Name: Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a cuantificar la quimiosensibilidad de células primarias de mieloma múltiple mediante un ensayo organotípico de alto rendimiento que reconstruye el microambiente óseo.

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Esta investigación fue financiada por el Estado de Bankhead-Coley Equipo Científico Grant Florida (2BT03), los Institutos Nacionales de / Instituto Nacional del Cáncer de la Salud (1R21CA164322-01) y el Equipo de Ciencia de subvención de Moffitt Cancer Center. Este trabajo ha sido financiado en parte por el Fondo para la Investigación Traslacional Core en el H. Lee Centro de Investigación del Cáncer Moffitt Instituto, un Centro Integral del Cáncer del NCI señalado (P30-CA076292). El acceso a las células primarias se hizo posible a través del Protocolo de Cuidado Total del Cáncer en el Centro del Cáncer Moffitt.

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<li>Ramasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+experimental+model+to+evaluate+the+concomitant+effect+of+drugs+on+the+tumour+microenvironment+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells.</a> Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).</li>
<li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nat Med. 16, 483-489 (2010).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bone+marrow+plasma+cell+infiltrates+in+multiple+myeloma%3A+the+added+value+of+CD138+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry.</a> Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).</li>
<li>Najar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+promote+or+suppress+the+proliferation+of+T+lymphocytes+from+cord+blood+and+peripheral+blood%3A+the+importance+of+low+cell+ratio+and+role+of+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6.</a> Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).</li>
<li>Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+i+trialist%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase i trialist.</a> Lancet Oncol. 13, 236(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

En resumen, este es un método potente rendimiento y alta para cuantificar la quimiosensibilidad de las células MM primarias y farmacodinámica ex vivo de fármacos en una reconstrucción de la médula ósea. Los pasos críticos dentro de este protocolo son la siembra adecuada de los pozos y centrándose adecuada (véase la Figura 2 para los resultados esperados): asegurar que las células estromales MM y se distribuyen de manera uniforme, que las células estromales son adherentes a la parte inferior del...

