Name: 3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales tímicas medulares en un sistema organotípico tridimensional. Este método mejora la proliferación, diferenciación y mantenimiento de la expresión génica promiscua en comparación con los cultivos bidimensionales.

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Este trabajo ha sido apoyado por el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), el consorcio de la UE "Tolerage", la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) y la Landesstiftung Baden-Württemberg.

Este estudio ha sido aprobado por el comité de ética de la Regierungspräsidium Karlsruhe. Todos los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos en el Centro Alemán de Investigación Oncológica (DKFZ). Para todos los cachorros experimentos de cultivo de ratón que van de 1 a 7 días de edad fueron utilizados. 1. Aislamiento de mTECs de timo NOTA: Se realizaron las siguientes etapas de digestión como se describió anteriormente 1 bajo condiciones estériles con algunas modificaciones de la siguiente manera. <ol><li> Decapitar a las crías de ratón y retire el timo. Coloque el timos en hielo en una placa de Petri que contiene medio RPMI 1640 (que contiene 5% de FCS). </li><li> Cortar el timos en finos, trozos pequeños y colocar en un tubo de fondo redondo con ~ 5-30 ml de medio RPMI y revuelva suavemente usando un imán durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> A partir de entonces, se decanta el sobrenadante que contiene principalmente timocitos y digerir secuencialmente el tejido restante con una ronda de collagenatipo se IV (0,2 mg / ml y 57 U / ml concentartion final) durante 15 min cada uno a 37 ° C, seguido por la colagenasa / dispasa (0,2 mg / ml y una concentración final de 1,2 U / ml) durante 25 min cada uno a 37 ° C en un baño de agua con agitación magnética hasta que el timos se digirió completamente. Usar 1 ml de enzima por dos y cincuenta y ocho timos. </li><li> Agitar el tejido una vez cada 7-10 minutos con una pipeta Pasteur. Reúnase el fracciones colagenasa / dispasa y filtrar a través de una gasa de 70 micras. </li><li> Enriquecer los mTECs por celular magnética clasificación (MACS). Realizar la purificación de mTECs por clasificación celular magnética 11 como se describió previamente, y se muestra en la Figura 1. NOTA: Para la clasificación magnética de mTECs hemos utilizado los siguientes anticuerpos anti-CD80-PE (16-10A1, uso en dilución 1: 100) y anti-EpCAM-bio (G8.8, el uso en dilución 1: 100) 12. MTECs inmaduros y maduros utilizando MACS se definieron como: CD45 - EpCAM + CD80 - y CD45 - CD80 + respectively. </li><li> Después de la purificación MACS (pureza de mTECs inmaduros = 83,1 ± 6,3% y mTECs maduros = 79,23 ± 3,42%), sembrar las mTECs en los cultivos organotípicos como se describe a continuación (Sección 2.3). </li><li> Alternativamente, ordenar mTECs por FACS (utilizando 100 boquilla micras) tras el agotamiento CD45 MACS utilizando los siguientes anticuerpos anti-CD45-PerCP (30-F11, el uso en dilución 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utilice al 1 : 100 dilución), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, el uso a escala 1: 500 dilución) y el uso de anti-CD80-PE (16-10A1, en dilución 1: 100). Excluir las células muertas utilizando yoduro de propidio (1: 5000) (Día 4). MTECs inmaduros y maduros utilizando FACS se definieron como: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - y PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectivamente. </li></ol> 2. 