Para estudiar el impacto de la aptitud de los cambios de aminoácidos individuales en el VIH-1 Gag-p24, utilizamos oligonucleótido mutagénesis dirigida para introducir mutaciones en un plásmido pNL4-3 contiene el VIH-1 COTB-p24 gen 23,32,33. Stocks virales se generaron mediante transfección de células 293T y se recogieron después de 48 hr. Estimamos el cultivo de tejidos dosis infecciosa 50% (DICT50) de cada acción viral por el método de Reed-Muench 31. La TCID 50 del prototipo y los virus mutantes variaron de 04 10 hasta 5 10 UI / ml (Figura 3A). La cinética de crecimiento de los virus recombinantes se establecieron en PBMCs de un solo donante a una MOI de 0,005. RT-qPCR se utilizó para medir el número de copias de ADNc viral al día durante seis días. Todos los virus mutantes y de prototipo crecieron de manera exponencial entre el día 2 y día 4, después de lo cual se redujo el crecimiento viral, tal como se indica por una disminución de la pendiente del número de copias de ARN viral aumento (&lt;strong&gt; Figura 3B). La disminución en el número de copias de cDNA entre el día 0 (correspondiente al inóculo) y día 2 se debe a la absorción de virus a las células y la eliminación de los viriones no unidas por el día 1 de lavado (etapa 5.1.6). En la fase de crecimiento exponencial, los tres mutantes tenían una tasa de crecimiento más lento (g) que el virus prototipo (Figura 3C). Los tres mutantes fueron compitieron contra el virus prototipo en ensayos de competición crecimiento a una MOI total de 0.005. Cinética de crecimiento viral en cultivos doblemente infectadas fueron similares a la de monoinfección; la fase de crecimiento exponencial viral fue entre los días 2 y 4, y el crecimiento viral llegó a una meseta alrededor del día 5 (Figura 4A). Las diferencias de crecimiento viral se derivaron del cambio en la relación viral con el tiempo. La relación viral se calculó basándose en el número de copias de ADNc de la referencia y los virus mutantes utilizando RT-qPCR, y al comparar alturas de los picosen secuencia cromatogramas en los sitios de nucleótidos que distinguen los dos virus (Figura 4B). Las diferencias de crecimiento determinado usando el pico de altura y métodos virales número de copias de ARN arrojado resultados similares (Figura 4C). Los tres mutantes tenían menor aptitud de replicación de los virus prototipo con el I256V mutante que tiene la aptitud más baja (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de flujo de los protocolos presentados en este documento La protocolos de preparación de la preocupación de la construcción del virus del VIH-1 clones recombinantes y la generación de las reservas virales.. Los protocolos de la aptitud para el establecimiento de ensayos son cinética de crecimiento viral y la determinación de la aptitud viral relativa. Las líneas discontinuas representan los flujos alternativos para los protocolos. Por ejemplo, una mutación puede introducirse directamente en el VIH-1 NL4-3clon molecular sin generar un clon recombinante. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figura 2:. Construcción de VIH-1 NL4-3 COTB Gag-p24 clones moleculares recombinantes usando PCR de extensión por solapamiento (A) Diseño de los cebadores quiméricos. El 5 &#39;mitades de los cebadores contienen la secuencia del vector NL4-3 y el 3&#39; mitades contienen los extremos de la secuencia de inserción. (B) cebadores quiméricos se utilizan para amplificar el fragmento de inserción, COTB Gag-p24. (C) Los fragmentos de inserción se utilizan como cebadores para una segunda PCR para generar un nuevo plásmido recombinante. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figura 3:. Características de crecimiento virales en PBMC (A) Log 10 DICT 50 </sub&gt; de las reservas virales. (B) la cinética de crecimiento viral en monoinfections comenzado en una MOI = 0,005. (C) las tasas de crecimiento viral de más de seis días, incluyendo la fase exponencial de crecimiento (días 2-4) derivado de panel (B). Los valores mostrados representan la media de tres repeticiones de un experimento. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figura 4: crecimiento viral y de la aptitud relativa determinaciones (A) el crecimiento viral en cultivos de PBMC doblemente infectados.. (B) Las relaciones de los virus T242N y prototipos determinaron utilizando RT-qPCR o el método de secuenciación de pico de altura. Diferencias netas virales tasa de crecimiento (D) entre el mutante y los virus prototipo en cultivos doblemente infectadas (C), como se muestra en (A). Se calcularon los valores d fesde los datos de relación virales que se muestran en (B). Los valores mostrados representan la media de tres repeticiones de un experimento. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%.

