De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos
24 de marzo de 2015
Este protocolo describe un ensayo qRT-PCR de alto rendimiento para el análisis de firmas de expresión de IFN de tipo I y III. El ensayo discrimina las diferencias de pares de bases individuales entre las transcripciones altamente similares de estos genes. A través del ensamblaje de lotes y el pipeteo robótico, los ensayos son consistentes y reproducibles.
El objetivo general de este procedimiento es preparar y ejecutar placas de ensayo de 384 pocillos para el análisis de alto rendimiento de un grupo de genes altamente homólogos, como los subtipos de interferón tipo uno y tres. Esto se logra preparando primero la dilución en serie estándar utilizada para ejecutar las placas de ensayo. A continuación, se preparan la sonda de cebado y las mezclas de material de trabajo sin control de plantilla utilizadas para hacer las placas.
A continuación, las placas de ensayo de 384 pocillos se preparan utilizando un pipeteador multicanal automatizado y se secan para su almacenamiento. Finalmente, se procesan y analizan las placas de ensayo de 384 pocillos. En última instancia, el ensayo RT PCR R cuantitativo en tiempo real de alto rendimiento se utiliza para definir las firmas de expresión de interferón en modelos de cultivo de tejidos, estudiando patógenos o en muestras clínicas en el contexto de enfermedades infecciosas o autoinflamatorias.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la PCR cuantitativa R dos, que utiliza sondas lineales estándar o cyberg green, es que la baliza molecular y las sondas fluorescentes de ácido nucleico de bloqueo se pueden utilizar para discriminar diferencias de pares de bases individuales entre secuencias muy similares después de la descongelación, el vórtice y la centrifugación breve de un esperma estándar y de salmón o S-S-D-N-A. Prepare la mezcla de agua SSD NA para los 17 juegos de dilución estándar mezclando 51 microlitros de S-S-D-N-A con 20,3 mililitros de agua. Dispense 190 microlitros de la mezcla de agua SS DNA al primer tubo de una tira de PCR de ocho tubos y 180 microlitros a los siguientes cinco tubos.
Realice una dilución de uno a 20 transfiriendo 10 microlitros del stock estándar de 50 Picomolar al tubo con 190 microlitros de vórtice de mezcla de agua S-S-D-N-A y centrifugar rápidamente. La tira de PCR realiza una dilución de uno a 10 transfiriendo 20 microlitros del tubo diluido más recientemente al siguiente tubo en el vórtice de la serie y centrifuga rápidamente la tira de PCR. Repita la dilución de uno a 10 hasta que el último tubo de la serie haya recibido el patrón.
Después de etiquetar hasta 17 tubos de dos mililitros, utilice una pipeta electrónica multicanal de 12,5 microlitros para añadir dos microlitros de S-S-D-N-A a cada tubo utilizando cebadores y sondas preparados según el protocolo de texto. Agregue el cebador directo, el cebador inverso y la sonda apropiados a cada cebador. Ajuste de sondas de tubo de material de trabajo para preparar el control sin plantilla o las mezclas de material de trabajo NTC.
Transfiera 14,3 microlitros de cada juego de sondas de cebador al tubo de mezcla de material de trabajo NTC apropiado de acuerdo con esta tabla. Después de la extracción de un Eloqua de los juegos de sondas de cebador necesarios para el material de trabajo NTC, se mezcla a 1,5 mililitros de agua para llevar el volumen final de cada tubo de material de trabajo del juego de cebadores a 1,7 mililitros. Para preparar una placa fuente de 96 pocillos de los juegos de sondas de cebador y mezclas NTC.
Coloque una nueva placa de 96 pocillos en un bloque de enfriamiento refrigerado de 96 pocillos y designe los pocillos con el juego de sondas de cebador o la mezcla NTC correctos utilizando una pipeta electrónica multicanal de 250 microlitros. Agregue 66 microlitros de agua a cada juego de sondas de cebado. El pozo dispensa 82,5 microlitros de agua a los cuatro pozos objetivo.