El objetivo de este método es caracterizar la sensibilidad a los fármacos de mieloma múltiple (MM) células primarias a un panel de agentes ex vivo, lo más cerca posible a las condiciones fisiológicas, y con suficiente precisión que estos resultados se pueden utilizar para identificar quimiorresistente sub- poblaciones dentro de la carga tumoral y, en última instancia, para parametrizar modelos computacionales diseñados para estimar la respuesta clínica. Los modelos computacionales son herramientas poderosas para analizar sistemas complejos, como las interacciones huésped-terapia del cáncer. Sin embargo, los modelos sólo son tan buenos como los datos utilizados para parametrizar ellos. Desafortunadamente, la mayoría de los datos disponibles en la literatura no se pueden utilizar en su forma actual para parametrizar tales modelos, ya que a menudo se obtienen en condiciones experimentales mutuamente excluyentes. De este modo, los nuevos experimentos se requieren a menudo con el objetivo de obtener el conjunto de parámetros experimentales necesarios. La mayoría de los ensayos de viabilidad, sin embargo, son destructivas y THnos limitamos a un pequeño número de puntos de tiempo, a menudo sólo uno. Esto perjudica en gran medida el uso de ensayos chemosensitivity parametrizar modelos computacionales, ya que tales experimentos no proporcionan información sobre la dinámica temporal del sistema. Esto es especialmente cierto con las células de cáncer primario, que a menudo se limitan a unos pocos millones por muestra, y tienen una vida útil corta después de la biopsia, lo que limita el número de condiciones experimentales disponibles. Además, la mayoría de los ensayos de viabilidad requieren la separación del cáncer de las células no cancerosas (estroma) en el momento de la cuantificación, lo que añade trabajo extra para el protocolo, perturba aún más las células, y limita el número de experimentos que puede realizarse . Hace 40 años, salmón y colaboradores 1 propusieron su famoso ensayo de formación de colonias in vitro para la evaluación de la quimiosensibilidad de las células tumorales. Desafortunadamente este ensayo encontró un éxito desigual debido al pequeño número de múltiples myeloma (MM) muestras de pacientes que eran capaces de formar colonias bajo condiciones de control: Se estima que sólo un pequeño subgrupo de 0,001% a 0,1% de las células MM eran capaces de replicación, se denominan como células madre de mieloma múltiple 2. Esto limita significativamente la tasa de éxito del ensayo y el número de medicamentos que podrían ser probado en un tiempo, incluso en modelos más recientes 3. Este problema es mucho más importante ahora, cuando agentes MM (estándar o experimentales) son más numerosos que hace cuatro décadas. Una limitación importante de estos primeros ensayos es su producción dichotomized: ya sea un paciente es &quot;sensible&quot; o &quot;resistente&quot; a un medicamento en particular. No se proporciona información sobre el grado de sensibilidad y la heterogeneidad de la población tumor. Por lo tanto, los pacientes con pequeñas subpoblaciones de células de rápido crecimiento resistentes serían clasificados como &quot;sensibles&quot; a la terapia, sino que recaer en breve, por lo que no beneficio de tratamiento. Dada la importancia de la duración de la respuesta en la supervivencia global (OS) de pacientes con cáncer de 4,5, está claro cómo estos ensayos no fueron capaces de estimar correctamente OS consistentemente. Con el fin de evitar estas limitaciones, y ser capaz de generar modelos computacionales específicos del paciente que estimar la respuesta clínica personalizado a un grupo de medicamentos, hemos desarrollado un método para la sensibilidad de drogas prueba no destructiva de mieloma múltiple (MM) líneas celulares y las células MM primarias en una reconstrucción ex vivo del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular y el estroma 6. Este ensayo, sin embargo, tenía la limitación de depender de una diapositiva de microfluidos comercial en particular, cuyas dimensiones y el coste restringido el número de experimentos o medicamentos que podrían llevarse a cabo a la vez en un equipo determinado. El sistema aquí descrito se extiende este ensayo original en un alto-throughput organotípicos plataforma de dosis-respuesta, para el cribado in vitro de fármacos, basado en un algoritmo de análisis de imagen digital para no destructiva cuantificar la viabilidad celular. Cada pocillo en 384 o 1536 pocillos placas es una reconstrucción 3D del microambiente de la médula ósea, incluyendo células primarias mm, matriz extracelular, y el estroma y factores de crecimiento derivados del paciente. Microscopía vivo y análisis digital de imágenes se utilizan para detectar eventos de muerte celular en diferentes concentraciones de fármaco, que se utilizan para generar superficies de dosis-respuesta. De los datos in vitro, un modelo matemático identifica el tamaño y la quimiosensibilidad de sub-poblaciones dentro de la carga tumoral del paciente, y se puede utilizar para simular cómo respondería el tumor al fármaco (s) en condiciones fisiológicas en un régimen de clínica 6 ( Figura 1). Las principales novedades de esta plataforma son: (a) pequeño número de células cancerosas requeridos (1.000-10.000 por concent drogasración); (B) la evaluación de la eficacia del fármaco en condiciones fisiológicas (matriz extracelular, estroma, factores de crecimiento derivados del paciente); (C) Ninguna toxicidad de los marcadores de viabilidad 7 ya que sólo de imágenes de campo claro se utiliza, por lo tanto no hay necesidad de transfectar células con fluorescencia o bioluminiscencia 8 9; (D) de formación de imágenes continua proporciona efecto de la droga como una función de la concentración y tiempo de exposición (farmacodinámica); y (e) la integración entre in vitro y modelos computacionales evolutivas, para estimar el resultado clínico 6 (Silva et al., en preparación). El factor clave que permite que el algoritmo de análisis de imagen digital para discernir el cáncer de células del estroma es su diferente afinidad a la parte inferior del pozo: células MM no se adhieren, y permanecen en suspensión en la matriz, mientras que las células estromales se adhieren a la parte inferior de la bien y luego estirar. Esta separación se produce a pesar de que MM y un estromare sembrado al mismo tiempo, y se produce durante el proceso de O / N de la incubación. El desacelerándose en la centrífuga después de la siembra de la placa se acelera aún más este proceso. Como consecuencia, las células MM aparecen en la imagen como discos redondos brillantes rodeadas por un anillo oscuro, mientras que el estroma mantiene un perfil bajo y un tono más oscuro (Figura 2). Por lo tanto, el ensayo en su forma actual es el más adecuado para las células cancerosas no adherentes, aunque los ajustes en el algoritmo se podría hacer con el cáncer independiente y estroma en base a otras características morfológicas, como el tamaño y forma. En este protocolo se describen dos tipos de matriz extracelular (colágeno y matriz de membrana basal), así como dos tipos de co-cultivos, con (células madre mesenquimales derivadas de médula ósea) BMSC y HUVECS, en representación de los nichos intersticiales y perivasculares de la médula ósea , respectivamente. El uso de una placa de 384 pocillos, 5 concentraciones por drogas y dos repeticiones, que fueron capaces de test hasta 31 fármacos diferentes con la muestra de un solo paciente. En placas de 1536 pocillos este número es 127. La Figura 3 representa la disposición utilizada actualmente para la siembra de células manual, mientras que la Figura Suplementaria 1 representa la distribución óptima usando una pipeta robótica. En el diseño de la figura 3, cada placa de 384 pocillos puede llevar a 3 muestras de pacientes con 7 fármacos diferentes, o una muestra de pacientes evaluados con 21 drogas. Cada fármaco se representa por 5 concentraciones, y cada condición se siembra en los duplicados. 4 pozos de control (ningún fármaco añadido) se siembran para cada conjunto de 7 medicamentos (por ejemplo, pozos 36-39, 126-129 y 200-203). Para garantizar la potencia de los medicamentos que se utilizan, una línea celular de mieloma humano (por ejemplo, H929 o MM1.S) también es cabeza de serie, y drogada por duplicado a la mayor concentración de cada uno de los fármacos utilizados (pozos 76-89). El control de la línea de células positivas se asegura de que los medicamentos que se utilizan tienen una potencia adecuada, ya que sus curvas de respuesta de dosis son comparables acexperimentos Ross. Dos pocillos se sembraron con una línea celular de mieloma como control para las condiciones ambientales, en otras palabras, para detectar posibles problemas en la incubadora de banco durante la exploración (pozos 75 y 90). La enumeración de los pozos sigue un patrón en zigzag con el fin de reducir la distancia recorrida por la etapa motorizada del microscopio, lo que reduce el tiempo de adquisición y reduce el desgaste del equipo.