La competencia de crecimiento entre virus casi isogénicos proporciona una medida sensible para determinar la aptitud relativa para la replicación. Los protocolos descritos aquí incluyen la construcción de clones recombinantes de VIH-1, la propagación del virus y la competencia de crecimiento y métodos de análisis optimizados para producir resultados sensibles y consistentes.

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la aptitud relativa de replicación de cepas de VIH-uno de interés. Esto se logra primero mediante la construcción de clones moleculares virales o plásmidos de ADN que contengan secuencias completas de VIH-uno de interés. El segundo paso consiste en generar lotes virales para cada clone molecular mediante la transfección de ADN.A continuación, se establecen la cinética de crecimiento y la fase de crecimiento exponencial de cada cepa de VIH-1 mediante muestreos longitudinales de cultivos celulares mono-infectados. El paso final consiste en realizar competencia de crecimiento por pares o infección dual en cultivos celulares. Finalmente, se utilizan la transcripción inversa, la PCR cuantitativa en tiempo real y las alturas pico de los cromatogramas de secuenciación de ADN obtenidos mediante secuenciación de ADN de Sanger para determinar las proporciones virales, las cuales se emplean luego para calcular la aptitud relativa de replicación viral.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la infección para-mono o la infección dual en dos puntos temporales es que proporciona mediciones más sensibles y robustas de la diferencia de aptitud replicativa entre dos cepas virales. Los protocolos presentados en este artículo incluyen la construcción de clones recombinantes de VIH-uno, la introducción de mutaciones de interés mediante mutagénesis dirigida a un sitio específico, la preparación de partidas virales y la realización de ensayos de aptitud para establecer la cinética de crecimiento viral y determinar la aptitud viral relativa. Este video demostrará la competencia de crecimiento y dos métodos diferentes.Para determinar la proporción viral para el cálculo de la aptitud, consulte el texto del protocolo para todos los demás procedimientos. Para preparar el ensayo de competencia de crecimiento, siembre tres veces 10 a la quinta células mononucleares de sangre periférica estimuladas con PHA, o PBMCs, en un volumen total de 500 microlitros por pocillo en una placa de fondo plano de 48 pocillos. Mantenga la placa a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono hasta la inoculación. A continuación, prepare tres mililitros de inóculo que contenga 6.000 UI para cada virus.En un experimento típico, se prueban múltiples mutantes, pero con fines de esta demostración, solo se probará un mutante frente al virus prototípico. La preparación adecuada del inóculo viral es un paso crítico en este procedimiento, ya que puede ser necesario realizar diluciones seriadas del stock viral con una titulación infecciosa muy alta. Transfiera 1,5 mililitros de cada inóculo viral a un tubo estéril para crear el inóculo de infección dual.Añada 500 microlitros del inóculo dual a los PBMC estimulados con PHA en cada pocillo de la placa de 48 pocillos. El volumen final de cultivo es de un mililitro por pocillo. Aliquote 200 microlitros por pocillo del inóculo dual a dos placas de 96 pocillos para el aislamiento de ARN. Guarde una placa como respaldo. Incube las células inoculadas a 37 grados Celsius en una atmósfera con 5% de dióxido de carbono durante 16 a 24 horas. De 16 a 24 horas después de la inoculación, lave los cultivos, retire y deseche 750 microlitros del sobrenadante del cultivo y añada 750 microlitros de medio Iscove modificado de Dulbecco completo fresco o cIMDM.Envuelva la placa con una película de plástico y centrifugue durante 10 minutos. A 300 ×g, retire y deseche 750 microlitros del sobrenadante. Añada 750 microlitros de cIMDM fresco. Incube las placas a 37 grados Celsius en una atmósfera con 5% de dióxido de carbono. Los momentos de muestreo deben seleccionarse de manera que incluyan al menos tres puntos temporales dentro de la fase exponencial de crecimiento viral.Para recoger una muestra, transfiera 500 microlitros de sobrenadante de cultivo a un tubo de centrífuga de 1,8 mililitros y centrifugue durante un minuto a 3000 g. Transfiera 200 microlitros del sobrenadante libre de células a dos placas de muestra de 96 pocillos para el aislamiento de ARN. Nuevamente, guarde una placa como respaldo. Almacene los sobrenadantes a menos 80 grados Celsius hasta el aislamiento de ARN.Añada 500 microlitros de cIMDM fresco a cada cultivo y devuelva la placa al incubador hasta el siguiente momento de muestreo. Posteriormente, se aísla el ARN de las muestras, seguido de la síntesis de ADNc. Se demostrarán dos métodos para determinar las proporciones virales.El primero utilizando transcripción reversa, PCR cuantitativa en tiempo real o RT qPCR, y el segundo utilizando las alturas de los picos del cromatograma. Para la qPCR, prepare una serie de diluciones estándar seriadas por triplicado del plásmido pNL4-3VifA, diluyendo diez veces en cada paso, desde tres veces 10 a la seis copias por microlitro hasta 30 copias por microlitro. Prepare una placa de reacción qPCR de 96 pocillos.Cada placa debe contener al menos un control negativo, la