3D organotípicos Co-culturas (OTC) NOTA: Las construcciones 3D dérmica para el cultivo de organotípico keratinocytES se prepararon como se ha descrito previamente 9,13. En todos los pasos células se incubaron a 37 ° C y 5% de CO 2. Las OTC utilizando mTECs se prepararon con ligeras modificaciones como sigue. <ol><li> Preparación de fibroblastos humanos NOTA: Los fibroblastos dérmicos humanos se obtuvieron a partir de cultivos de explantes de dermis de-epidermised como se describió previamente 9. <ol><li> En resumen, cortar tiras de piel humana (~ 5 cm de longitud) y tratar con termolisina (0,5 mg / ml en solución salina con 10 mM Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C. </li><li> A partir de entonces, separar la epidermis de la dermis utilizando fórceps. </li><li> Finamente cortar la dermis en trozos pequeños, lugar en una placa de Petri de 10 cm y dejar secar durante 1-2 horas bajo un flujo de aire estéril. Complementar los explantes regularmente con DMEM que contiene 20% de SFB. </li><li> Dividir los fibroblastos crecimiento fuera cuando confluente (normalmente alrededor de 3 semanas) utilizando 0,1% de tripsina asegurándose de que los explantes siguen adhiriendo a la placa para una mayor estafarondas consecutivas de derivación. </li><li> Expandir los fibroblastos de los mismos explantes durante un máximo de 3 veces en DMEM con 10% de SFB y crio-preservarlos 14. Utilice el mismo lote de fibroblastos para cada serie experimental. NOTA: Los fibroblastos no se irradiaron durante la puesta a punto de los equivalentes dérmicos. </li></ol></li><li> Preparación del Andamios <ol><li> Cortar los 0,4 hasta 0,6 mm de espesor de viscosa, material fibroso no tejido (los detalles del producto en el apoyo a la hoja de Excel) en círculos bien delimitadas utilizando un fuerte pegador de 11 mm de diámetro de metal para encajar exactamente en 12 inserciones bien de filtro. Luego colóquelo en el elemento filtrante de 12 pocillos (poliéster membrana de poro capilar, 3 micras de tamaño de poro) como un andamio. Coloque la configuración completa del filtro en una placa de 12 pocillos estéril. </li><li> Preparar el gel de fibrina usando un pegamento de fibrina-kit para la cirugía que consiste en una combinación de fibrinógeno y trombina. Pre-diluir el fibrinógeno así como la trombina-componente del kit a 8 mg / ml y 10unidades / ml, respectivamente. Para un solo pocillo de una placa de 12 pocillos proceder como sigue. <ol><li> Diluir 100 l de fibrinógeno (8 mg / ml) con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca + 2 y Mg + 2, pH 7,0. Diluir 100 l de trombina (10 unidades / ml) con 100 l FCS que contienen 270.000 fibroblastos. </li><li> Dispensar 200 l de la trombina que contiene fibroblastos de células-MIX en el andamio, a los que añaden 200 l de fibrinógeno (mezcla 1: 1), resultando en una concentración final de fibrinógeno de 2 mg / ml y de la trombina de 2,5 unidades / ml. Mezclar bien y distribuir de manera uniforme sobre toda el área del andamio por pipeteo suave (Día 1). NOTA: Después de 30 min a 37 ° C se habrá formado un coágulo que encierra los fibroblastos, llenando completamente los espacios internos del andamio y que forma una superficie superior lisa. </li></ol></li></ol></li><li> Co-cultivo con mTECs <ol><li> Para pre-cultura, sumerja los cultivos de órganos enDMEM con 10% FBS, 50 mg / ml de ácido L-ascórbico y 1 ng / ml TGF-β1 con un cambio de medio cada dos días durante 4-5 días. </li><li> En el día de la siembra MTEC, reemplazar el medio por medio rFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) con 10% de FBS, 10 -10 M toxina del cólera, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, / ml de ácido L-ascórbico 50 mg, ligando RANK (0,1 g / ml) y 500 unidades / ml de aprotinina, evitando así la fibrinólisis