<table><tbody><tr><td>Microscopio digital EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td><td>AMAFD1000 + AMC1000</td><td>equipado con platina motorizada e incubadora de sobremesa.</td></tr><tr><td>Placa de 384 pocillos CellBind</td><td>CORNING CLS3683</td><td>SIGMA</td><td>Corning Placas de 384 pocillos Placa de 384 pocillos, poliestireno, superficie CellBIND, estéril, transparente de fondo plano, negro, con tapa</td></tr><tr><td>Placa de 1.536 pocillos CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3832 ALDRICH</td><td>Corning Placas de 1.536 pocillos, base baja, tratamiento de superficies CellBIND, estéril</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02 SIGMA</td><td>Para el aislamiento in vitro de linfocitos de sangre periférica humana.</td></tr><tr><td>Cuentas magnéticas CD138</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>Perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos para la selección de células CD138+.</td></tr><tr><td>Columnas LS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>&nbsp; 130-042-401</td><td>Columna para separación de células.</td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>Imán para columna de separación.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>ECM Gel de Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>Matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido sin LDEV</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC</td></tr>) <tr><td>RPMI-1640 medios</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 Medio + L-Glutamina + Rojo Fenol</td></tr><tr><td>FBS Inactivado por calor</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen</td></tr> estadounidense <tr><td>3,1 mg/ml Colágeno bovino tipo I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B Solución de</td><td>colágeno bovino, tipo I, 3 mg/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Precision XS</td><td>BIOTEK</td><td>PRC3841</td><td>Sistema de pipetas robóticas</td></tr></tbody></table>

un sistema organotípicos de alto rendimiento para la caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En este trabajo se describe un nuevo método que combina ensayos ex vivo de sensibilidad de drogas y análisis de imágenes digitales para estimar quimiosensibilidad y heterogeneidad de mieloma múltiple las células derivadas del paciente (MM). Este enfoque consiste en la siembra de células MM primarias recién extraídos de aspirados de médula ósea en las cámaras de microfluidos implementadas en placas de múltiples pocillos, cada uno compuesto de una reconstrucción del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular (colágeno de la membrana basal o matriz) y el estroma (el paciente células madre mesenquimales derivadas) o células endoteliales derivadas de seres humanos (HUVEC). Las cámaras están drogados con diferentes agentes y concentraciones, y se crean imágenes de forma secuencial durante 96 horas a través de la microscopía de campo claro, en un microscopio motorizado equipado con una cámara digital. Software de análisis de imagen digital detecta células vivas y muertas de la presencia o ausencia de movimiento de la membrana, y genera curvas de cambio en la viabilidad como una función of concentración del fármaco y el tiempo de exposición. Usamos un modelo computacional para determinar los parámetros de la quimiosensibilidad de la población tumor para cada fármaco, así como el número de sub-poblaciones presentes como una medida de la heterogeneidad tumoral. Estos modelos adaptados al paciente se pueden utilizar para simular los regímenes terapéuticos y estimar la respuesta clínica.