serie de dilución estándar en triplicado y duplicados de cada muestra de ADNc. Utilice un cebador y sonda vFIA para detectar señales en los controles negativos, en la serie de dilución estándar y con uno de los duplicados de la muestra de ADNc. Utilice el cebador y sonda vIFB con el otro duplicado de la muestra de ADNc. Para cada reacción de qPCR, use 12,5 microlitros del mezcla maestra de qPCR, 0,2 micromolar del sonda de qPCR, 0,8 micromolar de cada uno de los cebadores directo e inverso y un microlitro de ADNc. Para la serie de dilución estándar, agregue la dilución en serie de pNL4-3VifA en lugar de ADNc; para los controles negativos, use agua o tampón en lugar de ADNc. Establezca los parámetros de ciclado de PCR según las instrucciones del fabricante para el uso de la máquina de qPCR. Calcule la curva estándar utilizando los datos de amplificación obtenidos de la serie de dilución estándar.Compare los datos de amplificación de las muestras de ADNc con la curva estándar para determinar el número de copias. Utilice el cálculo de la tasa de crecimiento viral o la herramienta web GRC para calcular la aptitud viral relativa. Introduzca el número de copias de ADNc obtenido en el paso de RT qPCR en el formato especificado que se muestra. Al seleccionar calcular, se obtendrá la diferencia de tasa de crecimiento neta entre dos virus en competencia. Para determinar las proporciones virales utilizando las alturas de los picos del cromatograma, amplifique por PCR fragmentos de VIH-uno VIF que contengan la etiqueta de secuencia VIFAB utilizando cebadores VIF directo y VIF inverso. Para cada reacción de PCR, use un microlitro de ADNc, tampón 1XNH-cuatro, 1,5 milimolar de MgCl2, 0,2 milimolar de dNTPs, 2,5 U de polimerasa Taq y 0,45 micromolar de cada cebador.Añada agua hasta un volumen final de 50 microlitros. Establezca los parámetros de ciclado de la PCR en tres ciclos a 94 grados Celsius durante un minuto, 55 grados Celsius durante un minuto y 70 grados Celsius durante un minuto, seguidos de 34 ciclos a 94 grados Celsius durante 15 segundos, 58 grados Celsius durante 30 segundos y 70 grados Celsius durante un minuto. Y finalmente, una incubación a cuatro grados Celsius. Posteriormente, purifique los productos de PCR utilizando un kit disponible comercialmente y envíe los productos de PCR purificados a un proveedor de servicios de secuenciación de ADN para secuenciación Sanger.Verifique la puntuación promedio de calidad de lectura proporcionada por el servicio de secuenciación. Si la precisión promedio de las llamadas de bases es inferior al 85 %, repita la purificación de los productos de amplificación por PCR y la secuenciación de Sanger. Utilice la herramienta web cuantitativa Chromat para calcular la proporción viral en cada punto temporal.Los insumos requeridos son la secuencia líder y el archivo del cromatograma de secuencia en formato .ab1. La herramienta mide la intensidad del pico en el sitio especificado.La proporción de la intensidad del pico corresponde a la relación entre los dos virus. Utilice la herramienta web GRC para calcular la aptitud viral relativa. La entrada es la altura del pico del cromatograma de secuencia obtenida mediante la herramienta web Chromat quantitative en el formato especificado que se muestra. La herramienta web GRC calculará la diferencia neta en la tasa de crecimiento entre las dos cepas virales en competencia; se construyeron un prototipo y tres virus mutantes del VIH, y se caracterizó su crecimiento en PBMC. La CIDT 50 osciló entre 10 a la cuarta y 10 a la quinta UI por mililitro. Todos los virus crecieron exponencialmente entre el día dos y el día cuatro.En la fase de crecimiento exponencial, los tres mutantes presentaron una tasa de crecimiento más lenta que el virus prototipo. Cada mutante compitió contra el virus prototipo en ensayos de competencia de crecimiento con una MOI total de 0,005; la cinética de crecimiento viral en cultivos doblemente infectados fue similar a la de la infección mono. La fase de crecimiento exponencial viral se produjo entre los días dos y cuatro, y el crecimiento viral alcanzó una meseta alrededor del día cinco.Las diferencias en la tasa de crecimiento viral se derivaron del cambio en la proporción viral a lo largo del tiempo. La proporción viral se calculó en función del número de copias de ADNc de los virus de referencia y mutante mediante RT-qPCR y comparando las alturas de los picos en los cromatogramas de secuencia en sitios nucleotídicos que permiten distinguir entre los dos virus; el mutante T242-N se compara con el prototipo. En este ejemplo, las diferencias en la tasa de crecimiento determinadas utilizando ambos métodos arrojaron resultados similares.Los tres mutantes presentaron una capacidad de replicación inferior a la del virus prototipo, siendo el mutante I256-V el que tuvo la menor aptitud. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar ensayos de competencia de crecimiento por pares para determinar la aptitud de replicación relativa del VIH-1.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La región de la corona de las diferentes secuencias V3 bucle de la glicoproteína de superficie (gp120) del VIH-1 puede ser caracterizado estructuralmente en muchos casos en el plegamiento in silico de las posiciones 10 a 22 del ciclo con un estado de la...

