Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

El objetivo general de este procedimiento es determinar cuantitativamente el efecto del tratamiento sobre la capacidad de las células para proliferar en matrices semisólidas, ya que la capacidad mejorada es un sello distintivo de la genicidad tumoral celular utilizando el ensayo de agar suave, la genicidad tumoral se mide a través de la capacidad de una célula para formar colonias dentro de un gel AROS semisólido. Dado que las células no transformadas no pueden propagarse rápidamente en este entorno, el gel semisólido de AROS se construye haciendo primero una capa inferior de 0,6% de AROS. A continuación, se añade una celda que contiene una capa de gel 0.3%AROS sobre la capa inferior.

En este ensayo, las células experimentales se tratan con un inhibidor de peptidil, arginina, dase o enzima pad desarrollado por el Dr. Subramanian. Cada semana, se añade una capa de alimentación adicional, que es un gel de aros al 0,3% con o sin tratamiento. El paso final es contar el número de colonias de más de 70 micrómetros para su análisis.

En última instancia, se utiliza la microscopía invertida para mostrar la diferencia en el número de colonias entre el grupo de control y el grupo de tratamiento. Hola, mi nombre es Achi Huta. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Scott Kros en el Instituto Baker para la Salud Animal.

En la Universidad de Cornell, el ensayo de formación de colonias de tigres blandos puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como evaluar la genicidad tumoral de una amplia gama de células cancerosas con respecto a su sensibilidad a los medicamentos, las hormonas y una multitud de otras condiciones de tratamiento. Comience este procedimiento preparando aros de hidroxietilo al 3% en una botella de vidrio limpia y seca de 100 mililitros. Agregue 0,9 gramos de dos hidroxietilo aros, seguidos de 30 mililitros de agua destilada.

Calienta la mezcla en el microondas durante 15 segundos y revuelve suavemente. Repite este paso hasta que el polvo de AROS se disuelva por completo. A continuación, autoclave el frasco contenedor.

Deje que la solución agros se enfríe a temperatura ambiente. Antes de continuar, precaliente varias pipetas de cinco mililitros y 10 mililitros en una incubadora a 37 grados centígrados para evitar que los aros se solidifiquen en la pipeta. Cuando manipule parcialmente, afloje la tapa de la botella y cocine en el microondas la solución prefabricada de 3%two HYDROXYETHYL aro durante 15 segundos.

Luego agite suavemente la solución y cocine en el microondas durante otros 15 segundos. Tenga cuidado al agitar la solución ARO porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede derramarse si hay gel sólido residual en el microondas de la botella. Durante unos segundos más, mantenga el frasco que contiene la solución ARO en un baño de agua a 45 grados centígrados durante los siguientes pasos para evitar que la solución agrícola se solidifique prematuramente.

A continuación, transfiera 12 mililitros de medios calentados con las pipetas precalentadas a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue inmediatamente tres mililitros de la solución de aros al 3%, e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar los aros con el medio. A continuación, añada suavemente dos mililitros de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos sin formar burbujas de aire.

Incube la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante una hora para permitir que la mezcla se solidifique. Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos. La capa inferior ya está lista para su uso.

Un aspecto difícil de este procedimiento es asegurarse de que todas las células se distribuyan por igual y que la cáscara de agra derretida no se solidifique antes de agregarla a cada pocillo para garantizar que el seltz se mezcle en el medio antes de agregar el agrogel líquido. Además, las tuberías se precalientan de antemano para evitar que las soluciones se solidifiquen durante la manipulación. Para preparar la capa que contiene la célula, primero la tripsina observa las células MCF 10 DCIS y dilúyelas hasta una concentración celular de 40.000 células por mililitro, luego toma ocho mililitros de medio con pipetas precalentadas y transfiérelas a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.

Agregue inmediatamente dos mililitros de 3%aros al tubo cónico e invierta suavemente para mezclar los aros con el medio. Evite formar burbujas. A continuación, tome dos mililitros de las células y trátelas con dos micromolares BB cloramina en DMSO o DMSO solo como control después del tratamiento, mezcle las células con el 0,6%aros en una dilución uno a uno para hacer una concentración final de un micromolar BB cloramina.

A continuación, tome un mililitro de la mezcla de aros celulares y añádalo suavemente a la capa inferior de la placa de cultivo de seis pocillos. Coloque la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante al menos 15 minutos para permitir que la capa superior se solidifique. Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante una semana antes de agregar la capa de alimentación.

Comience a alimentar la preparación de la capa calentando en el microondas la solución prefabricada de hidroxietilo aro al 3% como antes y equilibrando la botella de solución agrícola en un baño de agua a 45 grados Celsius, mezcle un mililitro de solución agrícola al 3% con nueve mililitros de medio caliente en un tubo cónico de 50 mililitros e invierta suavemente para mezclar los aros con el medio. Evite formar burbujas de aire. Después de tratar la mezcla con cloramina BB, agregue suavemente un mililitro de la mezcla en cada pocillo de la placa de cultivo de seis pocillos que contiene las capas inferior y suave.

A continuación, coloque la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante al menos 15 minutos para permitir que la mezcla se solidifique. Después de que la capa del alimentador se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados. Bader, repita este procedimiento de alimentación semanalmente superponiendo un mililitro de solución de tratamiento de medio 0.3%agros sobre la capa de alimentación existente para reponer las celdas con nuevos medios hasta que se observe la formación de colonias.

Después de dos semanas y media de crecimiento celular en el agar blando, se cuenta el número de colonias en cada pocillo. Usando un microscopio óptico para facilitar la cuantificación, imprima una cuadrícula en una transparencia y adjunte la cuadrícula a la placa de seis pocillos para ayudar a ubicar dónde están las células durante el conteo. El tamaño de la colonia se cuantifica por el diámetro de cada colonia y variará predefinidamente para determinar qué colonias se puntuarán.

Por ejemplo, aquí, los tamaños de colonia de 70 micrómetros o más se incluyen en el análisis de datos. Después de contar, selle la placa de cultivo de seis pocillos con paraforma para evitar que los geles se sequen. Almacene las muestras a cuatro grados centígrados para evitar una mayor formación de colonias y para el recuento futuro.

Los resultados demuestran que la cloramina BB inhibe significativamente la formación de colonias derivadas de células MC 10 DCIS en presencia de un inhibidor de la almohadilla. Hubo una reducción tanto en la formación de colonias como en el tamaño de las colonias en comparación con el control de DMSO. El tamaño de las colonias para las células DCIS MCF 10 tratadas con cloramina BB estuvo predominantemente dentro del rango de 20 a 100 micrómetros.

Mientras que el tamaño de las colonias para el control de DMSO exhibió un rango mayor de 70 a 150 micrómetros, después de dos semanas y media de crecimiento, se contaron y analizaron colonias mayores de 70 micrómetros. Hubo un promedio de alrededor de 3.500 colonias en el control de DMSO, mientras que solo se observaron aproximadamente 2000 colonias en el grupo tratado con cloramina BB. Después de dos semanas y media de agricultura suave, esto representa una disminución del 44% en la formación promedio de colonias en presencia de un micromolar BB Cloramina, lo que indica una inhibición tumorogénica significativa de las células de cáncer de mama por el inhibidor de la EAP.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta precalentar todos los reactivos y equipos de antemano para evitar que las soluciones se solidifiquen al manipularlas, y gracias por observar.