Name: Lepr Db Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a aislar islotes pancreáticos de ratones Lepr db diabéticos y evaluar la secreción de insulina mediante microscopía de dos fotones en células beta vivas. Este protocolo avanza la investigación de la diabetes tipo 2.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Consejo de Investigación Australiano DP110100642 (a PT) y las subvenciones del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud APP1002520 y APP1059426 (a PT y HYG).

NOTA: Todos los experimentos actuales se realizaron de acuerdo con los procedimientos de ética locales de animales de la Universidad de Queensland (aprobado por la Universidad de Queensland, Comité de Ética Biosciences anatómica). 1. Aislamiento Islet <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Mezcla de enzimas <ol><li> Para la digestión pancreática, utilizar una mezcla de Liberase y colagenasa tipo IV. Diluir Liberase TL (termolisina bajo) 1 vial de 5 mg con 26 ml de DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco). </li><li> Preparar colagenasa tipo IV en tampón de Hank a una concentración de 0,5 mg / ml, complementado con HEPES 5 mM, 0,5 mM CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNasa y 1 mg / ml de albúmina de suero bovino. </li><li> Mezclar la TL Liberase y soluciones de colagenasa en una proporción de 4: 1 (por volumen), es decir, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenasa. Alícuota la mezcla de enzimas de 2,5 ml cada una y se almacena a -20 ° C. NOTA: Los tiempos de incubación del tejido vary un poco entre lotes de enzima (30 seg a 1 min diferencia). Por lo tanto, puede ser necesario un ensayo de lote. </li></ol></li><li> RPMI Aislamiento Medios <ol><li> Disolver un vial de RPMI 1640 en polvo en 1 L de agua a RT y complementar con 2 g de NaHCO 3, 4,02 g de HEPES. </li><li> Combine los medios de aislamiento RPMI en un matraz cónico grande, mezcla con un agitador magnético, se ajusta a pH 7,4 con NaOH, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Medios de Cultivo </li><li> Usar medios de cultivo RPMI, con suero bovino fetal al 10% y 1% de antibióticos (es decir, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 g / ml). </li></ol></li><li> Aislamiento y cultivo Islet <ol><li> Sacrificio de Animales <ol><li> Sacrificar los ratones por dislocación cervical o asfixia de CO 2 de acuerdo a los procedimientos de ética de la institución local. Pulverizar el cuerpo del ratón a fondo con etanol al 70%. </li></ol></li><li> Perfusión de páncreas <ol><li> USE 2 cortes largos lateralmente a través de la piel abdominal y el peritoneo para hacer una solapa en forma de V. Tire de la solapa de la piel hacia arriba para descubrir toda la cavidad abdominal, dejar a un lado el intestino y mantener el hígado en su lugar por un pañuelo de papel doblado para revelar el conducto biliar común (Figuras 1 y 2). Ponga el animal de modo que la cabeza hacia el cirujano y la cola lejos de la cirujano. </li><li> Aplicar una pinza vascular en la ampolla en la pared duodeno para bloquear las enzimas inyectadas de entrar en el duodeno (Figura 1). NOTA: Este es un paso importante, ya que determina si las enzimas inyectadas voy a entrar en el conducto pancreático y perfundir el páncreas o el reflujo de la zona de inyección (más de pinza) o entrar en el duodeno (menores de pinza). </li><li> Canular la vía biliar común con una aguja de calibre 31 cerca de la unión del conducto hepático común y el conducto cístico (Figura 1) y dejar espacio para una segunda inyección si ªe páncreas no para perfundir la primera vez. Lentamente (más de ~ 10 seg) inyectar unos 2 ml de mezcla de enzimas fría en el ratón del conducto biliar común. NOTA: El páncreas se perfundieron rápidamente si la pinza está en la posición correcta. </li><li> Ajuste la posición de la abrazadera si la aguja está dentro del conducto biliar común, pero no puede perfundir el páncreas (es decir., Ascender en la pinza un poco lejos del hígado si sobre sujetado o moverlo un poco al hígado si es menor sujetado). NOTA: La aguja a veces entra en la cápsula que rodea en lugar de la luz del conducto. Un signo útil para comprobar si la aguja está dentro del conducto biliar común es la dilatación del conducto cuando se inyecte. Si el páncreas no para perfundir, una alternativa es la mezcla de enzima podría ser inyectado a múltiples sitios de páncreas con menor rendimiento esperado. La perfusión del sitio izquierda del páncreas (el lóbulo esplénica) es importante para la maximización del rendimiento de los islotes. </li><li> Después de que el páncreas es perfused, eliminar rápidamente el páncreas, lo puso en un vial (~ 20 ml, vidrio) y se incuba durante ~ 19 minutos en un baño de agua 37 ° C. NOTA: El tiempo de incubación puede variar un poco dependiendo de