La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

Este video muestra un método para capturar la dinámica de reparación de tejidos en un microscopio estereoscópico utilizando imágenes de lapso de tiempo. Esto se logra primero criando los embriones de pez cebra a las etapas larvales cuando la aleta caudal se ha desarrollado lo suficiente hasta un tamaño en el que las amputaciones se pueden realizar fácilmente. Por lo general, esto se logra después de la eclosión.

El segundo paso es amputar la aleta caudal con una aguja de jeringa. El tercer paso es montar las larvas en una cámara de imágenes y capturar una película de lapso de tiempo en un microscopio estereoscópico. El paso final es cuantificar la regeneración de la aleta caudal utilizando software de análisis de imágenes como Bit Plains S o el software de código abierto J.Hi.My estudios de laboratorio, reparación de heridas y regeneración de tejidos utilizando el pez cebra como modelo.

Hoy demostraremos un método que captura la dinámica de estos procesos en tiempo real utilizando microscopía estereoscópica de campo claro. Hoy demostraremos un método que captura los primeros procesos de regeneración de tejidos utilizando la aleta caudal de la larva de pez cebra. El método de imagen presentado ofrece la oportunidad de observar y analizar el comportamiento de las incrustaciones de tejido completo en un entorno de microscopio sencillo, que es fácilmente adaptable a cualquier microscopio estereoscópico equipado con capacidades de lapso de tiempo.

Así que comencemos. Crianza del pez cebra a las etapas larvarias. La reparación de heridas en la aleta caudal se puede observar mejor después de las etapas de eclosión, ya que la aleta caudal se ha desarrollado lo suficiente en este momento, y las amputaciones se pueden realizar fácilmente sin dañar la médula espinal u otros tejidos.

En las proximidades, recoja los huevos e incubelos en una incubadora a 28 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, retire los embriones muertos y enjuague con un medio embrionario que contenga una solución instantánea de sal de acuario oceánico al 0,03%. Si es necesario, agregue medio embrionario con 0.003% de fenotiroides, al plato para evitar la pigmentación de las larvas.

Para esta demostración, dejamos que los embriones se desarrollen hasta dos días después de la fertilización en la incubadora, cuando las larvas han eclosionado de su preparación de kons de la cámara de imágenes. En este paso, proporcionamos dos métodos para construir la cámara de imágenes. El método uno consiste en una cámara de imágenes hecha de tubería de PVC o teflón de grado de agua potable, que se puede obtener en cualquier ferretería.

Utilice un tubo con un diámetro exterior de 25 milímetros y un diámetro interior de 20 milímetros, ya que tiene el tamaño adecuado para la fijación del cubreobjetos. Corta el tubo para hacer anillos de 10 milímetros de grosor lo más uniformes posible. Use papel de lija para alisar los bordes y enjuague con agua y etanol.

Deje que la cámara se seque al aire. El método dos consiste en utilizar un fondo de vidrio técnico mate prefabricado, una cámara de imágenes con parte superior de vidrio o hacer una cámara de imágenes a partir de una pequeña placa de Petri. Para hacer su propia cámara de imágenes, utilice una placa de Petri de 35 o 50 milímetros y perfore un orificio de 10 milímetros en la tapa.

A continuación, aplique grasa de silicona en el exterior del cubreobjetos y fije un cubreobjetos cuadrado o redondo de 25 por 25 milímetros al exterior con una punta de pipeta limpia para garantizar que los agros de montaje permanezcan firmemente sujetos. Durante el procedimiento de diagnóstico por imágenes, coloque una malla de plástico fina en el interior del cubreobjetos. Esto se puede lograr cortando la malla del tamaño del diámetro del anillo interior y luego cortando un pequeño rectángulo de aproximadamente tres veces el tamaño de las larvas en el centro de la malla.

Montaje e imagen de las larvas previas a la lesión. Este paso es adecuado para la cuantificación posterior de la regeneración de aletas. En primer lugar, se prepara una agro solución de bajo punto de fusión al 0,5% en medio embrionario para la inmovilización del espécimen transfiriendo la larva anestesiada a la solución de aro que se ha mantenido a 42 grados centígrados.

En un bloque calefactor, transfiera las larvas con una gota de agros a una pequeña placa de Petri y coloque las larvas de lado. Con una punta de micro cargador tapada, permita que los aros se solidifiquen y agregue la solución de trica. Proceda con el microscopio estereoscópico que se utilizará más adelante.

