Name: De dos fotones de imágenes de Ca intracelular 2 + Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a medir calcio y óxido nítrico intracelular en células endoteliales y del músculo liso de aorta de rata mediante microscopía de dos fotones. Esta técnica permite visualizar respuestas vasculares con alta resolución.

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Agradecemos al Dr. William Cashdollar, y la Fundación Centro de Imagen Northwestern Mutual en el Instituto de Investigación de la Sangre de Wisconsin para ayudar con los estudios de imagen. También agradecemos al Dr. Daria Ilatovskaya para la lectura crítica de este manuscrito y útil para el debate. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL108880 (a AS) y DP2-OD008396 (a AMG).

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en el Colegio Médico de Wisconsin y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Aislamiento de la aorta de rata <ol><li> Anestesiar las ratas con isoflurano (5% de inducción, 1,5 a 2,5% de mantenimiento) u otro método aprobado IACUC. </li><li> Coloque la rata en una posición supina. Con el fin de exponer los órganos abdominales, hacer una pequeña incisión en la línea media ventral a través de la piel y del tejido subcutáneo abdominal. Uso de almohadillas de gasa desvían suavemente los intestinos para exponer la aorta y la vena cava como se muestra en la Figura 1. </li><li> Brevemente, embotado diseccionar la aorta desde el tejido conectivo y de la vena cava. El uso de sutura, atar la aorta lo más cerca posible al riñón. Diseccionar unos 1-2 cm de aorta y colocarlo en una cónica 15 ml maser contiene fisiológico normal de Salt Solution (PSS; en mM: 140 NaCl, 1,2 de MgCl 2, 2 CaCl 2, 4,5 KCl, 6 glucosa, 10 HEPES) en hielo. </li><li> Una vez que la aorta se aísla, la eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los no-supervivencia procedimientos eutanasia animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humano del animal. 3 </li><li> Fórceps Utilizando un microscopio de disección, con punta fina, y microtijeras diseccionar la grasa y el tejido conectivo fuera de la aorta. Una vez que la aorta es limpio, cortar la aorta longitudinalmente y colocarlo en PSS en hielo para después. </li></ol> 2. colorante de carga e Incubación <ol><li> Pipet 7 l de 1 mM Fluo-04 a.m. tinte, que se suministra en la solución basada en DMSO, en 500 tubos individuales mu l que se han cubierto con papel de aluminio. Almacenar en el congelador a -20 ° C para preservar las propiedades de tinte con el tiempo. Nota: estas alícuotas de modoluciones deben ser estables durante al menos seis meses. </li><li> Antes de usar, permiten que las soluciones de colorante para calentar a temperatura ambiente antes de abrir. Preparar soluciones de trabajo inmediatamente antes de su uso. No almacene el reactivo diluido para su uso posterior. </li><li> Añadir 7 l de mM Fluo-04 a.m. tinte 1 confeccionada disuelto en solución de DMSO al 450 ul de PSS que no contiene calcio. Añadir 40 l de 10% de solución de DMSO no a base de ácido Pluronic al cóctel de carga para ayudar a dispersar los acetoximetilo (AM) ésteres y mejorar la carga del colorante de calcio. </li><li> Colocar las aortas disecados en los tubos 500 l que contenía el cóctel de carga (como se describe en 2.3) durante 1 h. Cubra todos los tubos con papel y lugar en un agitador rotatorio a temperatura ambiente. </li><li> Para supervisar la producción de NO en la vasculatura, utilizar colorante diacetato DAF-FM. Incubar la aorta en una solución que contiene 450 l PSS, 40 l de ácido plurónico y 5 l de 10 mM diacetato de DAF-FM. Similar al protocolo de incubación de calcio (descrito en 2.3), colocar la aortaen un tubo de 500 l que contiene la solución NO-dye cubierta en papel de aluminio y colocar en un agitador rotatorio durante 30 min a 4 ° C, seguido de la próxima 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Cuando se mide la producción de NO, utilizar el NO endotelial bloqueador sintasa, L-NAME, para bloquear la producción de NO como un control como se muestra en la Figura 4B. Para este procedimiento, se suman a cóctel (como se describe en 2.5) 100 nM L-NAME durante los últimos 30 minutos de incubación (a temperatura ambiente). </li></ol> 3. Protocolo de fotones Microscopía de escaneo láser Dos <ol><li> Después de la 1 h de incubación, lavar la aorta 2 - 3 veces en PSS limpia para eliminar tinte extracelular. </li><li> Transferir la aorta a un plato recubierto de silicona que contiene ya sea normal o PSS Ca 2+ tampón libre (depende del protocolo experimental). Pin de la aorta hacia abajo sobre el revestimiento de silicona con la adventicia en contacto con la silicona (es decir, lumen endoteliales expuestas a la abertura de plato) utilizando pasadores en forma de μ. También puede utilizar un ancla de la rebanadarejilla o pegamento para fijar el tejido. Nota: Para reducir el estrés y posibles artefactos mecánicos, traslado y fijar aorta en Ca 2 + libre de solución y esperar 5-10 minutos antes de comenzar el experimento. </li><li> Conectar una bomba peristáltica o una jeringa a la placa recubierta de silicona para la aplicación automática o manual de fármacos o para cambiar la solución extracelular. </li><li> Coloque el plato debajo de la pieza de la nariz de los rectos microscopio de dos fotones, e instalar y posicionar un 25 × (NA 1.05 y el trabajo a distancia 2 mm) de inmersión en agua lente objetivo por encima de la muestra. Nota: Si este objetivo específico no está disponible, utilice un objetivo fabricados específicamente para dos imágenes de fotones, ya que puede aumentar la resolución de la señal de forma espectacular en comparación con un