la cepa de ratón y la edad. </li><li> Después del tiempo de incubación, detener el proceso de la digestión mediante la adición de ~ 20 ml de medios de aislamiento frío. Agitar el vial suavemente para interrumpir el páncreas y se vierte a través de un tamiz de té normal (diámetro de poro de 1 mm) en un tubo de 50 ml estéril. Rellenar el tubo con medios de aislamiento y se centrifuga a 400 xg durante 1 min a 4 ° C con freno de apagado. </li><li> Disolver el precipitado en los medios de aislamiento de nuevo y transferir a dos tubos de 15 ml y centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C con freno de apagado. Después de la aspiración del sobrenadante, mezclar los dos gránulos bien con 6 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad (Histopaque solución 1,077) por tubo mediante agitación con vórtex o pipeteando arriba y abajo. A continuación, añadir suavemente ~ 6 ml de los medios de aislamiento para el lado del tubo en la parte superior delos medios de separación de gradiente de densidad y centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C con freno off. </li><li> Recoger el sobrenadante en la parte superior (medios de aislamiento), medio e inferior (densidad medios de separación celular gradiente) de la capa 3 en platos separados. Handpick los islotes en estos 3 platos, usando una pipeta en un microscopio de disección. NOTA: La capa media contiene la mayoría de los islotes. Los islotes se reconocen como estructuras compactas de ~ 50 a 500 micras de tamaño (Figura 3). Obtenemos ~ 200 islotes en ratones WT y 300- &lt;100 islotes en ratones db / db. </li></ol></li><li> El cultivo Islet <ol><li> Para ayudar a los islotes se recuperan de la digestión enzimática, grupos culturales de 40 islotes en un 25 cm placa de Petri con 6 ml de RPMI cultura de los medios (10 mM glucosa) a 37 ° C, 5% / 95% de CO 2 / O 2 durante 2 días antes en directo las células beta de imágenes 2-fotón. Cambie el medio de cultivo a diario. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Vivo Cell 2-Photon imágenes <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Extracelular Buffer <ol><li> Preparar el tampón extracelular de sodio rico para el ensayo 2-fotón con NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 y 10 mM HEPES. </li></ol></li><li> Extracelular Tinte <ol><li> Para el ensayo de 2 fotones, preparar social SRB 8 mM en tampón extracelular, alícuota en pequeños tubos y almacenar a -20 ° C. Diluir el Stock SRB 1:10 en tampón extracelular fresco para obtener una concentración de trabajo de 0,8 mM. </li></ol></li></ol></li><li> Imágenes de fotones <ol><li> En primer lugar, pre-incubar 2-día islotes cultivados en 3 mM de tampón extracelular de glucosa durante 30 min. NOTA: Nosotros usamos islotes entre 2 y 5 días en cultivo. </li><li> Luego, colocar una lámina de vidrio en la cámara de control térmico montado en la platina del microscopio. Utilice grasa para evitar la filtración de solución. </li><li> Cubra la cámara con 500 l de extracelulartampón ular que contiene 0,8 mM SRB con diferentes concentraciones de glucosa (3 mm, 6 mm, 15 mm y glucosa 20 mM). </li><li> A continuación, colocar el islote pre-incubado en el centro de la cámara y se centran en 3-4 capas de células en el islote donde, en los islotes de roedores, la inmunotinción para la insulina muestra que la mayoría de las células son células beta. NOTA: El SRB será delinear toda la membrana de la célula del islote de forma rápida y el islote está listo para la imagen. </li><li> Utilice un microscopio 2-fotón con un objetivo de inmersión en aceite 60X (NA 1,42) y el software de formación de imágenes (por ejemplo., Scanimage 11). La figura 4 ilustra una disposición típica microscopía. Imagen eventos exocytic utilizando SRB como una membrana impermeable fluorescente marcador extracelular excitados por pulsos láser de femtosegundo a 880 nm, con fluorescencia detectados a 550-650 nm. Anote las respuestas de los islotes a la estimulación. </li><li> Identificar eventos exocytic individuales por la aparición repentina de una pequeña mancha fluorescente (resolución de 10 píxeles /1; m) y confirmar con la fase de rápido aumento de la señal fluorescente sobre una región de interés (~ 0,78 m 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El factor más crítico en el aislamiento de islotes es la perfusión inicial del páncreas; un bajo perfundido páncreas resultados con un rendimiento de islotes considerablemente menor. Otros factores también afectan a la calidad de aislamiento tales como el tiempo de digestión y el nivel de agitación que podría compensar en parte el nivel de perfusión. Por ejemplo, tendrá que ser incubaron a 37 ° C durante ~ 18 min 30 sec mientras se agitaba suavemente, en un contraste bajo digerido páncreas pueden requerir ~ 20 min más d...