Para la obtención de imágenes de lapso de tiempo, utilizamos un microscopio estereoscópico zes discovery V 12 y el software de visión Axio para la demostración. En primer lugar, ajuste la configuración del microscopio seleccionando el objetivo y el aumento adecuados para la obtención de imágenes. A continuación, seleccione el modo de detección de la cámara en el microscopio en el software alvis.

Seleccione el modo en vivo para ver la larva en la pantalla. Abra la ventana de propiedades para detectar automáticamente el brillo, ajustar manualmente el contraste en la base de transiluminación del microscopio. Mueva las larvas fuera del campo de visión y seleccione la función de corrección de sombreado.

Para minimizar el ruido de fondo, vuelva a colocar las larvas en el campo de visión y tome una instantánea. Guarde la imagen para prepararse para las heridas. Retire las larvas de los aros raspando primero los aeros de la cabeza.

Esto permite que las larvas puedan deslizarse fuera del aeros tirando suavemente de la cabeza lejos del ensayo de amputación aeros restante. Prepare un plato de aeros al 1,5% con una solución instantánea de sal oceánica. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque las larvas de lado sobre el aros solidificado y ampute la parte distal de la aleta caudal con una aguja de jeringa de calibre 23.

Montaje de las larvas para la obtención de imágenes de lapso de tiempo. Presentaremos dos métodos de imagen de lapso de tiempo. En el primer método, mostraremos cómo obtener imágenes de las larvas en el anillo de la cámara después del montaje de las larvas.

Raspe con cuidado los agros solidificados que rodean la aleta caudal distal con una punta de pipeta de microcargador tapada. Esto permite la cicatrización adecuada de las heridas o la regeneración de los tejidos. Sin restringir el tejido, trate de no lesionar la aleta repetidamente. Durante este procedimiento, elimine los residuos no deseados que interfieran con el procedimiento de diagnóstico por imágenes de la cámara reemplazando la solución vieja.

Con una solución fresca de Trica, aplique grasa de silicona en la parte superior de la cámara y llene el anillo de la cámara con solución de Trica fresca. Aplique un portaobjetos de vidrio en la parte superior para sellar la cámara, método dos. En este método, le mostraremos cómo obtener imágenes de las larvas en una placa de Petri con tapa de vidrio.

Monte las larvas en la tapa, cubra el cubreobjetos y llene la tapa. Con solución trica. Raspe los agros de la aleta de la cola.

A continuación, aplique grasa de silicona en el borde superior de la cámara inferior y llene la cámara con solución de trica. Decanta con cuidado la solución trica de la tapa y dale la vuelta para sumergir la larva en la solución trica de la cámara inferior, lo que se puede hacer en un ligero ángulo. Para evitar bolsas de aire, la cámara se sellará con la imagen de lapso de tiempo de grasa de silicona para garantizar que se mantenga una temperatura adecuada de 28 grados centígrados.

Ensamble una cámara de incubación calentada hecha de plástico de burbujas de cartón para el aislamiento y una cúpula cableada como la que se usa para la incubación de huevos de gallina como fuente de calor. Coloque la cámara de incubación alrededor del microscopio y ajuste la temperatura a 28 grados centígrados. Durante unos 10 a 20 minutos o hasta que la temperatura se haya estabilizado, abra la parte delantera de la cámara de incubación calentada y coloque la cámara de imágenes en el microscopio.

Párese con la cubierta hacia arriba, hacia el objetivo. Coloque la aleta larvaria de manera que dos tercios del campo de visión permanezcan desocupados para asegurar la captura del crecimiento y la regeneración de la aleta en el transcurso del procedimiento de imagen. Sin tener que reposicionar las larvas en la ventana de adquisición multidimensional de 60 del software, seleccione la opción de pila Z y lapso de tiempo en el modo de pestaña y corte de Zack.

Seleccione el grosor de la rebanada y, a continuación, seleccione el modo de parada de inicio. Defina las posiciones superior e inferior de la pila en la tabla de lapso de tiempo. Seleccione el intervalo y la duración de la película y, a continuación, pulse el botón de inicio para comenzar la grabación.

Dentro de la primera hora, verifique los límites y Zack de las larvas. Si es necesario, vuelva a colocar las larvas con el tiempo, ya que puede haber cambiado debido al crecimiento o a las diferencias en la composición de los agros. Guarde el archivo al final de la grabación de lapso de tiempo y proceda con el análisis de datos de la etapa de posprocesamiento y cuantificación.