precoz por serina proteasas secretadas por los fibroblastos. </li><li> 7-8 horas más tarde, la configuración de los co-cultivos sembrando 250.000 mTECs (ya sea mTECs completos, o CD80 y CD80 hi lo subconjuntos), en un volumen de 100 l por pocillo en la parte superior del andamio de fibroblastos. Contar las células por medio de una cámara de Neubauer (día 4). NOTA: En todo momento el timo cultivos organotípicos 3D se sumergieron en medios diferencia de OTC de la piel que son aire levantado. </li><li> Después de 24 horas de incubación, el suministro de los cultivos con medio (cambio medio total) como se mencionó anteriormente (paso 2.3.2) ahora containing redujo cantidades de aprotinina, 250 unidades / ml (día 5). </li><li> A fin de evaluar la actividad proliferativa de mTECs, añadir EdU (6,7 micras / ml, es decir, 10 M / pocillo) a OTCs durante 4 horas antes de la terminación de los cultivos. Realice la tinción de OTC crio-secciones como se describe en el Kit de EdU Imaging combinado con co-tinción de la queratina 14. Determinar los índices proliferativos de mTECs, por cualquiera de las células del K14 + EdU + contando en dos secciones de cada muestra de cultivo o por flujo citometría de (EDU citometría de flujo, la Sección 1.7, pero en lugar de Ly51-FITC utilizan CDR1-PB 15 en una dilución 1: 100 y 2.3.6.4). </li><li> Después de 4-7 días de co-cultivo, terminar las OTC y el proceso para el aislamiento de ARN, crio-seccionamiento o análisis FACS (día 8-11). <ol><li> Terminar los cultivos usando un fórceps, separando el andamio / equivalente dérmico desde el filtro del inserto así. </li><li> Para crio-seccionamiento, incrustar toda la OTC en compuesto OCT y congelar en livapor de nitrógeno quid antes de crio-seccionamiento. Preparar 5-7 micras de espesor secciones OTC utilizando un criostato y se almacena a -20 ° C hasta su uso. Por inmunohistoquímica de OTC crio-seccionó usar anti-queratina 14 (AF64, el uso a escala 1: 1000 dilución), y anti-vimentina (GP53, el uso a escala 1: 100 dilución) anticuerpos. Realice la tinción inmunohistoquímica indirecta utilizando respectivos anticuerpos secundarios. </li><li> Para el aislamiento de ARN, añadir 1 ml de solución de desnaturalización (que contiene fenol y tiocianato de guanidina) en un tapón de rosca de un tubo libre de 2 ml RNasa. Cortar toda la OTC en trozos con un bisturí y añadir en el tubo que contiene la solución desnaturalizante. Mecánicamente triturar las OTC con instrumento FastPrep dos veces durante 30 segundos a una velocidad de 6,0, colocar en el medio en hielo durante 2 min (la muestra se puede almacenar a -80 ° C después de este punto). Si se congela a -80 ° C, descongelar en hielo. Centrifugar los tubos a 11,500-13,000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, incubar durante 5 min a RT y fprotocolos de aislamiento de ARN ollow usando ácido guanidinio tiocianato-extracción con fenol-cloroformo como se describe por el fabricante. </li><li> Para el análisis FACS, quitar el andamio y separar la membrana de la fibrina / fibroblastos / gel MTEC. Finamente cortar el gel con un escalpelo y digerir en un tubo de FACS para ~ 20 min o hasta que esté completamente digerido con 2 ml de colagenasa / dispasa a 37 ° C en un baño de agua con agitación magnética. Agitar la solución de enzima con una pipeta Pasteur una vez cada 5 min. Después de la digestión completa, se filtra la suspensión celular a través de un filtro de 70 micras; manchar la suspensión de células individuales usando los anticuerpos como se describe en 1.7 y analizar por citometría de flujo. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflicto financiera o comercial de interés.