Dispense 27,5 microlitros de agua en cada mezcla anti C. A continuación, agregue 54 microlitros de las sondas de cebado correctas en el material de trabajo a las sondas de cebador designadas en la dispensación de pocillos. 67,5 microlitros del material del conjunto de trabajo de la sonda de cebador objetivo 17 para las sondas de cebador 17 objetivo designadas en los pozos.
Agregue 22.5 microlitros de la mezcla correcta de material de trabajo NTC a los pozos designados. A continuación, utilice un sello de placa adhesiva para sellar la placa de 96 pocillos y centrifugar durante un minuto a 700 Gs para asegurarse de que el contenido esté en el fondo de los pocillos con el adaptador de 96 pocillos. Coloque el plato en el mezclador de vórtice y mezcle a 1000 RP durante un minuto.
A continuación, centrifugar la placa a 700 Gs durante cinco minutos. Para preparar las placas de ensayo de 384 pocillos, encienda el pipeteador multicanal automatizado y haga doble clic en el icono del software para abrir el protocolo de fabricación de placas de ensayo de interferón para configurar la plataforma. Coloque una caja de puntas de pipeta completamente llena en la posición uno de la plataforma, la placa fuente de 96 pocillos en la posición cuatro y una nueva placa de 384 pocillos en la posición seis.
Comience la carrera presionando el botón de reproducción cuando se complete la carrera. Golpee suavemente la placa de ensayo de 384 pocillos sobre una superficie plana para asegurarse de que los fluidos estén en el fondo de los pocillos y aplique un sello de placa adhesiva después de girar la placa a 700 G durante un minuto. Retire el sello de la placa adhesiva.
Coloque la placa de ensayo de pocillos 384 en el secador de placas y coloque el colector de pocillos 384 directamente encima de los pocillos. Una vez que el contenido de las placas de ensayo de 384 pocillos esté seco. Aplique un nuevo sello de placa adhesiva, una etiqueta de papel de aluminio rápido y almacene en la oscuridad a cuatro grados centígrados hasta que se use para cargar y ejecutar la placa de ensayo.
Prepare dos mezclas de genes de limpieza o pozos HKG diluyendo dos microlitros de S-S-D-N-A en 84,9 microlitros de agua. A continuación, añada dos microlitros del SSD NA diluido de 11,8 microlitros de agua, 23 microlitros de mezcla maestra y 9,2 microlitros del juego correcto de sondas de cebador 20 XHKG en cada tubo HKG etiquetado, vórtice y centrifugar brevemente después de preparar las muestras y el CDNA de control positivo a 78,8 microlitros de mezcla maestra y 54,8 microlitros de agua a cada muestra de 24 microlitros y tubo de control positivo. Para preparar los patrones y las mezclas de pocillos NTC que se agregarán a una placa de ensayo seca de 384 pocillos, agregue 165 microlitros de agua a 275 microlitros de mezcla maestra en un tubo de 1,5 mililitros para la mezcla de pocillos NTC a 52,5 microlitros de agua por 52,5 microlitros de mezcla maestra en un tubo de 1,5 mililitros.
Retire una placa de ensayo de 384 pocillos seca previamente preparada a cuatro grados centígrados y centrifuga a 700 GS durante un minuto. Con la pipeta electrónica multicanal de 30 microlitros dispensa 7,5 microlitros de NTC. Mezcle bien a cada NTC.
Dispense bien seis microlitros de la mezcla estándar y 1,5 microlitros del estándar a cada patrón. A continuación, dispense 7,5 microlitros de la muestra a los pocillos designados con una pipeta electrónica multicanal de 12,5 microlitros. Dispensar 2,5 microlitros del cebador HKG, las mezclas de la sonda a los pocillos designados después de usar una película adhesiva óptica para sellar la placa y centrifusionar a 700 Gs durante un minuto en vórtice, la placa sellada de 384 pocillos en el mezclador de vórtice a 2, 600 RPM durante dos minutos y centrifugar a 700 queso durante cinco minutos.
