Name: Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a utilizar el ensayo de formación de colonias en agar blando para evaluar la tumorigenicidad en células de cáncer de mama. Este método permite cuantificar el efecto del inhibidor BB-Cl-amidine sobre la proliferación celular in vitro.

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Estamos agradecidos al Dr. Richard Cerione, al Dr. Marc Antonyak y Kelly Sullivan, de la Universidad de Cornell, por proporcionar asesoramiento técnico, y a la Dra. Gerlinde Van de Walle, de la Universidad de Cornell, por compartir su microscopio invertido Olympus CKX41.

1. Preparación de 3% 2-hidroxietil agarosa <ol><li> En un frasco de vidrio de 100 ml limpio y seco, añadir 0,9 g de 2-hidroxietilo agarosa (Agarosa VII) seguido de 30 ml de agua destilada. </li><li> Microondas la mezcla durante 15 segundos y suavemente remolino. Repita este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarosa se disuelve totalmente. </li><li> Autoclave la botella que contiene solución durante 15 min. </li><li> Deje que la solución de agarosa se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso posterior. Guarde la solución a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparación de la capa inferior: 0,6% en gel de agarosa <ol><li> Pre-caliente varias 5 ml y 10 ml pipetas en una incubadora a 37 ° para evitar que la agarosa se solidifique en la pipeta durante la manipulación. </li><li> Parcialmente aflojar la tapa de la botella y microondas la solución de agarosa pre-hechos 3% 2-hidroxietil durante 15 s. Luego, agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al girar el agarosolución en sí porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede extenderse. </li><li> Si hay gel sólido residual en la botella, microondas durante unos segundos más. </li><li> Mantenga el frasco que contiene la solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C durante los próximos pasos para prevenir la solución de agarosa se solidifique antes de tiempo. </li><li> Medios MCF10DCIS caliente en un 37 ° C baño de agua. Nota: los medios de comunicación MCF10DCIS consta de DMEM / F12, 5% de suero de caballo, 5% de penicilina estreptomicina. </li><li> Transferencia de 3 ml de la solución de agarosa al 3% utilizando las pipetas pre-calentado en un tubo cónico de 50 ml estéril. </li><li> Añada inmediatamente 12 ml de medio MCF10DCIS cálidos e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Trate de no formar las burbujas, ya que interfiere con la colonia contar después. </li><li> Añadir con cuidado 2 ml de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos sin formar burbujas de aire. </li><li> Incubar el 6 pocillos horizonta placa de cultivoLLY sobre una superficie plana a 4 ° C durante 1 hora para permitir que la mezcla se solidifique. </li><li> Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 30 min. La capa inferior está ahora listo para su uso. </li></ol> 3. Preparación de la capa que contiene Cell-: 0,3% en gel de agarosa <ol><li> Células trypsinize MCF10DCIS y diluir a una concentración de células de 4 x 10 4 / ml. </li><li> Tome 2 ml de la agarosa 3% utilizando pipetas pre-calentado y transferir a un tubo cónico de 50 ml estéril. </li><li> Inmediatamente añadir 8 ml de medio MCF10DCIS al tubo cónico e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios. Evite la formación de burbujas. </li><li> Tome 2 ml de las células MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) y tratar con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM). </li><li> En una dilución 1: 1, mezclar las células con la agarosa 0,6%. </li><li> Tomar 1 ml de la mezcla de células de agarosa y agregar suavemente sobre la capa inferior de la 6-p pocillo de cultivotardías (2 x 10 4 células / ml). </li><li> Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la capa superior se solidifique. </li><li> Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37 ° durante una semana antes de añadir la capa de alimentación. </li></ol> 4. Preparación de la capa de alimentación: 0,3% en gel de agarosa <ol><li> Microondas el 2-hidroxietil solución de agarosa pre-hechos del 3% durante 15 s. agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg. </li><li> Equilibrar la botella de solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C. </li><li> Calentar los medios MCF10DCIS en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Mezclar 1 ml de solución de agarosa al 3% con 9 ml de medio MCF10DCIS caliente en un tubo cónico de 50 ml e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Tratar la mezcla con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM). </li><li> Añadir suavemente 1 ml de esta mezcla (sin paraming burbujas) en cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene la parte inferior y capas blandas. </li><li> Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la mezcla se solidifique. </li><li> Después de la capa de alimentación solidifica, coloque la placa en una incubadora a 37 °. </li><li> Repita este procedimiento de alimentación semanal mediante la superposición de 1 ml de solución de agarosa / medio / tratamiento de 0,3% en la capa de alimentación existente para reponer las células con nuevos medios de comunicación hasta que se observa la formación de colonias. Nota: Agar en las capas blandas y el alimentador es muy suave y, por lo tanto, los nutrientes añadidos de la capa de alimentación se difundirán fácilmente en la capa que contiene la célula a llegar a las células. </li></ol> 5. Recolección de Datos <ol><li> Después de 2,5 semanas de crecimiento celular en el agar suave, contar el número de colonias en cada pocillo utilizando un microscopio de luz. Para facilitar la cuantificación, imprima una rejilla sobre una transparencia y adjuntar la red a laPlaca de 6 pocillos para ayudar a localizar donde las células son durante el conteo. Desde tamaño de la colonia (cuantificada por el diámetro de cada colonia) variará, predefinir un tamaño de la colonia de referencia para determinar qué colonias se marcarán. Por ejemplo, incluir tamaños de colonia de 70 micras o más grande en el análisis de datos. </li><li> Almacenar las muestras a 4 ° C para evitar una mayor formación de colonias y para el recuento futuro. Selle la placa de cultivo de 6 pocillos con Parafilm para evitar que los geles se sequen. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La tasa de formación de colonias en agar blando varía dependiendo del tipo de célula 9. Por lo tanto, el número de células para iniciar con debe ser optimizado y ajustado en consecuencia. Una gama de partida sugerido es de entre 5 x 10 02 al 01 x 10 4 células por pocillo utilizando una placa de 6 pocillos. Además, tamaño de las colonias varía en función de la tasa de crecimiento de cada célula. Por lo tanto, se necesita un predefinido un punto de corte para el tamaño de colonia para anot...