Junto RTOCs, la OTC 3D haber sido muy superior en términos de diferenciación TEC y PGE mantenimiento / inducción (Tabla 1) en comparación con otros (i) «culturas 3D simplificados &#39;usando - fibroblastos solo sin el andamio; (Ii) sistemas 2D utilizando - células fibroblastos / alimentador co-cultivadas con TEC 10, (iii) las células 3T3-J2 en el que se desarrollan clones TEC, pero PGE se pierde, (iv) matrigel o (v) los componentes de ECM (datos no publicados). PGE se mantuvo durante un máxim...

Timocitos en desarrollo constituyen aproximadamente el 98% del timo, mientras que el 2% restante consiste en una variedad de células que colectivamente componen el estroma tímico (es decir, células epiteliales, células dendríticas, macrófagos, células B, fibroblastos, células endoteliales). Las células epiteliales corticales exteriores (CTEC) procuran la inmigración de las células pro-T de la médula ósea, linaje de células T de inducción en multipotentes células pre-T y la selección positiva de la auto-MHC restringida timocitos inmaduros. Las células internas medulares del timo epiteliales (mTECs) están involucrados en la tolerancia a la inducción de los timocitos con un TCR de alta afinidad para los complejos de auto-péptido / MHC por cualquiera de inducir la selección negativa o su desviación en el linaje de células T reguladora. En el contexto de la inducción de la tolerancia central, mTECs son los únicos que expresan un amplio espectro de antígenos propios restringido de tejidos (TRAS) reflejando así el auto periférica. Este fenómeno se llama promiscua expresión génica (PGE)1,2. La mayoría de los estudios actuales sobre este fascinante tipo de célula se basan en células aisladas ex vivo, como diversos sistemas de cultivo 2D a corto plazo como resultado invariablemente en la pérdida de PGE y moléculas clave como regulador de MHC de clase II, Foxn1 y Aire dentro de los primeros 2 días 3-6 . Se mantuvo sin embargo no está claro, que los componentes y características de la malla 3D intacta del timo particulares faltaban en modelos 2D. El cultivo de órganos tímico re-agregación (RTOC) ha sido hasta ahora el único sistema 3D que permite el estudio de desarrollo de las células T, por un lado, y la biología de células del estroma, por otro lado, en un microambiente tímico intacta 7. Sin embargo, RTOCs tienen ciertas limitaciones, es decir, que ya contienen una mezcla compleja de células, requieren la entrada de las células del estroma fetales y soportar un período de cultivo máxima de 5 a 10 días. La falta de reduccionista en los sistemas de cultivo in vitro ha dificultado el estudio devarios aspectos del desarrollo de las células T y la organogénesis del timo no menos importante la regulación molecular de PGE y su relación con la biología del desarrollo de mTECs. Debido a la estrecha relación-de la organización estructurada de las células epiteliales de la piel y el timo, se optó por un sistema 3D cultura organotípico (OTC) que había sido desarrollado originalmente para emular a la diferenciación de los queratinocitos in vitro y por lo tanto crear un equivalente dérmico. El sistema OTC consiste en una matriz inerte andamio superpuesta con fibroblastos dérmicos que se encuentran atrapados en un gel de fibrina, en la que los queratinocitos se siembran 8,9. Aquí, hemos sustituido los queratinocitos con mTECs purificados. Manteniendo las características básicas de este modelo, hemos optimizado ciertos parámetros. En el modelo de venta libre aprobado mTECs proliferaron, se sometió a la diferenciación terminal y mantenido la identidad MTEC y PGE, imitando así de cerca en el desarrollo mTECs vivo <sup&gt; 10. Esta nota técnica proporciona un protocolo detallado que permite el paso a paso la configuración de OTC timo.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6 preñados&nbsp;</td><td>Columnas Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microperlas, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas de estreptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 y -biotina)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD80-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45-PerCP</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC anticuerpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific</td><td>Blue Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de queratina 14</td><td>Covance</td><td>PRB-155P Anticuerpo</td><td></td></tr><tr><td>de Vimentina</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado con Cy3 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugado AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-conejillo de indias IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Sondas moleculares (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de ensayo de citometría de flujo</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de filtro de 12 pocillos (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R& Sistemas D</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Termolisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compuesto</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (también conocido como Trizol. Solución desnaturalizante - Extracción ácida de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0,2 mg/ml y 57U/ml conc final.</td></tr><tr><td>Proteasa neutra (dispasa)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0,2 mg/ml y 1,2 U/ml conc final.</td></tr><tr><td>DNasa I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 y micro; g/ml conc.</td></tr></tbody></table> final

3d organotípicos co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la expresión génica promiscuo modelo

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

El desarrollo de células T Intra-tímico requiere una malla tridimensional intrincada compuesta de diversas células del estroma, es decir, las células no-T. Timocitos atraviesan este andamio en un orden temporal y espacial altamente coordinada mientras secuencialmente pasando los puntos de control obligatorios, es decir, T compromiso de linaje celular, seguido por la generación repertorio T y la selección antes de su exportación en la periferia. Los dos tipos principales de células residentes que forman este andamio son células epiteliales del timo corticales (CTEC) y medulares (mTECs). Una característica clave de mTECs es la denominada expresión promiscua de numerosos antígenos restringida de tejido. Estos antígenos restringido de tejidos se presentan a los timocitos inmaduros directa o indirectamente por mTECs o células dendríticas tímicas, respectivamente resultante en la auto-tolerancia. Modelos adecuados in vitro emulando las vías de desarrollo y las funciones de CTEC y mTECs Actualmente lacrey. Esta falta de modelos experimentales adecuados, por ejemplo, ha obstaculizado el análisis de la expresión génica promiscua, que todavía está poco conocida a nivel celular y molecular. Se adaptó un modelo de co-cultivo organotípico 3D a la cultura ex vivo mTECs aisladas. Este modelo fue originalmente ideado para cultivar queratinocitos de tal manera como para generar un equivalente de piel in vitro. El modelo 3D conserva características funcionales clave de MTEC biología: (i) la proliferación y la diferenciación terminal de CD80 he aquí-Aire negativa en CD80 hi, mTECs-Aire positivo, (ii) la capacidad de respuesta de RANKL, y (iii) la expresión sostenida de Foxn1, Aire y genes restringido de tejidos en CD80 hi mTECs.