El papel de la disfunción de las células beta en la enfermedad ha sido ampliamente reconocida 3,4. Las líneas celulares como el MIN6 e INS-1 son herramientas útiles para entender la biología del comportamiento de las células beta. Sin embargo, el control fisiológico de la secreción de insulina tiene lugar dentro de los islotes de Langerhans. Estos islotes contienen miles de células beta apretadas, así como los vasos sanguíneos y otros tipos de células endocrinas. Este entorno dentro del islote influye en la secreción de insulina y es probable que sea importante en la diabetes. Por lo tanto, para entender el control fisiológico de la secreción de insulina, y la fisiopatología de la enfermedad, es esencial para estudiar islotes intactos. Aislamiento Islet Islotes humanos vivos y, en particular, islotes humanos de los pacientes con diabetes tipo 2 son difíciles de obtener. Además, islotes humanos tienen limitadas posibilidades de manipulación molecular experimental. Por lo tanto, los investigadores han empleado esdeja de animales y modelos animales de diabetes tipo 2. Uno de estos modelos de la enfermedad es el ratón db / db. Esta es una mutación espontánea que los modelos de la diabetes tipo 2 con una progresión fenotipo que se asemeja mucho a la enfermedad humana 5,6. El protocolo que aquí se presenta para el aislamiento de los islotes de los ratones db / db diabéticos tiene muchos pasos en común con otros grupos con algunas opciones de mejor rendimiento, depuración y mejora la supervivencia de los islotes. Imagen 2 de fotones El ensayo de 2 fotones de células vivas se describe aquí permite a los investigadores para cuantificar el número y evaluar las características de los gránulos individuales que contiene insulina de muchas células del diabético 7 y de tipo salvaje islotes 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td></td> <td>Roche-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>para preparar medios de aislamiento</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>para preparar medios cultivados</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>para preparar medios cultivados&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>para preparar medios de cultivo</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>para diluir la liberasa</td></tr><tr><td>Programa Metamorph</td><td>Molecular Devices, EE. UU.</td><td></td><td>para analizar las imágenes de 2 fotones</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; modelo de ratón de la diabetes tipo 2: el aislamiento de los islotes pancreáticos y células en vivo 2-photon imágenes de islotes intactos

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

La diabetes tipo 2 es una enfermedad crónica que afecta a 382 millones de personas en 2013, y se espera que aumente a 592 millones en 2035 1. Durante las últimas 2 décadas, el papel de la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 se ha establecido claramente 2. Progreso de la investigación ha requerido métodos para el aislamiento de islotes pancreáticos. El protocolo del aislamiento de islotes presenta aquí comparte muchos pasos comunes con protocolos de otros grupos, con algunas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes aislados de tanto el tipo silvestre y db Lepr diabéticos (db / db) ratones. Un método de formación de imágenes 2-fotón de células vivas se presenta entonces que se puede utilizar para investigar el control de la secreción de insulina en islotes.

Rendimiento de los islotes y purificación Para un tipo salvaje ratón normal, se espera que unos 200 islotes. Islotes sanos mirar brillante, forma redonda y tienen un borde liso. Un lote aislamiento digerido sobre-usualmente tiene islotes pequeños y difusos mientras que un lote bajo-digerido tiene menos islotes y células acinares adjunto islotes (Figura 3). Para los ratones db / db diabéticos, el rendimiento de los islotes y la apariencia depende de la progresión de la enferm...