Tanto las células no transformadas (normales) como las transformadas pueden proliferar fácilmente en un cultivo monocapa 2D. Esta forma de crecimiento celular adherente es bastante diferente de la que ocurre in vivo donde, en ausencia de estimulación mitogénica, las células no suelen dividirse rápidamente dentro de su microambiente. Por otro lado, el ensayo de agar blando se distingue de los sistemas de cultivo 2D porque cuantifica la tumorigénesis midiendo la capacidad de una célula para proliferar y formar colonias en suspensión dentro de un gel de agarosa semisólido1. En este contexto, las células no transformadas no pueden propagarse rápidamente en ausencia de anclaje a la matriz extracelular (MEC) y sufren apoptosis, un proceso conocido como anoikis. Por el contrario, las células que han sufrido una transformación maligna pierden su dependencia de anclaje debido a la activación de vías de señalización como la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Akt y Rac/Cdc42/PAK. Por lo tanto, estas células son capaces de crecer y formar colonias dentro de la matriz de agar blando semisólido2.
Un uso común del ensayo de agar blando es probar si compuestos específicos, como los inhibidores de PADI, son capaces de suprimir el crecimiento tumoral in vitro. En general, el recuento de colonias o el tamaño de las colonias son lecturas cuantitativas del ensayo que se pueden comparar entre los grupos de control y tratamiento para evaluar las diferencias en la tumorigénesis celular. Por lo tanto, si se encuentra que la formación de colonias está inversamente correlacionada con el aumento de la concentración del fármaco, entonces se podría llegar a la conclusión de que el fármaco es un inhibidor eficaz de la tumorigénesis in vitro. Por otro lado, si el fármaco no afecta a la formación de colonias, el fármaco no está en la dosis adecuada o no es un inhibidor tumorigénico eficaz. Además de utilizar un ensayo de agar blando para probar el efecto antitumoral de un fármaco, este ensayo también se puede utilizar para sondear la relación entre un gen específico y la tumorigénesis. Por ejemplo, el efecto de la supresión de la expresión de PADI2 sobre la tumorigénesis puede abordarse mediante el tratamiento con siRNA específico de PADI2.
Las PADI son enzimas dependientes del calcio que modifican las proteínas después de la traducción convirtiendo los residuos de arginina cargados positivamente en citrulina cargada neutramente en un proceso conocido como citrulinación o deiminación3-5. Recientemente hemos descubierto que la peptidilarginina deiminasa 2 (PADI2) puede funcionar como un nuevo biomarcador de cáncer de mama y que los inhibidores de PADI representan terapias candidatas para los cánceres de mama en fase temprana6. Por ejemplo, hemos demostrado previamente que un inhibidor "pan-PADI", Cl-amidina, suprime la proliferación de células de cáncer de mama utilizando monocapas 2D y que el inhibidor suprime el crecimiento de esferoides tumorales 3D6. En este informe, ampliamos estos estudios y destacamos la utilidad del ensayo de agar blando, al probar la eficacia de un nuevo inhibidor de PADI, BB-CLA, en la supresión del crecimiento de MCF10DCIS colonias de cáncer de mama7. Observamos que utilizamos células MCF10DCIS para este experimento porque son derivados oncogénicos de células MCF10A humanas no transformadas y porque contienen altos niveles de estado estacionario de la proteína PADI28. Nuestra hipótesis es que la actividad enzimática de PADI2 desempeña un papel clave en la tumorigénesis de esta línea celular y que la inhibición de la actividad de PADI2 mediada por BB-CLA suprimirá la progresión del cáncer.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Microscopía Zeiss Microscopio</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>invertido</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donante Suero equino</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroxietilagirasa: Tipo VII, baja temperatura de gelificación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

