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El objetivo general de este procedimiento es obtener islotes viables y vivos de ratones diabéticos LEP R DB, y evaluar la secreción de insulina a partir de células beta dentro de los islotes mediante imágenes de células vivas a fotones. Esto se logra primero preparando reactivos como la mezcla enzimática para la digestión del páncreas, el medio de cultivo para el crecimiento de islotes y el tampón extracelular para el ensayo de dos fotones. A continuación, se abre el abdomen de un ratón sacrificado y se inyecta la mezcla enzimática en el páncreas para digerir el órgano.

Luego, los islotes se separan del digestivo pancreático y se cultivan. Finalmente, se utiliza microscopía de dos fotones para obtener imágenes de las fusiones individuales de gránulos de insulina en las células beta dentro del islote. En última instancia, este protocolo ayudará a los investigadores a comprender cómo se controla la secreción de insulina en la salud y la enfermedad.

La principal mejora de la técnica de aislamiento de islotes es el uso de enzimas mixtas para aumentar el rendimiento y la viabilidad de los islotes. La técnica de imagen de dos fotones es actualmente el único método para registrar la secreción de insulina de múltiples células dentro de un islote intacto. Para preparar las enzimas destinadas al aislamiento de islotes pancreáticos, diluya un vial de cinco miligramos de hialuronidasa TL con 26 mililitros de DMEM, prepare la colagenasa tipo cuatro en tampón de Hank a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro, y complemente con las siguientes soluciones mixtas de hialuronidasa TL y colagenasa.

En una proporción de cuatro a uno en volumen, alícuote la mezcla de enzimas en porciones de 2,5 mililitros cada una y almacénelas a menos 20 grados Celsius. Para preparar el medio de aislamiento RPMI en un matraz cónico grande que contenga un litro de agua, disuelva un vial de polvo RPMI 1 6 4 0 a temperatura ambiente y suplemente con dos gramos de bicarbonato de sodio y 4,02 gramos de hippies. Use hidróxido de sodio para ajustar el pH a 7,4, luego filtre, esterilice y almacene a cuatro grados Celsius.

Prepare el medio de cultivo RPMI añadiendo 10 % FBS y 1 % de antibióticos al medio de aislamiento RPMI para imágenes de dos fotones. Prepare el tampón extracelular rico en sodio con los siguientes reactivos. Para preparar el colorante extracelular, prepare un stock de ocho milimolar de SRB, divida una alícuota del tampón extracelular en tubos pequeños y almacénelos a menos 20 grados Celsius.

Para obtener una concentración de trabajo, utilice tampón extracelular fresco para diluir el SRB en una proporción de uno a diez. Después de sacrificar un ratón y rociar completamente el cuerpo del ratón con etanol al 70 % según el protocolo descrito en el texto, coloque al animal con la cabeza hacia y la cola alejada del cirujano. Realice dos cortes laterales largos a través de la piel abdominal y el peritoneo para formar una aleta en forma de V.

Levante la aleta de la piel para descubrir toda la cavidad abdominal. Aparte el intestino y, con el tejido plegado, mantenga el hígado en su lugar para revelar el conducto biliar común. A continuación, coloque una pinza vascular en el ámpula de la pared del duodeno para impedir que las enzimas inyectadas ingresen al duodeno.

Este es un paso importante que determina si las enzimas pancreáticas entran al reflujo del conducto pancreático, al sitio de inyección o al duodeno. Utilice una aguja de calibre 31 para canular el conducto biliar común cerca de la unión del conducto hepático común y el conducto cístico, dejando espacio para una segunda inyección. Si el páncreas no se perfunde la primera vez, inyecte lentamente aproximadamente dos mililitros de mezcla fría de enzimas en el conducto biliar común del ratón.

Si la pinza está en la posición correcta, el páncreas se perfundirá rápidamente. Una vez que el páncreas haya sido perfundido, retire rápidamente el órgano, colóquelo en un frasco de vidrio e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante aproximadamente 19 minutos. Después de la incubación, detenga el proceso de digestión agregando aproximadamente 20 mililitros de medio de aislamiento frío.

