La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

Este video demuestra un método para capturar la dinámica de reparación tisular en un microscopio estereoscópico mediante imágenes de lapso de tiempo. Esto se logra primero criando embriones de pez cebra hasta etapas larvales en las que la aleta caudal se ha desarrollado lo suficiente como para alcanzar un tamaño que permita realizar amputaciones fácilmente. Esto se consigue típicamente después de la eclosión.

El segundo paso consiste en amputar la aleta caudal utilizando una aguja de jeringa. El tercer paso es montar las larvas en una cámara de imagen y capturar una película de lapso de tiempo en un microscopio estereoscópico. El paso final es cuantificar la regeneración de la aleta caudal utilizando software de análisis de imágenes como Bit Plains S o el software de código abierto ImageJ. Hola. Mi laboratorio estudia la reparación de heridas y la regeneración de tejidos utilizando el pez cebra como modelo.

Hoy demostraremos un método que captura la dinámica de estos procesos en tiempo real mediante microscopía estereoscópica de campo claro. Hoy mostraremos un método que registra los procesos iniciales de la regeneración del tejido utilizando la aleta caudal de larvas de pez cebra. El método de imagen presentado ofrece la posibilidad de observar y analizar comportamientos a escala de tejido completo en un entorno microscópico sencillo, fácilmente adaptable a cualquier microscopio estereoscópico equipado con capacidades de lapso de tiempo.

Así que comencemos. Crianza de pez cebra hasta estadios larvales. La reparación de heridas en la aleta caudal puede observarse mejor tras las etapas de eclosión, ya que para ese momento la aleta caudal ya se ha desarrollado lo suficiente, y las amputaciones pueden realizarse fácilmente sin dañar la médula espinal ni otros tejidos.

En proximidad cercana, recolecte los huevos e incúbelos durante la noche en un incubador a 28 grados Celsius. A la mañana siguiente, retire los embriones muertos y enjuáguelos con medio embrionario que contenga solución salina al 0,03 % de acuario marino instantáneo. Si es necesario, agregue al recipiente medio embrionario con fenotiroxina al 0,003 % para evitar la pigmentación de las larvas.

Para esta demostración, dejamos que los embriones se desarrollen hasta dos días después de la fertilización en la incubadora, momento en el que las larvas han eclosionado de sus kons, antes de la preparación de la cámara de imagen. En este paso, proporcionamos dos métodos para construir la cámara de imagen. El método uno consiste en una cámara de imagen hecha de tubo de PVC o teflón de grado para agua potable, que se puede obtener en cualquier ferretería.

Utilice un tubo con un diámetro exterior de 25 milímetros y un diámetro interior de 20 milímetros, ya que este tamaño es adecuado para la fijación de cubreobjetos. Corte el tubo para obtener anillos de 10 milímetros de grosor lo más uniformes posible. Utilice papel de lija para suavizar los bordes y enjuáguelos con agua y etanol.

Deje secar al aire la cámara. El método dos consiste en utilizar ya sea una cámara de imágenes con fondo de vidrio mate tech y tapa de vidrio ya fabricada, o en elaborar una cámara de imágenes a partir de una pequeña placa de Petri. Para fabricar su propia cámara de imágenes, utilice una placa de Petri de 35 o 50 milímetros y perfore un orificio de 10 milímetros en la tapa.

A continuación, aplique grasa de silicona al exterior del cubreobjetos y fije un cubreobjetos cuadrado o redondo de 25 por 25 milímetros con la punta limpia de una pipeta para asegurar que el agar de montaje permanezca firmemente adherido. Durante el procedimiento de obtención de imágenes, fije una malla plástica fina al interior del cubreobjetos. Esto puede lograrse cortando la malla al tamaño del diámetro del anillo interno y luego recortando un rectángulo pequeño, aproximadamente tres veces el tamaño de las larvas, en el centro de la malla.

Montaje e imagen de las larvas antes de la lesión. Este paso es adecuado para la cuantificación posterior de la regeneración de la aleta. Primero, prepare una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5 % en medio de embrión para la inmovilización del espécimen, transfiriendo la larva anestesiada a la solución de agarosa que se ha mantenido a 42 grados Celsius.

En un bloque calefactor, transfiera las larvas con una gota de agros a un pequeño recipiente de Petri y coloque las larvas de lado. Utilizando una punta microcargadora con tapa, permita que el agros se solidifique y agregue la solución de trica. Proceda al microscopio estereoscópico que se usará más adelante.