utilización del ensayo soft agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Dadas las dificultades inherentes a la investigación de los mecanismos de progresión tumoral in vivo, los ensayos basados en células, como el ensayo de formación de colonias de agar blando (en lo sucesivo denominado ensayo de agar blando), que mide la capacidad de las células para proliferar en matrices semisólidas, siguen siendo un sello distintivo de la investigación del cáncer. Una ventaja clave de esta técnica sobre los ensayos convencionales de cultivo de células esferoides en 3D o monocapa en 3D es la imitación cercana del entorno celular 3D a la observada in vivo. Es importante destacar que el ensayo de agar blando también proporciona una herramienta ideal para probar rigurosamente los efectos de nuevos compuestos o condiciones de tratamiento sobre la proliferación y migración celular. Además, este ensayo permite la evaluación cuantitativa del potencial de transformación celular en el contexto de las perturbaciones genéticas. Recientemente identificamos la peptidilarginina deiminasa 2 (PADI2) como un potencial biomarcador y diana terapéutica del cáncer de mama. En este trabajo destacamos la utilidad del ensayo de agar blando para estudios preclínicos contra el cáncer al probar los efectos del inhibidor de PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), sobre la tumorigénesis de las células de carcinoma ductal humano in situ (MCF10DCIS).

El ensayo de formación de colonias en agar blando se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones que documentan la tumorigenicidad de las células cancerosas. Una ventaja principal de esta técnica es que la matriz semi-sólido favorece selectivamente el crecimiento de células que pueden proliferar en una manera independiente de anclaje. Este rasgo se exhibe principalmente por las células cancerosas, pero no por las células normales. Utilizamos principalmente esta técnica para probar la eficacia de inhibición del c...

Aquí, documentamos el uso del ensayo de formación de colonias de agar blando para probar los efectos de un inhibidor de la enzima peptidilarginina deiminasa (PADI), BB-Cl-amidina, sobre la tumorigénesis del cáncer de mama in vitro.

Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar cuantitativamente el efecto del tratamiento sobre la capacidad de las células para proliferar en matrices semisólidas, ya que una capacidad mejorada es un indicador clave de la genotoxicidad tumoral de las células. La genotoxicidad tumoral se mide mediante la capacidad de una célula para formar colonias dentro de un gel semisólido de AROS. Dado que las células no transformadas no pueden propagarse rápidamente en este entorno, el gel semisólido de AROS se prepara primero creando una capa inferior de 0,6 % AROS. A continuación, se añade una capa superior que contiene células en un gel de 0,3 % AROS por encima de la capa inferior.En este ensayo, las células experimentales se tratan con un inhibidor de la enzima peptidil, arginina, dase o pad desarrollado por el Dr. Subramanian. Cada semana se añade una capa adicional de alimento, que consiste en un gel de aros al 0,3 % con o sin tratamiento. El paso final consiste en contar el número de colonias mayores de 70 micrómetros para su análisis.Finalmente, se utiliza la microscopía invertida para mostrar la diferencia en el número de colonias entre el grupo control y el grupo tratado. Hola, me llamo Achi Huta. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Scott Kroos en el Instituto Baker para la Salud Animal.En la Universidad de Cornell, el ensayo de formación de colonias blandas de células tipo tigre puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como evaluar la tumorigenicidad de una amplia gama de células cancerosas en relación con su sensibilidad a fármacos, hormonas y múltiples condiciones de tratamiento. Comience este procedimiento preparando un 3% de dos hidroxietil aros en un frasco de vidrio limpio y seco de 100 mililitros. Añada 0,9 gramos de dos hidroxietil aros, seguido de 30 mililitros de agua destilada.Caliente la mezcla en el microondas durante 15 segundos y agítela suavemente. Repita este paso hasta que el polvo de AROS se disuelva completamente. A continuación, esterilice la solución en su frasco mediante autoclave durante 15 minutos.Deje que la solución de agros se enfríe hasta la temperatura ambiente. Antes de continuar, caliente previamente varias pipetas de cinco mililitros y de 10 mililitros en un incubador a 37 grados Celsius para evitar que el aros se solidifique dentro de la pipeta. Al manipularla parcialmente, afloje la tapa del frasco y caliente en el microondas la solución preelaborada de aro al 3% dos HIERROETIL durante 15 segundos.Luego, agite suavemente la solución y caliéntela en el microondas durante otros 15 segundos. Tenga cuidado al agitar la solución de ARO, ya que la solución asciende al exponerse al aire y puede derramarse si queda gel sólido residual en el frasco al calentarlo en el microondas. Durante los siguientes pasos, mantenga el frasco que contiene la solución de ARO en un baño de agua a 45 grados Celsius durante unos segundos más para evitar que la solución de agro se solidifique prematuramente.A continuación, transfiera 12 mililitros de medio calentado utilizando pipetas precalentadas a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Inmediatamente agregue tres mililitros de la solución al 3% de aros e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar el aros con el medio. Luego, agregue cuidadosamente dos mililitros de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos sin formar burbujas de aire.Incube la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados Celsius durante una hora para permitir que la mezcla se solidifique. Una vez que la mezcla se haya solidificado, coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos. La capa inferior ya está lista para su uso.Un aspecto difícil de este procedimiento consiste en asegurarse de que todas las células se distribuyan de manera uniforme y de que la capa de agar derretida no se solidifique antes de añadirla a cada pocillo, para garantizar que las seltz se mezclen en el medio antes de agregar el gel de agar líquido. Además, es necesario precalentar previamente las pipetas para evitar que las soluciones se solidifiquen durante su manipulación. Para preparar la capa que contiene las células, primero se trypsinizan las células MCF 10 DCIS y se diluyen a una concentración celular de 40.000 células por mililitro; luego, se toman ocho mililitros de medio utilizando pipetas precalentadas y se transfieren a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.Agregue inmediatamente dos mililitros de aros al 3 % al tubo cónico e inviértalo suavemente para mezclar los aros con el medio. Evite formar burbujas. A continuación, tome dos mililitros de las células y trátelos con dos micromoles de cloramina BB en DMSO o con DMSO solo como control; tras el tratamiento, mezcle las células con aros al 0,6 % en una dilución uno a uno para obtener una concentración final de un micromol de cloramina BB.Luego, tome un mililitro de la mezcla de células aros y añádalo suavemente sobre la capa inferior de la placa de cultivo de seis pocillos. Coloque la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados Celsius durante al menos 15 minutos para permitir que la capa superior se solidifique. Una vez que la mezcla se haya solidificado, coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante una semana antes de añadir la capa de alimentación.Comience la preparación de la capa de alimentación calentando en el microondas la solución preelaborada de agar al 3 % como antes, y equilibrando el frasco de solución de agar en un baño de agua a 45 °C. Mezcle un mililitro de solución de agar al 3 % con nueve mililitros de medio tibio en un tubo cónico de 50 mililitros e inviértalo suavemente para mezclar el agar con el medio. Evite formar burbujas de aire. Después de tratar la mezcla con cloramina BB, agregue cuidadosamente un mililitro de la mezcla en cada pocillo de la placa de cultivo de seis pocillos que contenga las capas inferior y blanda.Luego, coloque la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados Celsius durante al menos 15 minutos para permitir que la mezcla se solidifique. Después de que la capa de alimentación se solidifique, coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius. Bader, repita este procedimiento de alimentación semanalmente superponiendo un mililitro de solución de medio de agros al 0,3 % sobre la capa de alimentación existente para reabastecer las células con medio nuevo hasta que se observe la formación de colonias.Después de dos semanas y media de crecimiento celular en agar blando, se cuenta el número de colonias en cada pocillo. Para facilitar la cuantificación, imprima una cuadrícula en una transparencia y coloque la cuadrícula sobre la placa de seis pocillos para ayudar a localizar las células durante el conteo. El tamaño de la colonia se cuantifica mediante el diámetro de cada colonia y variará; defina previamente un tamaño de colonia de referencia para determinar qué colonias se puntuarán.Por ejemplo, aquí se incluyen en el análisis de datos colonias de 70 micrómetros o mayores. Después de contar, selle la placa de cultivo de seis pocillos con paraform para evitar que los geles se sequen. Almacene las muestras a cuatro grados Celsius para impedir la formación adicional de colonias y para futuros conteos.Los resultados demuestran que la cloramina BB inhibe significativamente la formación de colonias derivadas de células MCF 10 DCIS en presencia de un inhibidor de pad. Se observó una reducción tanto en la formación de colonias como en el tamaño de las colonias en comparación con el control de DMSO. El tamaño de las colonias de células MCF 10 DCIS tratadas con cloramina BB fue predominantemente en el rango de 20 a 100 micrómetros.Si bien el tamaño de las colonias en el control con DMSO presentó un rango más amplio de 70 a 150 micrómetros tras dos semanas y media de crecimiento, se contaron y analizaron las colonias mayores de 70 micrómetros. Hubo un promedio de aproximadamente 3.500 colonias en el control con DMSO, mientras que en el grupo tratado con cloramina BB se observaron solo unas 2.000 colonias. Tras dos semanas y media de cultivo semisólido, esto representa una disminución del 44 % en la formación media de colonias en presencia de un micromolar de cloramina BB, lo que indica una inhibición significativa de la tumorigenicidad de las células de cáncer de mama por el inhibidor de PAD.Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta precalentar todos los reactivos y equipos previamente para evitar que las soluciones se solidifiquen durante su manipulación, y gracias por vernos.