El flujo del experimento se describe brevemente en la Figura 1 Si todos los pasos se han completado con éxito, las imágenes obtenidas por el microscopio debe ser equivalente a la Figura 2:. Viven células MM deben verse claramente discos tan brillantes y BMSCs o HUVECs deben ser apenas visible y bien distribuida en el fondo. Como se ve en la Figura 2A, las células MM varían en tamaño de un paciente a otro, pero en general son más pequeños que las líneas celulares. Puesto...

Describimos un ensayo de sensibilidad a fármacos de alto rendimiento para células primarias de mieloma múltiple. Consiste en una reconstrucción del microambiente de la médula ósea (incluyendo matriz extracelular y estroma) en placas de pocillos múltiples, y un método no invasivo para la cuantificación longitudinal de la viabilidad celular.

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la sensibilidad química de células primarias de mieloma múltiple frente a un panel de agentes quimioterapéuticos. Esto se logra primero mezclando células de mieloma múltiple aisladas de aspirado fresco de médula ósea con estroma derivado del paciente y colágeno previo al cultivo. En el segundo paso, la mezcla CEL se siembra en una placa de múltiples pocillos.A continuación, las células se tratan con los agentes quimioterapéuticos de interés, y la placa se transfiere al incubador de un microscopio con platina motorizada para la obtención secuencial de imágenes de las células durante un período de incubación de 96 horas. En última instancia, se puede utilizar un algoritmo de análisis de imágenes digitales para generar curvas de viabilidad para cada fármaco y concentración. Las principales ventajas de esta técnica frente a los ensayos de viabilidad de punto final existentes son que puede utilizarse para probar varios agentes quimioterapéuticos frente a una única muestra del paciente, y que la viabilidad de las células del paciente puede medirse longitudinalmente durante varios días sin necesidad de separar las células del estroma o de la matriz.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de tumores hematopoyéticos, ya que teóricamente puede utilizarse para predecir la respuesta clínica a regímenes específicos de quimioterapia. Tuvimos por primera vez la idea de este protocolo cuando nos dimos cuenta de que sustituir nuestras placas microfluídicas originales por placas de pocillos múltiples reduciría considerablemente el costo y el tiempo necesarios para completar el experimento. Para preparar cultivos co-cultivos primarios de mieloma múltiple y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea con una pipeta multicanal, comience por suspender las células a seis veces la concentración final en RPMI 1640.A continuación, mezcle 50 microlitros de cada tipo celular con colágeno tipo uno recién preparado hasta un volumen final de 300 microlitros. Luego, use una pipeta multicanal para dispensar manualmente ocho microlitros de la mezcla de matriz celular en el centro de cada pocillo de una placa de 384 pocillos y centrifugue la placa para concentrar todas las células en el mismo plano focal.Después de centrifugar, incubar las placas en condiciones de cultivo celular durante una hora para permitir que el gel polimerice. Luego, añadir 80 microlitros de medio de crecimiento suplementado a cada pocillo e incubar la placa durante la noche para permitir que el estroma se adhiera al fondo de la placa. Para preparar cultivos co-cultivos de estroma de mieloma múltiple con un pipetizador robótico, comenzar suspendiendo 300 microlitros de células de mieloma múltiple positivas para CD138 y 300 microlitros de células estromales en RPMI 1640, medio a seis veces la densidad final deseada, tal como se acaba de demostrar.Luego, mezcle ambos tipos de células juntos en un tubo de 1,5 mililitros etiquetado como CD138 positivo y coloque el tubo en un incubador de cultivo celular. A continuación, suspenda 60 microlitros de la línea celular de mieloma múltiple adecuada y 60 microlitros de las células estromales en RPMI 1640, medio a seis veces la densidad final deseada, y mezcle ambos tipos de células juntos en un tubo de 1,5 mililitros etiquetado como esta segunda línea celular y incube a 37 grados Celsius también. En el pipetador robótico, cargue el archivo de script de siembra celular.Luego, coloque una caja de puntas para pipeta de 200 microlitros en la estación A, una placa de microtitulación en la estación B y una placa estéril de 84 pocillos en la estación E del robot. A continuación, mezcle la mezcla de células positivas para CD138 con el tubo de medio premezclado CD138 recién preparado y transfiera 1,5 mililitros de la solución celular resultante al pocillo número uno de la placa de microtitulación.Coloque el resto de las células en hielo e inicie el programa. El robot sembrará los primeros 176 pozos de la placa de 384 pozos y luego hará una pausa. Utilice este tiempo para transferir las células