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Se describe un protocolo para identificar las principales funciones de las moléculas de señalización de acogida en la replicación lítica de un modelo herpesvirus, virus herpes gamma 68 (γHV68). La utilización de cepas de ratón modificados genéticamente y los fibroblastos embrionarios de γHV68 replicación lítica, el protocolo permite tanto la caracterización fenotípica y molecular de las interacciones interrogatorio virus-huésped durante la replicación viral lítico.

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

La patogénesis del VIH-1 se define tanto por las características virales como por los factores genéticos del huésped. Aquí describimos un método robusto que permite mediciones reproducibles para evaluar el impacto de la variación de la secuencia del gen gag en la capacidad de replicación in vitro del virus.

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Infección de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ex vivo proporciona un valioso modelo 3D de la patogenesia virus. Aquí, describimos un protocolo e infectar a los especímenes del tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa genital femenina con HIV-1 y mantener en la cultura en la interfase líquido-aire.

Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Aquí, describimos algunos métodos establecidos para determinar el estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la respuesta proteica desplegada (UPR), con especial énfasis en la infección por VIH-1. Este artículo también describe un conjunto de protocolos para investigar el efecto del estrés del RE/UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión.

Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

Aprende a determinar la aptitud de replicación relativa de cepas de VIH-1 mediante ensayos de competición de crecimiento por parejas. Este método utiliza PCR cuantitativa y secuenciación Sanger para medir diferencias de fitness viral con alta sensibilidad.

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

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