objetivo normal. </li><li> Activar el láser de dos fotones usando el software (el láser comienza a bombear y encienda). Sintonice la excitación láser de 820 nm. </li><li> El uso de epifluorescencia, busque la aorta y se centran en el objetivola superficie endotelial utilizando ajuste grueso. </li><li> Cambie el microscopio en el modo de escaneo láser de dos fotones, lo que garantiza que el láser de excitación es el modo de bloqueo, los detectores no descanned están comprometidos y se instalan los filtros de emisión correspondientes a los espectros de emisión esperada. Nota: Aquí, la FV10-MRL / R (495-540 nm) se utilizaron. </li><li> Iniciar escaneo en vivo utilizando aproximadamente 5% de la potencia del láser y finamente enfocar el objetivo con el fin de visualizar las células endoteliales. Nota: Las células endoteliales exhibirán una fuerte señal fluorescente cuando se incubaron en PSS normal. Este será notablemente más débil cuando los vasos se incubaron en tampón libre de calcio. Las células endoteliales estarán presentes en la parte superior de la aorta se abrió y las células musculares lisas se pueden ver justo debajo de las células endoteliales (ver Figura 2). Debido a que los vasos sanguíneos no son ni lisa ni incluso, habrá lugares en los que tanto las células de músculo liso y células endoteliales están presentes. &lt;/ Li&gt; <li> Una vez que las células están en foco, el programa de software microscopio para recoger imágenes secuenciales en el modo de exploración rápida (exploración de trama, ventana 512 x 512 píxeles con una frecuencia marco de la colección de 1,1 s). En paralelo con Fluo-4 a.m. fluorescencia, recopilar imágenes de luz transmitida con el fin de detectar cambios en la contracción de los vasos y visualizar mejor las condiciones experimentales. </li><li> Después de la recogida de imágenes de señal de referencia, cambiar la concentración de iones Ca2 + en la solución externa o lentamente aplicar agentes farmacológicos de estímulo usando la bomba peristáltica mientras que las imágenes. Observe el aumento de la señal fluorescente dentro de las células cargadas. Nota: Las células endoteliales responden a cambios en el flujo, lo que se recomienda utilizar aplicaciones laminares bajos y de prueba del vehículo antes de la aplicación de los activadores farmacológicos de Ca 2+ o NO señalización. Para volver a calcular el calcio intracelular a los valores de concentración nM en vasijas cargadas con Fluo-4 (constante de disociación de Fluo-4 is 345 nM), la intensidad de fluorescencia puede ser registrada al inicio del estudio y después de la adición de ionomicina y MnCl2. 4 </li></ol> 4. Procesamiento de Imágenes y Cálculos <ol><li> Descargue e instale Fiji paquete de procesamiento de imagen. </li><li> Abra el archivo de imagen en Fiji. Al importar el archivo, dividir los canales (luz transmitida y la señal fluorescente) cuando se le solicite. Utilice únicamente la señal fluorescente para el análisis de datos. </li><li> Dentro del programa de Fiji, haga clic en la ficha analizar y desplácese hacia abajo hasta la opción herramientas. Bajo la opción de herramientas, encontrará la ficha que dice el gerente de retorno de la inversión y haga clic en él; Aparecerá una nueva ventana. </li><li> Después de esto, haga clic en las mediciones establecidas en la ficha analizar. Seleccione las mediciones específicas de interés. Para las medidas transitorias de calcio, utilice la opción del valor medio gris. </li><li> Con la herramienta de trazo circular, comenzar a trazar las regiones de interés (ROI) y haga clic en &quot;añadir&quot; en la pantalla del gestor de retorno de la inversión para cada ROI. Una vez que todas las células de interés se han trazado, en la ventana del gestor de ROI, seleccione Medir Multi bajo la etiqueta de &quot;más&quot;. Recuerde que debe guardar bien las mediciones directamente o copiar y pegar todas estas mediciones en una hoja de cálculo. </li><li> Abrir archivo * .txt o Excel hoja de cálculo desde Fiji y transferir los números de una nueva hoja de Origen. Nota: También puede utilizar cualquier programa como Sigma Plot o Prisma para su posterior análisis. </li><li> Dentro del programa de origen, utilice Parcela → Menú Line + Símbolo de observar una visión general de todas las respuestas transitorias. Anule la selección de las células que no responden. </li><li> Volver a calcular el número de seguimiento para escala de tiempo (eje X), utilice la columna → Establecer valores de columna y multiplicar la columna el número de seguimiento para la frecuencia de recogida de imagen (en nuestro caso 1.1s). </li><li> Utilice Análisis → Estadísticas en filas para todas las grabaciones seleccionadas para calcular media (eje Y) y trazas de error estándar. Trazar el gráfico final para el grupo actual de células Parcela → Línea + Símbolo. </li><li> El mean calcio cálculo transición se describe como sigue. <ol><li> Para liberación total de calcio dentro del programa de origen, haga clic en el gráfico, a continuación, utilice el menú Análisis → Cálculo → Integrar. Integral total del área bajo la curva aparece en registro de resultados. </li><li> Para la cinética transitoria, haga clic en el gráfico, a continuación, utilizar el menú: Curva Análisis → no lineal Fit → Seleccionar Conjunto de Datos (elegir eje X van desde el máximo hasta el final de la respuesta transitoria). Iniciar montaje → Seleccionar Función → Exponencial Decay 1 → Hecho. Nota: ajuste exponencial aparece en la ventana de gráficos y registro de resultados. Los datos obtenidos (valores) representan cantidad total de calcio liberado, y la cinética de los canales mediadas la respuesta transitoria. </li></ol></li></ol>