Finalmente, coloque la placa de ensayo sellada en la máquina Q-R-T-P-C-R. Abra la plantilla para el diseño del ensayo y utilice las siguientes condiciones de reacción. Comience la ejecución, exporte y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto como se ve en esta figura, se analizaron las firmas de expresión de interferón de tipo uno y tres humanos en células mononucleares de sangre periférica o p BMC de seis donantes estimulados con ligandos de receptores tipo Toll.
Los datos se presentan como gráficos de radar en una escala logarítmica utilizando dos métodos de análisis, incluido el valor absoluto de CQ normalizado al gen de mantenimiento y el número de copias de la plantilla por microgramo de ARN total. Los datos muestran que las firmas de expresión de interferón humano provocadas por los agonistas de TLR son firmas de expresión específicas de ligando de los tipos uno y tres de interferón en Resus Maccas. En este experimento, también fueron específicos del ligando TLR, se estimularon las PBMC de tres donantes con tres ligandos durante tres horas.
La expresión del subtipo de interferón en las células no estimuladas al inicio del estudio fue baja, como se muestra aquí. Se expresó un número limitado de subtipos de interferón alfa en respuesta al LPS y al poli ico. Por el contrario, la expresión de interferón en respuesta a imiquimod fue alta y la expresión del subtipo fue una amplia expresión de interferón beta e interferón.
Lambda one fue mejorada por los tres agonistas de TLR En Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar, ejecutar y analyze. 3D cuatro placas de ensayo de pocillos para el análisis de alto rendimiento de un grupo de genes muy similares, como los subtipos de interferón tipo uno y tres.
Descripción general
Este protocolo describe un ensayo de qRT-PCR de alto rendimiento para analizar las firmas de expresión de IFN tipo I y III. El método permite discriminar diferencias de un solo par de bases entre transcritos altamente similares, asegurando resultados consistentes y reproducibles mediante procesos automatizados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Inmunología
Antecedentes
- Los interferones de tipo I y III son cruciales en la respuesta inmunitaria.
- Las técnicas de alto rendimiento mejoran el análisis de la expresión génica.
- Los métodos tradicionales pueden no distinguir eficazmente entre secuencias estrechamente relacionadas.
- La pipetación automatizada mejora la reproducibilidad y la eficiencia.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo robusto de qRT-PCR para el análisis de interferones.
- Permitir el estudio de la expresión génica en diversos contextos biológicos.
- Mejorar la precisión en la detección de variaciones de un solo par de bases.
Métodos Utilizados
- Preparación de diluciones seriadas estándar para placas de ensayo.
- Uso de balizas moleculares y sondas fluorescentes de ácido nucleico bloqueado.
- Pipeteo automático con multicanal para la preparación de placas de ensayo.
- Análisis de la expresión génica en cultivos de tejidos y muestras clínicas.
Resultados Principales
- Discriminación exitosa de las firmas de expresión de interferón.
- Alta reproducibilidad y consistencia en los resultados del ensayo.
- Capacidades mejoradas de detección en comparación con los métodos tradicionales.
- Aplicación en el estudio de enfermedades infecciosas y autoinflamatorias.
Conclusiones
- El ensayo desarrollado es una herramienta valiosa para el análisis de la expresión génica.
- Ofrece ventajas frente a los métodos existentes de PCR cuantitativa.