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Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Este video describe un ensayo de formación de colonias de agar blando para probar los efectos de un inhibidor de la enzima PADI y BB-Cl-amidina en la tumorigénesis del cáncer de mama in vitro. Este ensayo también permite la evaluación cuantitativa del potencial de transformación celular en el contexto de las perturbaciones genéticas.

Ensayo de formación de colonias de agar blando: un método para probar los efectos de nuevos compuestos en la proliferación de células cancerosas

Este video describe el ensayo de formación de colonias, que ayuda a determinar la capacidad de las células de cáncer de pulmón para proliferar indefinidamente y formar colonias individuales. Podemos analizar el efecto de un agente anticancerígeno sobre las células formadoras de colonias mediante el análisis de los cambios en el número y/o tamaño de las colonias resultantes.

Ensayo de formación de colonias: evaluación de la eficacia de los agentes anticancerígenos en las células de cáncer de pulmón formadoras de colonias

Este video describe el protocolo para el ensayo de unidad de formación de colonias basado en metilcelulosa o UFC, que ayuda a identificar y contar el número de colonias formadas por células leucémicas en respuesta al tratamiento con compuestos anticancerígenos.

Ensayo de UFC basado en metilcelulosa: un método para determinar el efecto de los compuestos anticancerígenos en la formación de colonias en células leucémicas

El ensayo de formación de colonias de agar blando es un método utilizado para confirmar el crecimiento independiente del anclaje celular in vitro. El objetivo de este protocolo es ilustrar un método estricto para la detección del potencial tumorigénico de las células transformadas y los efectos supresores de tumores de las proteínas en las células transformadas.

El ensayo de formación de colonias en agar blando

Este procedimiento demostrará cómo sintetizamos y caracterizamos la actividad de las células madre anti-NFκB y anticancerosas de un profármaco aspirina-fumarato.

Síntesis y caracterización de un profármaco Aspirina-fumarato que inhibe la actividad de NFkB y de la mama células madre del cáncer

A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.

Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

Este protocolo proporciona herramientas experimentales in vitro para evaluar la transformación de las células mamarias humanas. Se describen los pasos detallados para el seguimiento de la tasa de proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje y la distribución de linajes celulares en cultivos 3D con matriz de membrana de sótano.

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Este protocolo experimental proporciona un método estable, rentable y eficiente que combina el knockdown de lncRNA con ensayos formadores de colonias para cuantificar el efecto del lncRNA en la proliferación celular del osteosarcoma.

Ensayo de formación de colonias que detecta la capacidad proliferativa de células de osteosarcoma por knockdown de ARNCn

Aprende a utilizar el ensayo de formación de colonias en agar blando para evaluar la tumorigenicidad en células de cáncer de mama. Este método permite cuantificar el efecto del inhibidor BB-Cl-amidine sobre la proliferación celular in vitro.

Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama (Video) | JoVE Journal

Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

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