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<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Descripción general Experimental. Para comprender mejor la contribución de calcio y NO a la fisiología vascular, un nuevo método fue desarrollado para la medición de [Ca2 +] i y NO en el músculo liso y las células endoteliales de aortas intactas aisladas. Juntos, este protocolo consta de estos pasos críticos: 1) aislamiento mecánico y preparación (digestión no enzimática) de la embarcación. Es importante mantener el tejido sano y intacta tanto como sea posible para obtener grabaciones fisi...

El calcio es un segundo mensajero fundamental dentro de las células vasculares tales como células endoteliales y musculares lisas. Es el estímulo primario para la contracción vascular y desempeña un papel importante en la dilatación vascular, incluyendo sus efectos a través de la generación de NO en el endotelio. Debido a las limitaciones de las tecnologías de formación de imágenes, ha sido prácticamente imposible observar el manejo del calcio dentro del recipiente intacto. El desarrollo de dos sistemas de imagen de fotones y la creación de nuevos calcio o NO tintes de etiquetado, hace posible la imagen a la profundidad y la resolución suficiente para empezar a entender la dinámica del calcio y la producción de NO dentro de la vasculatura. Microscopía de dos fotones se ha aplicado recientemente en los tejidos, los órganos y los estudios en animales enteros, incluso debido a su capacidad superior para penetrar profundamente los tejidos con baja fluorescencia de fondo y la alta sensibilidad de la señal. 1,2 El estrecho espectro de excitación de dos fotones en el Iluminadorpunto focal de iones y el uso de detectores no descanned son las razones por las dos microscopía fotón es superior a la microscopía confocal tradicional. La microscopía confocal no puede producir imágenes de alta calidad en la profundidad del tejido necesario debido a la auto-fluorescencia y la dispersión de la luz fuera de foco en el agujero confocal. En consecuencia, hemos desarrollado un método que utiliza un microscopio de dos fotones para medir [Ca 2 +] i la señalización y la producción de NO en células intactas, los vasos sanguíneos individuales con una baja relación señal-ruido de alta resolución y.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 y micro; l en solución DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti: láser de zafiro 690nm y mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>Filtros</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&nbsp;</td><td>De 495 a 540 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>25 veces; lente de objetivo de inmersión en agua</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 y distancia de trabajo 2 mm</td></tr><tr><td>Rejilla de anclaje Slice &nbsp;</td><td>Instrumento Warner&nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Otros reactivos básicos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de dos fotones de imágenes de ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