- Este enfoque puede facilitar la investigación en inmunología y campos relacionados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de subtipos de interferón es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos inmunomoduladores, donde la homología de secuencias entre los subtipos de IFN-α y las variantes de IFN-λ complica el perfilado de expresión. Este ensayo de qRT-PCR de alto rendimiento permite la discriminación cuantitativa y reproducible de diecisiete subtipos de IFN en un formato de placa de 384 pocillos, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicista y una mayor confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento. Al integrar sondas LNA y sondas tipo baliza molecular con pipeteo automatizado, el método ofrece un perfilado de expresión escalable y rentable para la aclaración de vías y la selección de carteras en investigaciones sobre enfermedades infecciosas y autoinflamatorias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la expresión de subtipos específicos de IFN en modelos estimulados por patógenos o relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Proporciona validación funcional del blanco mediante la discriminación precisa de diferencias de un solo par de bases en transcritos de IFN altamente homólogos.
- Valor predictivo: Apoya la confianza predictiva y la selección de carteras al ofrecer firmas cuantitativas de expresión que aclaran la activación de vías y las respuestas específicas a ligandos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la generación de datos confiables y reproducibles de expresión de IFN en cultivos de tejidos y muestras clínicas.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante pipeteo multicanal automatizado y secado de placas, lo que permite una evaluación consistente de compuestos.
- Escalabilidad: Facilita la preparación para cribado de alto rendimiento mediante el formato de placa de 384 pocillos y salidas cuantitativas adecuadas para campañas de identificación de compuestos líderes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta el perfilado de IFN en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante la medición de la expresión específica de ligandos en PBMC humanos primarios estimulados con ligandos de TLR.
- Alineación de Biomarcadores: Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al cuantificar las subtipos de IFN-β e IFN-λ cuya expresión se correlaciona con la activación inmunitaria en contextos infecciosos y autoinflamatorios.
- Avance Ajustado al Riesgo: Informa las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles sobre las firmas de expresión de interferones que reflejan el mecanismo de acción y la interacción con el blanco.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y los estudios mecanicistas preclínicos, proporcionando datos cuantitativos de expresión de IFN que respaldan la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación precisa de los subtipos de IFN-α e IFN-λ en modelos relevantes para la enfermedad.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante la preparación estandarizada y reproducible de placas y lecturas cuantitativas compatibles con flujos de trabajo de cribado de compuestos.
- Análisis: Proporciona valores absolutos de Cq normalizados respecto a genes de referencia y número de copias por microgramo de ARN, lo que permite comparaciones entre condiciones y la toma de decisiones basada en datos.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al medir la expresión de IFN específica del ligando en células inmunitarias humanas primarias, alineándose con estrategias de avance guiadas por biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para el perfilado de IFN en múltiples proyectos, reduciendo el desarrollo redundante de ensayos y mejorando la eficiencia del capital.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la discriminación precisa de subtipos de IFN y la reducción de la ambigüedad mecanicista en las vías de señalización de interferones.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante pipeteo automatizado, secado de placas y formato de 384 pocillos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías al permitir una evaluación temprana y cuantitativa de la modulación de la vía diana.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en firmas cuantitativas y reproducibles de expresión de IFN que reflejan el mecanismo y la relevancia para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de ensayos de qRT-PCR, optimización de sondas y manejo de dianas génicas altamente homólogas.
- Depende de sistemas automatizados de pipeteo multicanal, equipos para secado de placas e instrumentación de qRT-PCR con canales de detección compatibles.
- Necesita la estandarización entre equipos de secuencias de sondas, curvas patrón y protocolos de análisis de datos para obtener resultados reproducibles en diferentes centros.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir el ensayo a diferentes tipos de muestras (por ejemplo, PBMC, cultivo celular, especímenes clínicos), manteniendo la especificidad para los subtipos de IFN.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de patrones de transcritos de alta calidad y una cuidadosa optimización para evitar la reactividad cruzada entre los subtipos de IFN-α, a pesar de la especificidad de las sondas con LNA y sondas MB.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Preparation of Standard Serial Dilutions, Primer/Probe, and No Template Control Working Stock Mixes
3:18
Preparation of 384-well Assay Plates
5:47
Loading and Running the Assay Plate
8:13
Results: Analysis of Quantitative RT-PCR IFN Data
9:29
Conclusion