Agite suavemente el vial para desagregar el páncreas y viértalo a través de un tamiz T normal con un tamaño de poro de un milímetro hacia un tubo estéril de 50 mililitros. Utilice el medio de aislamiento para completar el volumen del tubo y centrifugue a 400 G y cuatro grados Celsius durante un minuto. Con la escisión, añada medio de aislamiento al paladar y disuélvalo.

Luego, transfiera la suspensión a dos tubos de 15 mililitros y centrifugue por segunda vez. Después de aspirar el sobrenadante, añada seis mililitros de medio de separación celular por gradiente de densidad a cada tubo y mezcle mediante pipeteo o vórtex para resuspender. A continuación, por la pared de los tubos, añada cuidadosamente aproximadamente seis mililitros de medio de aislamiento encima del medio de separación por gradiente de densidad y centrifugue a 100 ×g y 4 grados Celsius durante 15 minutos.

Con la separación, recolecte las capas superior, media e inferior en tres recipientes separados. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, use una pipeta para seleccionar manualmente los ocelos en los tres recipientes. La mayoría se encontrará en la capa media, lo que ayudará a los ocelos a recuperarse de la digestión enzimática.

Prepare grupos de 40 islotes en placas de Petri de 25 centímetros con seis mililitros de medio de cultivo RPMI que contenga 10 milimolares de glucosa y cultive durante dos días. Cambie el medio diariamente para realizar imágenes de dos fotones como un ensayo indirecto para medir la secreción de insulina. Comience utilizando tres milimolares de glucosa en tampón extracelular para preincubar los islotes cultivados durante dos días.

Durante 30 minutos, aplique grasa a la platina del microscopio para evitar fugas de la solución y monte una cámara de control térmico que contenga una laminilla de vidrio sobre la platina del microscopio. Luego, cubra la cámara con 500 microlitros de tampón extracelular que contenga 0,8 milimolar de SRB y diversas concentraciones de glucosa. A continuación, coloque el ojal previamente incubado en el centro de la cámara y enfoque a tres o cuatro capas celulares dentro del ojal.

En los ojos de roedores, la tinción inmunohistoquímica para insulina muestra que la mayoría de las células son células beta. Luego, con el microscopio de dos fotones y un objetivo de inmersión en aceite de 60x, identifique eventos exoácidos individuales mediante la aparición repentina de un pequeño punto fluorescente. Finalmente, en el software de imagen de barrido, confirme un evento mediante la fase de aumento rápido de la señal fluorescente en una región de interés para un ratón de tipo silvestre.

Se esperan aproximadamente 200 acinos utilizando el protocolo demostrado en este video. Los acinos sanos tienen un aspecto brillante, forma redondeada y un borde liso. En cambio, un lote aislado con digestión excesiva suele presentar acinos pequeños y borrosos, así como acinos con células asar adheridas.

Aunque un lote sobredigerido presenta menos poros en el ensayo de dos fotones en respuesta a estímulos como glucosa o insulina de gránulos de potasio alto fusionados con la membrana plasmática, un SRB entra en los gránulos, lo que da como resultado la aparición de un punto fluorescente repentino, con un diámetro aproximado de 400 nanómetros. Durante el tiempo registrado, todos los eventos de exocitosis en respuesta al estímulo se identifican y se determinan la ubicación de los eventos, el momento de aparición, la duración y el tipo de fusión. Eventos como KISS y Run o fusión completa se caracterizan y son valiosos para evaluar cualquier defecto en la fusión de gránulos en modelos de diabetes tipo dos.

Este método se utilizó para demostrar que el defecto en los islotes diabéticos de ratones DB DB es la pérdida de la fusión completa de los gránulos y no un cambio en la cinética de la fusión individual de los gránulos. Además, el factor más importante que influye en la disminución de la secreción de insulina en la enfermedad es la reducción en el número de células responsivas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la perfusión pancreática y la actuación de islotes a partir de ratones RDB, y también debería ser capaz de realizar los dos ensayos en islotes intactos para evaluar las respuestas secretoras.