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener islotes viables y vivos de ratones diabéticos LEP R DB, y evaluar la secreción de insulina a partir de células beta dentro de los islotes mediante imágenes de células vivas a fotones. Esto se logra primero preparando reactivos como la mezcla enzimática para la digestión del páncreas, el medio de cultivo para el crecimiento de islotes y el tampón extracelular para el ensayo de dos fotones. A continuación, se abre el abdomen de un ratón sacrificado y se inyecta la mezcla enzimática en el páncreas para digerir el órgano.Luego, los islotes se separan del digestivo pancreático y se cultivan. Finalmente, se utiliza microscopía de dos fotones para obtener imágenes de las fusiones individuales de gránulos de insulina en las células beta dentro del islote. En última instancia, este protocolo ayudará a los investigadores a comprender cómo se controla la secreción de insulina en la salud y la enfermedad.La principal mejora de la técnica de aislamiento de islotes es el uso de enzimas mixtas para aumentar el rendimiento y la viabilidad de los islotes. La técnica de imagen de dos fotones es actualmente el único método para registrar la secreción de insulina de múltiples células dentro de un islote intacto. Para preparar las enzimas destinadas al aislamiento de islotes pancreáticos, diluya un vial de cinco miligramos de hialuronidasa TL con 26 mililitros de DMEM, prepare la colagenasa tipo cuatro en tampón de Hank a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro, y complemente con las siguientes soluciones mixtas de hialuronidasa TL y colagenasa.En una proporción de cuatro a uno en volumen, alícuote la mezcla de enzimas en porciones de 2,5 mililitros cada una y almacénelas a menos 20 grados Celsius. Para preparar el medio de aislamiento RPMI en un matraz cónico grande que contenga un litro de agua, disuelva un vial de polvo RPMI 1 6 4 0 a temperatura ambiente y suplemente con dos gramos de bicarbonato de sodio y 4,02 gramos de hippies. Use hidróxido de sodio para ajustar el pH a 7,4, luego filtre, esterilice y almacene a cuatro grados Celsius.Prepare el medio de cultivo RPMI añadiendo 10 % FBS y 1 % de antibióticos al medio de aislamiento RPMI para imágenes de dos fotones. Prepare el tampón extracelular rico en sodio con los siguientes reactivos. Para preparar el colorante extracelular, prepare un stock de ocho milimolar de SRB, divida una alícuota del tampón extracelular en tubos pequeños y almacénelos a menos 20 grados Celsius.Para obtener una concentración de trabajo, utilice tampón extracelular fresco para diluir el SRB en una proporción de uno a diez. Después de sacrificar un ratón y rociar completamente el cuerpo del ratón con etanol al 70 % según el protocolo descrito en el texto, coloque al animal con la cabeza hacia y la cola alejada del cirujano. Realice dos cortes laterales largos a través de la piel abdominal y el peritoneo para formar una aleta en forma de V.Levante la aleta de la piel para descubrir toda la cavidad abdominal. Aparte el intestino y, con el tejido plegado, mantenga el hígado en su lugar para revelar el conducto biliar común. A continuación, coloque una pinza vascular en el ámpula de la pared del duodeno para impedir que las enzimas inyectadas ingresen al duodeno.Este es un paso importante que determina si las enzimas pancreáticas entran al reflujo del conducto pancreático, al sitio de inyección o al duodeno. Utilice una aguja de calibre 31 para canular el conducto biliar común cerca de la unión del conducto hepático común y el conducto cístico, dejando espacio para una segunda inyección. Si el páncreas no se perfunde la primera vez, inyecte lentamente aproximadamente dos mililitros de mezcla fría de enzimas en el conducto biliar común del ratón.Si la pinza está en la posición correcta, el páncreas se perfundirá rápidamente. Una vez que el páncreas haya sido perfundido, retire rápidamente el órgano, colóquelo en un frasco de vidrio e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante aproximadamente 19 minutos. Después de la incubación, detenga el proceso de digestión agregando aproximadamente 20 mililitros de medio de aislamiento frío.Agite suavemente el vial para desagregar el páncreas y viértalo a través de un tamiz T normal con un tamaño de poro de un milímetro hacia un tubo estéril de 50 mililitros. Utilice el medio de aislamiento para completar el volumen del tubo y centrifugue a 400 G y cuatro grados Celsius durante un minuto. Con la escisión, añada medio de aislamiento al paladar y disuélvalo.Luego, transfiera la suspensión a dos tubos de 15 mililitros y centrifugue por segunda vez. Después de aspirar el sobrenadante, añada seis mililitros de medio de separación celular por gradiente de densidad a cada tubo y mezcle mediante pipeteo o vórtex para resuspender. A continuación, por la pared de los tubos, añada cuidadosamente aproximadamente seis mililitros de medio de aislamiento encima del medio de separación por gradiente de densidad y centrifugue a 100 ×g y 4 grados Celsius durante 15 minutos.Con la separación, recolecte las capas superior, media e inferior en tres recipientes separados. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, use una pipeta para seleccionar manualmente los ocelos en los tres recipientes. La mayoría se encontrará en la capa media, lo que ayudará a los ocelos a recuperarse de la digestión enzimática.Prepare grupos de 40 islotes en placas de Petri de 25 centímetros con seis mililitros de medio de cultivo RPMI que contenga 10 milimolares de glucosa y cultive durante dos días. Cambie el medio diariamente para realizar imágenes de dos fotones como un ensayo indirecto para medir la secreción de insulina. Comience utilizando tres milimolares de glucosa en tampón extracelular para preincubar los islotes cultivados durante dos días.Durante 30 minutos, aplique grasa a la platina del microscopio para evitar fugas de la solución y monte una cámara de control térmico que contenga una laminilla de vidrio sobre la platina del microscopio. Luego, cubra la cámara con 500 microlitros de tampón extracelular que contenga 0,8 milimolar de SRB y diversas concentraciones de glucosa. A continuación, coloque el ojal previamente incubado en el centro de la cámara y enfoque a tres o cuatro capas celulares dentro del ojal.En los ojos de roedores, la tinción inmunohistoquímica para insulina muestra que la mayoría de las células son células beta. Luego, con el microscopio de dos fotones y un objetivo de inmersión en aceite de 60x, identifique eventos exoácidos individuales mediante la aparición repentina de un pequeño punto fluorescente. Finalmente, en el software de imagen de barrido, confirme un evento mediante la fase de aumento rápido de la señal fluorescente en una región de interés para un ratón de tipo silvestre.Se esperan aproximadamente 200 acinos utilizando el protocolo demostrado en este video. Los acinos sanos tienen un aspecto brillante, forma redondeada y un borde liso. En cambio, un lote aislado con digestión excesiva suele presentar acinos pequeños y borrosos, así como acinos con células asar adheridas.Aunque un lote sobredigerido presenta menos poros en el ensayo de dos fotones en respuesta a estímulos como glucosa o insulina de gránulos de potasio alto fusionados con la membrana plasmática, un SRB entra en los gránulos, lo que da como resultado la aparición de un punto fluorescente repentino, con un diámetro aproximado de 400 nanómetros. Durante el tiempo registrado, todos los eventos de exocitosis en respuesta al estímulo se identifican y se determinan la ubicación de los eventos, el momento de aparición, la duración y el tipo de fusión. Eventos como KISS y Run o fusión completa se caracterizan y son valiosos para evaluar cualquier defecto en la fusión de gránulos en modelos de diabetes tipo dos.Este método se utilizó para demostrar que el defecto en los islotes diabéticos de ratones DB DB es la pérdida de la fusión completa de los gránulos y no un cambio en la cinética de la fusión individual de los gránulos. Además, el factor más importante que influye en la disminución de la secreción de insulina en la enfermedad es la reducción en el número de células responsivas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la perfusión pancreática y la actuación de islotes a partir de ratones RDB, y también debería ser capaz de realizar los dos ensayos en islotes intactos para evaluar las respuestas secretoras.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