Hemos adoptado un modelo de co-cultivo organotípico 3D (3D OTC) que había sido desarrollado originalmente para la cultura a largo plazo in vitro de queratinocitos 9. MTECs MACS enriquecidos (ver MACS enriquecimiento esquema de la figura 1) fueron sembradas en un andamio que comprende de un gel de fibrina y fibroblastos atrapadas. Los fibroblastos proporcionan la matriz extracelular esencial (ECM) que soporta mTECs in vitro. MTECs se cultivaron en OTC de 4-14 días en presenci...

El estudio de las células epiteliales tímicas medulares in vitro ha sido en gran medida infructuoso, ya que los sistemas de cultivo 2D actuales no imitan el escenario in vivo. El sistema de cultivo 3D descrito en este documento, un modelo de cultivo organotípico de piel modificada, ha demostrado ser superior en la recapitulación de la proliferación de mTEC, la diferenciación y el mantenimiento de la expresión génica promiscua.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células epiteliales medulares tímicas, o mTEC, en un sistema de cultivo organotípico tridimensional u OTC. Esto se logra primero colocando el material de andamiaje fibroso en un inserto de filtro de 12 pocillos, seguido por la superposición de un gel de fibrina recién preparado que contiene fibroblastos dérmicos humanos. Después de cuatro a cinco días de precultivo, los MTS se colocan sobre el andamiaje y se cultivan bajo condiciones de cultivo sumergido.Finalmente, se puede realizar inmunohistoquímica, aislamiento de ARN y análisis de datos sobre las cultivos co-cultivados para evaluar el desarrollo del mtech CED. La principal ventaja de los sistemas de co-cultivo organotípico 3D frente a los sistemas de cultivo 2D existentes es que son mucho superiores en cuanto a la recapitulación de la diferenciación y proliferación del mtech, así como al mantenimiento de la expresión génica promiscua. Hoy, esta técnica será demostrada por Iris Martin, una técnica de nuestro laboratorio colaborador.Cuando los fibroblastos dérmicos humanos alcancen confluencia, prepare las fibras del andamio hirviéndolas, secándolas y planchando piezas de material fibroso no tejido viscoelástico de 0,4 a 0,6 milímetros de grosor. Utilice un punzón metálico para cortarlas en círculos de 11 milímetros. Coloque el material fibroso cortado entre dos portaobjetos, envuelva los portaobjetos en papel de aluminio y autóclavelos.Una vez esterilizados, coloque los insertos en los pocillos de una placa estéril de 12 pocillos y luego cada andamio en un inserto correspondiente. A continuación, mezcle 2,7 × 10⁵ fibroblastos en 100 µL de suero de ternera fetal con 100 µL de trombina recién diluida por andamio. Aplique la mezcla de trombina y fibroblastos sobre cada andamio, seguida de 200 µL de fibrinógeno recién diluido.Luego, mezcle la mezcla celular en cada pocillo distribuyendo la solución uniformemente sobre todo el andamio mediante pipeteo suave. La imagen muestra el crecimiento de los fibroblastos dérmicos humanos con el gel de fibrina al día uno y al día cuatro de cultivo. Prepare un gel de prueba en un pocillo control sin andamio para registrar el tiempo y la formación de los coágulos en este momento también.Evalúe la formación del coágulo utilizando la punta de una pipeta o invirtiendo la placa después de que los fibroblastos hayan coagulado; sumerja los cultivos de órganos en medio suplementado con ácido sórbico y TGF beta uno durante cuatro a cinco días. En el día del siembra de mtech, reemplace este medio con medio RFAD que contenga 500 unidades por mililitro de proteína para prevenir la fibrinólisis prematura. Siete a ocho horas después, siembre 2,5 veces 10 a la quinta MTE suspendidas en 100 microlitros de RFAD sobre la parte superior de cada andamio y incube los cultivos mixtos durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el medio con medio fresco que contenga 250 unidades por mililitro de un proin durante cuatro a siete días más de cultivo.Para evaluar el desarrollo de los m Texs mediante inmunohistoquímica al final del cultivo, use un par de pinzas para separar el equivalente dérmico del andamio del filtro de cada uno. Incruste los OTC en compuesto OCT y congele los OTC en la fase gaseosa sobre nitrógeno líquido para aislar el O-T-C-R-N-A.Después de separar el tejido del andamio de los filtros, use un escalpelo para cortar los OTC en trozos y transfiera los trozos a un tubo libre de RNAsa de dos mililitros que contenga un mililitro de solución desnaturalizante. Utilice un instrumento de preparación rápida para desmenuzar mecánicamente los OTC dos veces a una velocidad de 6,0 durante 30 segundos cada vez, con un período de reposo de dos minutos en hielo entre cada desmenuzado. A continuación, aísle el ARN mediante extracción con tiocianato de guanidina ácido-fenol-cloroformo según lo descrito por el fabricante.Para analizar los OTS mediante citometría de flujo, retire la membrana y separe el andamio del gel de fibrina con fibroblastos mtech. A continuación, corte el gel con un bisturí tal como se acaba de demostrar. Transfiera el tejido a un tubo FACS.Continúe con dos mililitros de la pasta de colagenasa. Luego coloque el tubo a 37 grados Celsius en un baño de agua con agitación magnética durante 20 minutos. Agite utilizando su pipeta una vez cada cinco minutos hasta que el tejido esté completamente digerido.Filtre la suspensión celular resultante a través de un tamiz de 70 micrómetros y tiña las células utilizando los anticuerpos apropiados, como se ilustra. Las MTS pueden identificarse por su expresión de queratina 14, lo que permite distinguirlas fácilmente de los fibroblastos positivos para mentona. Curiosamente, las M Tex inmaduras y maduras exhiben patrones de crecimiento diferentes pero altamente reproducibles en cultivo.Las células inmaduras CD80D baja M Tex, por ejemplo, típicamente forman bicapas en estrecho contacto con los fibroblastos. Mientras que las MTS CD80D alta tienden a formar agregados celulares compactos delimitados por los fibroblastos, los subconjuntos mtech no solo sobreviven sino que también proliferan bajo las condiciones 3D OTC demostradas, como lo evidencia su incorporación de EDU. Curiosamente, las células MTech CD80 baja proliferan a mayor velocidad en presencia de RANKL.Aunque lo contrario es cierto para los MT.Techs con alta expresión de CD80, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar MT.Techs utilizando OTCs en 3D. Este es un método muy superior al uso de sistemas de cultivo en 2D en términos de diferenciación de los techs y mantenimiento e inducción de la PGE, con la posibilidad de estudiar o manipular varios parámetros del cultivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este video la preparación de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo se demuestra.