En esta sección, discutimos varias formas de analizar los datos generados por el método uno imas. Primero, discutiremos cómo determinar el crecimiento de las aletas con el software imas. Abra la película time-lapse en el software Amaris y guarde los archivos en el formato de archivo MRS.

Para mejorar el rendimiento del software, seleccione la vista ortogonal para mostrar la película como una proyección. Para medir la longitud de la aleta, seleccione la opción agregar nuevos puntos de medición en la barra de herramientas superior izquierda. En Configurar lista de valores de estadísticas visibles, seleccione los valores de estadísticas que se mostrarán en el modo de línea.

En la pestaña de configuración, seleccione pares en las propiedades de las etiquetas, seleccione el nombre y la distancia para mostrar la distancia entre los puntos A y B junto a la línea de medición, cambie al modo de edición y mantenga presionado el botón Mayús para seleccionar el primer punto en la aleta distal. A continuación, utilice la misma configuración para seleccionar el segundo punto en el extremo distal de la no concordancia. La distancia se mostrará en la imagen y se puede exportar en la pestaña de estadísticas.

Al seleccionar el botón de disco, exporte todo en la parte inferior derecha. Como alternativa a la opción de puntos de medición, se puede utilizar el visor de cortes para medir distancias en el modo de vista de cortes. Desplácese hasta la posición deseada y haga clic en la primera y segunda posición con el botón izquierdo del ratón, se mostrará la distancia.

Esta opción, sin embargo, no permite la exportación de datos. Ahora discutiremos brevemente cómo determinar el área de la aleta utilizando el software de código abierto. Imagen J.Abra la película TimeLapse en la imagen J usando un complemento que reconozca el formato de archivo de visión Zeiss Axio.

Alternativamente, cargue en una secuencia TIFF sin comprimir. Esto asegurará que la información del archivo se guarde en analizar seleccionar establecer escala para definir la distancia y los píxeles y la distancia conocida, si no se conserva en el archivo. Además, establezca la longitud de la unidad en micrómetros.

En la barra de herramientas. Seleccione la herramienta de selección a mano alzada y delinee la herida manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón. Mientras dibuja a lo largo de los bordes de la herida.

Haga clic en la opción de medición en analizar para mostrar el área de los resultados representativos de la herida. La amputación de la aleta conduce a una regeneración parcial en el transcurso de las 36 horas posteriores a la amputación. Las mediciones del área de la aleta muestran que la amputación de la aleta desencadena una disminución en el tejido de la aleta hasta aproximadamente 14 horas después de la amputación, presumiblemente debido a la muerte celular, que es seguida por una delgada longitud de regeneración.

La comparación de la aleta amputada y regenerada muestra un aumento de 2,48 veces en la longitud de la aleta en 36 horas. La amputación desencadena inicialmente un efecto de cuerda de bolsa caracterizado por contracciones a través de cables de actina miosina que están presentes en el pliegue de la aleta, las células se extruyen de la herida de amputación y posteriormente se eliminan. La longitud del cuerpo aumenta inicialmente, pero la aleta no se regenera.

Durante las primeras fases. Aproximadamente 14 horas después de la amputación, la aleta comienza a crecer desde posiciones proximales a distales. En resumen, nuestros resultados demuestran que la amputación desencadena la contracción de la herida, que puede ser esencial para promover la extrusión celular.

Una vez que se completa el proceso, la aleta comienza a regenerarse. Parece ocurrir el crecimiento de las aletas de desarrollo. Independientemente de este proceso, hemos presentado un método que permite observar los procesos dinámicos de reparación de tejidos utilizando larvas vivas de pez cebra.

Este procedimiento requiere ciertos aspectos que hemos probado para optimizar el resultado. Una clara ventaja del método de imagen presentado es que es fácilmente adaptable a cualquier microscopio estereoscópico equipado con una cámara CCD y software TimeLapse. También ofrece una alternativa de bajo costo al sistema de imágenes confocales más caro.

Si bien este método no utiliza fluorescencia ni detección de células, se puede ampliar para tales aplicaciones utilizando un sistema automatizado para el control de roturas y el software de deconvolución posterior a la obtención de imágenes para observar más a fondo los procesos de reparación y regeneración de heridas con resolución subcelular. Este método puede proporcionar a los estudiantes una mejor comprensión de los procesos biológicos básicos, la reparación y regeneración de tejidos subyacentes. La claridad óptica y la facilidad con la que se pueden utilizar los peces cebra embrionarios y larvales y la adaptabilidad del sistema a cualquier microscopio estereoscópico lo hacen adecuado para la enseñanza de la biología básica de las vértebras en el aula.