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En este video, describimos la imagen intravital de un páncreas de ratón a través de una ventana estabilizada para la visualización a largo plazo de la dinámica celular.

Imágenes intravitales: un método para la observación a nivel celular del páncreas de ratón a través de una ventana de imagen estabilizada

Este video muestra un método basado en imágenes para visualizar células beta trasplantadas que expresan luciferasa en un ratón diabético inmunodeficiente no obeso. La introducción de esplenocitos de un ratón diabético conduce a la destrucción progresiva de las células beta, confirmada visualmente por la disminución de la luminiscencia después de la introducción del sustrato.

Obtención de imágenes de células beta transgénicas en un ratón inmunodeficiente desafiado con esplenocitos diabéticos

Un nuevo enfoque de la combinación de trasplante intraocular y microscopía confocal permite longitudinal, no invasiva imágenes en tiempo real con una sola célula de resolución dentro de los tejidos...

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real

Se describe un protocolo para la visualización de exocitosis de la insulina en los islotes intactos usando pHluorin, una proteína verde fluorescente sensible al pH. Islotes aislados están infectados con adenovirus codificación pHluorin acoplado al carga vesícula del neuropéptido Y. Esto permite la detección de eventos de fusión de gránulos de insulina mediante microscopía confocal.

De neuropéptido Y-pHluorin de la proyección de imagen confocal: una técnica para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en islotes humanos y murinos intactos

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.

Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

Este estudio presenta la aplicación de rodajas de tejido pancreático vivo al estudio de la fisiología de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes.

Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo

Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprenda a aislar islotes pancreáticos de ratones Lepr db diabéticos y evaluar la secreción de insulina mediante microscopía de dos fotones en células beta vivas. Este protocolo avanza la investigación de la diabetes tipo 2.

Lepr Db Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos (Video) | JoVE Journal

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