El calcio es un regulador muy importante de muchos procesos fisiológicos en los tejidos vasculares. La mayoría de las funciones endoteliales y de músculo liso dependen en gran medida de los cambios en el calcio intracelular ([Ca2 +] i) y óxido nítrico (NO). Con el fin de entender cómo [Ca 2 +] i, NO y moléculas de aguas abajo son manejados por un vaso sanguíneo en respuesta a vasoconstrictores y vasodilatadores, hemos desarrollado una nueva técnica que se aplica en calcio etiquetado (o NO-etiquetado) tiñe con dos fotones microscopía para medir el manejo del calcio (o la producción de NO) en los vasos sanguíneos aislados. Descrito aquí es un procedimiento que se detalla paso a paso que muestra cómo aislar una aorta de una rata, calcio etiqueta o NO en las células endoteliales o de músculo liso, y la imagen de los transitorios de calcio (o la producción de NO) utilizando un microscopio de dos fotones siguiente fisiológica o estímulos farmacológicos. Los beneficios de usar el método son multi-pliegue: 1) es posible simultáneaLy medir los transitorios de calcio en ambos células endoteliales y células del músculo liso en respuesta a diferentes estímulos; 2) le permite a uno a las células imagen endoteliales y células musculares lisas en su entorno nativo; 3) este método es muy sensible al calcio intracelular o ningún cambio y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas; y 4) enfoque descrito se puede aplicar a la medición de otras moléculas, tales como las especies reactivas del oxígeno. En resumen, la aplicación de dos fotones microscopía de emisión láser para controlar los transitorios de calcio y la producción de NO en las células endoteliales y de músculo liso de un vaso sanguíneo aislado haya facilitado datos cuantitativos de alta calidad y promovido nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la función vascular.

Con el fin de evaluar con precisión la contribución de calcio a la fisiología vascular (vasodilatación y vasoconstricción), un protocolo fue diseñado para cargar colorantes de calcio en ambas células endoteliales y células del músculo liso en aortas intacto aislado. La experimental general que establezcan representado en la Figura 1, muestra la estrategia básica para el aislamiento y la preparación del recipiente antes de formación de imágenes. Brevemente, después del aislamiento de la aorta de la rata,...

La función de las células vasculares depende de la actividad de los mensajeros intracelulares. Aquí se describe un método de imagen ex vivo de dos fotones que permite la medición de los niveles intracelulares de calcio y óxido nítrico en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos en células endoteliales y musculares lisas individuales de una aorta aislada.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

El objetivo general de este procedimiento es medir el calcio o el óxido nítrico en un vaso sanguíneo recién aislado utilizando microscopía de dos fotones. Esto se logra primero mediante el aislamiento mecánico y la preparación del vaso. A continuación, el vaso se incuba en un colorante marcador de calcio o en un colorante marcador de O con ácido onico.Luego, el vaso se fija a un platillo recubierto de silicona con una cuadrícula y alfileres para proporcionar una vista estable durante la imagenología de dos fotones. Finalmente, se realiza la imagenología de dos fotones y se cuantifican los resultados. Este video muestra la elevación de la señalización de calcio intracelular en células endoteliales de vasos sanguíneos aislados en respuesta a cambios en la concentración de calcio extracelular.En última instancia, este método permitirá a los investigadores monitorear cambios en el calcio o en el óxido nítrico en células endoteliales o células musculares lisas de un vaso sanguíneo recién aislado. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que puede ofrecer una mejor resolución de señal y mediciones precisas de los procesos intracelulares en tejidos vasculare

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

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Investigación

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Biología

Detalles de los métodos de alta resolución de...

Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso

Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales + Ca 2 fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron hasta la confluencia dentro de un dispositivo de red microfluídica. Se ilustró la unión de las células endoteliales y las distribuciones de F-actina, y se cuantificaron en tiempo real los cambios en la concentración de calcio intracelular y la producción de óxido nítrico en respuesta al trifosfato de adenosina (ATP) a nivel de células individuales.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

La calcificación vascular es un importante predictor y contribuyente a la enfermedad cardiovascular humana. Este protocolo describe los métodos para inducir la calcificación de células de músculo liso vascular primario cultivadas y para cuantificar la calcificación y la carga de macrófagos en aortas animales mediante imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano.

Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Aprende a medir calcio y óxido nítrico intracelular en células endoteliales y del músculo liso de aorta de rata mediante microscopía de dos fotones. Esta técnica permite visualizar respuestas vasculares con alta resolución.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular 2 + Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada (Video) | JoVE Journal

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular

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