Para la obtención de imágenes de lapso de tiempo, utilizamos un microscopio estereoscópico ZES Discovery V12 y el software Axio Vision para la demostración. Primero, ajuste la configuración del microscopio seleccionando el objetivo y la ampliación adecuados para la obtención de imágenes. Luego, seleccione el modo de detección de la cámara en el microscopio dentro del software Alvis.

Seleccione el modo en vivo para ver la larva en la pantalla. Abra la ventana de propiedades para detectar automáticamente el brillo y ajuste manualmente el contraste en la base de transiluminación del microscopio. Mueva las larvas fuera del campo de visión y seleccione la función de corrección de sombreado.

Para minimizar el ruido de fondo, coloque las larvas nuevamente en el campo de visión y tome una instantánea. Guarde la imagen para prepararse para la lesión. Retire las larvas de los aros raspando primero los aeros de la cabeza.

Esto permite que las larvas puedan salirse suavemente de los aros al tirar suavemente de la cabeza alejándola del resto del ensayo de amputación de aros. Prepare una placa de aros al 1,5 % utilizando solución salina de Instant Ocean. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque las larvas de lado sobre el aros solidificado y ampute la parte distal de la aleta caudal con una aguja de jeringa de calibre 23.

Montaje de las larvas para la obtención de imágenes de lapso de tiempo. Presentaremos dos métodos para la obtención de imágenes de lapso de tiempo. En el primer método, mostraremos cómo obtener imágenes de las larvas en el anillo de cámara tras el montaje de las larvas.

Retire cuidadosamente el agarosidificado que rodea la aleta caudal distal utilizando la punta de una pipeta microcargadora con tapa. Esto permite una adecuada cicatrización de la herida o regeneración del tejido. Sin restringir el tejido, evite lesionar repetidamente la aleta. Durante este procedimiento, elimine los restos no deseados que interfieran con el procedimiento de imagenología, reemplazando la solución antigua.

Con solución Trica fresca, aplique grasa de silicona en la parte superior de la cámara y llene el anillo de la cámara con solución Trica fresca. Coloque un portaobjetos de vidrio en la parte superior para sellar la cámara, método dos. En este método, le mostraremos cómo obtener imágenes de las larvas en una placa de Petri con tapa de vidrio.

Coloque las larvas sobre la tapa, la cubreobjetos y llene la tapa con solución trica. Raspe los agros de la aleta caudal.

A continuación, aplique grasa de silicona al borde superior de la cámara inferior y llene la cámara con solución de trica. Vierta cuidadosamente la solución de trica de la tapa e invierta la tapa para sumergir la larva en la solución de trica de la cámara inferior, lo cual puede hacerse con un ligero ángulo. Para evitar bolsas de aire, la cámara se sellará con grasa de silicona y se realizará una imagen de lapso de tiempo para asegurar que se mantenga una temperatura adecuada de 28 grados Celsius.

Monte una cámara de incubación calentada hecha de cartón y burbujas de plástico para aislamiento, y una cúpula eléctrica como la utilizada para la incubación de huevos de gallina, como fuente de calor. Coloque la cámara de incubación alrededor del microscopio y ajuste la temperatura a 28 grados Celsius. Durante aproximadamente 10 a 20 minutos, o hasta que la temperatura se haya estabilizado, abra la parte frontal de la cámara de incubación calentada y coloque la cámara de imagenización sobre el microscopio.

Colóquese con el cubreobjetos orientado hacia arriba, en dirección al objetivo. Posicione la aleta larval de manera que dos tercios del campo de visión permanezcan sin ocupar, para asegurar la captura del crecimiento y la regeneración de la aleta durante todo el procedimiento de adquisición de imágenes. Sin necesidad de reposicionar las larvas en la ventana de adquisición multidimensional de 60, seleccione en la pestaña Zack la opción de corte en modo Z stack y lapse de tiempo.

Seleccione el grosor de la rebanada y luego elija el modo de inicio y detención. Defina las posiciones superior e inferior de la pila en la tabla de lapsos de tiempo. Seleccione el intervalo y la duración de la película, y luego presione el botón de inicio para comenzar la grabación.

Durante la primera hora, revise los límites and Zack de las larvas. Si es necesario, reposicione las larvas con el tiempo, ya que es posible que se hayan desplazado debido al crecimiento o a diferencias en la composición del agros. Guarde el archivo al final de la grabación de lapse de tiempo y continúe con el análisis de datos del paso de posprocesamiento y cuantificación.

En esta sección, discutimos varias formas de analizar los datos generados por el método uno imas. Primero, explicaremos cómo determinar el crecimiento de las aletas con el software imas. Abra la película de lapso de tiempo en el software Amaris y guarde los archivos en el formato de archivo MRS.