Reaggregate Culturas del timo

Este video muestra la disección y remoción del timo fetal y la preparación de cultivos ex vivo de 2-dGuo tratados con el timo.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

Este video muestra un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de linfocitos T inmaduros derivados de iPSC utilizando un sistema de cultivo tímico tridimensional. El cocultivo de las células T inmaduras derivadas de iPSC con lóbulos tímicos fetales de ratones con depleción de linfocitos endógenos dio lugar a una maduración exitosa de las células T para formar emigrantes tímicos (iTE) derivados de iPSC CD8αβ+ MHC clase I+.

Sistema de cultivo tímico tridimensional para generar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados ​​para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.

Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar las células linfoides innatas tipo 1 de la lámina propia del intestino delgado murino y establecer cocultivos tridimensionales (3D) entre ambos tipos de células para estudiar las interacciones bidireccionales entre las células epiteliales intestinales y las células linfoides innatas tipo 1.

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

Este protocolo describe el aislamiento de timocitos doble negativos del timo de ratón seguido de transducción retroviral y cocultivo en el sistema de cocultivo de líneas celulares del estroma del estroma de médula ósea que expresa 4 en forma delta (OP9-DL4) para un análisis funcional adicional.

Cocultivo y transducción de timocitos murinos en células estromales que expresan 4 similares a Delta para estudiar oncogenes en leucemia de células T

Aquí, describimos un protocolo para la formación de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados en hidrogeles de fibrina 3D con el objetivo de apoyar la maduración y el mantenimiento prolongado de las células epiteliales tímicas (TEC), así como la timopoiesis in vitro.

Formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales

Para estudiar la diferenciación y función de las células T CD8 in vitro, se pueden aislar células T CD8 del ratón para co-cultivarse a largo plazo con organoides epiteliales vaginales infectados preformados. Aquí describimos este proceso y evaluamos la adquisición de marcadores residentes de células T de memoria tras el co-cultivo.

In Vitro Diferenciación residente de células T CD8 con memoria usando el sistema de cocultivo organoide-célula T epitelial

Aprende a cultivar células epiteliales tímicas medulares en un sistema organotípico tridimensional. Este método mejora la proliferación, diferenciación y mantenimiento de la expresión génica promiscua en comparación con los cultivos bidimensionales.

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