Para mejorar el rendimiento del software, seleccione la vista ortogonal para mostrar la película como una proyección. Para medir la longitud de la aleta, seleccione la opción de agregar nuevos puntos de medición en la barra de herramientas superior izquierda. En la lista de configuración de valores estadísticos visibles, seleccione los valores estadísticos que se mostrarán en el modo de línea.

Bajo la pestaña de configuración, seleccione pares en las propiedades de las etiquetas, elija nombre y distancia para mostrar la distancia entre los puntos A y B junto a la línea de medición, cambie al modo de edición y mantenga presionado el botón de mayúsculas para seleccionar el primer punto en la aleta distal. Luego use la misma configuración para seleccionar el segundo punto en el extremo distal del no acorde. La distancia se mostrará en la imagen y se podrá exportar bajo la pestaña de estadísticas.

Al seleccionar el botón de disco Exportar todo en la parte inferior derecha. Como alternativa a la opción de puntos de medición, se puede utilizar el visor de cortes para medir distancias en el modo de vista de corte. Desplácese a una posición deseada y haga clic en la primera y segunda posición con el botón izquierdo del ratón; la distancia se mostrará.

Esta opción, sin embargo, no permite la exportación de datos. Ahora discutiremos brevemente cómo determinar el área de la aleta utilizando el software de código abierto ImageJ. Abra la película de lapse de tiempo en ImageJ utilizando un complemento que reconozca el formato de archivo de Zeiss Axio Vision.

Alternativamente, cargue una secuencia TIFF sin comprimir. Esto garantizará que la información del archivo se guarde; bajo analizar, seleccione establecer escala para definir la distancia en píxeles y la distancia conocida, si no se conserva en el archivo. Además, establezca la unidad de longitud en micrómetros.

En la barra de herramientas, seleccione la herramienta de selección a mano alzada y trace el contorno de la herida manteniendo presionado el botón izquierdo del ratón. Mientras dibuja a lo largo de los bordes de la herida.

Haga clic en la opción de medición bajo analizar para mostrar el área de los resultados representativos de la herida. La amputación de la aleta provoca una regeneración parcial durante el transcurso de 36 horas posteriores a la amputación. Las mediciones del área de la aleta muestran que la amputación de la aleta provoca una disminución del tejido de la aleta hasta aproximadamente 14 horas posteriores a la amputación, posiblemente debido a la muerte celular, seguida luego por una leve regeneración longitudinal.

La comparación entre la aleta amputada y la regenerada muestra un aumento de 2,48 veces en la longitud de la aleta dentro de las 36 horas. La amputación inicialmente desencadena un efecto de cordón de bolsa, caracterizado por contracciones mediante cables de actina-miosina que están presentes en las células del pliegue de la aleta, las cuales se extruyen desde la herida de amputación y posteriormente se eliminan. La longitud del cuerpo aumenta inicialmente, pero la aleta no regenera.

Durante las fases iniciales. Aproximadamente 14 horas después de la amputación, la aleta comienza a crecer desde posiciones proximales hasta distales. En resumen, nuestros resultados demuestran que la amputación desencadena la contracción de la herida, lo que podría ser esencial para promover la extrusión celular.

Una vez completado el proceso, comienza la regeneración de la aleta. Aparece el crecimiento de desarrollo de la aleta. Independientemente de este proceso, hemos presentado un método que permite la observación de los procesos dinámicos de reparación de tejidos utilizando larvas vivas de pez cebra.

Este procedimiento requiere ciertos aspectos que hemos probado con el fin de optimizar el resultado. Una ventaja clara del método de imagen presentado es que se adapta fácilmente a cualquier microscopio estereoscópico equipado con una cámara CCD y software TimeLapse. También ofrece una alternativa de bajo costo frente al sistema de imagen confocal más costoso.

Aunque este método no utiliza fluorescencia ni detección celular, puede ampliarse para tales aplicaciones mediante el uso de un sistema automatizado para el control de fragmentación y software de desconvolución posterior a la obtención de imágenes, lo que permite observar con mayor detalle los procesos de reparación y regeneración de heridas con resolución subcelular. Este método puede proporcionar a los estudiantes una comprensión más profunda de los procesos biológicos básicos subyacentes a la reparación y regeneración de tejidos. La transparencia óptica, la facilidad de uso de los peces cebra embrionarios y larvales, y la adaptabilidad del sistema a cualquier microscopio estereoscópico lo hacen adecuado para enseñar biología básica de vertebrados en un entorno de aula.