CD138 positivas restantes al pozo número dos de la placa de microtitulación y reanudar el programa.El robot verá los 144 pocillos restantes de la placa y volverá a pausarse. Ahora mezcle las células del tubo de la línea celular con un tubo de mezcla previa de línea celular recién preparada y transfiera el contenido al pocillo número tres de la placa de microtitulación. Luego, reanude nuevamente el programa, permitiendo que el robot siembre los 64 pocillos restantes de la placa de 84 pocillos.Una vez sembrada la última poceta, centrifugar las células y transferir los cultivos co-cultivo al incubador de cultivo celular para la polimerización del colágeno. Después de una hora, cargar el script de la capa de medio en el robot y colocar una caja de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, un reservorio de reactivo con 31 mililitros de medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal, plasma de paciente y antibióticos en la estación B, y la placa CED 3 de 84 pocetas en la estación E. A continuación, ejecutar el programa. El robot transferirá 81 microlitros del medio suplementado a cada poceta.Cuando el robot haya terminado, regrese las células al incubador para permitir que el estroma se adhiera al sustrato durante la noche. Para tratar las células sembradas con el fármaco de interés, primero cargue el script de la placa de fármaco en la capa de medio en la interfaz de usuario del pipeteador robótico. Luego, coloque una caja de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, un reservorio con 21 mililitros de RPMI 1640 suplementado con plasma de pacientes FPS y antibióticos en la estación B, y una placa vacía de 84 pozos en la estación E; ejecute el programa, y el pipeteador robótico añadirá 30 microlitros de medio a todos los pozos.La placa de 384 pozos. A continuación, siga la plantilla agregando 200 microlitros de fármaco a 20 veces la concentración máxima en cada pozo de una placa de microtitulación para el control. Añada medio suplementado con plasma de pacientes FPS y antibióticos al pozo.Luego, coloque una caja de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, la placa de microtitulación con fármacos en la estación B y una placa de 84 pocillos con medio en la estación C, y cargue el programa de la placa de fármacos. El pipetador robótico realizará una dilución seriada uno a tres, como se ilustra en esta figura. Ahora, coloque una caja nueva de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, la placa de 84 pocillos con fármaco diluido en la estación B y la placa de 84 pocillos con células sembradas en la estación C, y ejecute el programa de adición de fármaco.El pipeteador robótico transferirá ocho microlitros de fármaco de cada pocillo de la placa de fármacos a su contraparte en la placa de células. Después de tratar el último pocillo, transfiera inmediatamente la placa de células al incubador del microscopio digital. Luego, para obtener imágenes de las células, limpie el interior del incubador de banco con una toallita húmeda con etanol y cambie cuidadosamente la tapa de la placa por la tapa del incubador.A continuación, siga los pasos del software para agregar los puntos de referencia de las regiones de interés que se imaginarán sucesivamente durante el experimento. Finalmente, utilizando un objetivo de aumento de 5 o 10 x, enfoque las células hasta que las células de mieloma múltiple aparezcan como discos brillantes rodeados por un anillo oscuro y las células estromales sean apenas visibles. En este experimento, las células vivas de mieloma múltiple se colorearon artificialmente en verde, con una señal verde mínima o nula observada en las células estromales y en las células endoteliales de vena umbilical humana al final del experimento, a la concentración más alta del fármaco, cuando todas las células de mieloma múltiple estaban muertas.A continuación, se utilizó el software del robot para iniciar el seguimiento de la pérdida gradual de viabilidad resultante de la exposición a las diferentes concentraciones de fármaco a lo largo del tiempo. Es importante observar cuidadosamente todos los pocillos sembrados antes de comenzar el proceso de adquisición de imágenes, ya que los artefactos pueden inducir a error al software de análisis de imágenes y conducir a resultados falsos. Por ejemplo, aquí se muestra el resultado de una densidad excesiva de células estromales o de un tiempo demasiado prolongado entre la tripsinización y la siembra, lo que provoca la formación de agregados celulares como se observa en esta imagen.Si las líneas celulares se siembran a dos densidades altas, formarán colonias a medida que se repliquen, lo que reduce la precisión del algoritmo de análisis de imágenes digitales, ya que resulta cada vez más difícil distinguir una célula de otra. Asimismo, se sembraron demasiadas pocas células de mieloma múltiple cuando el número de células de mieloma múltiple obtenidas del aspirado de médula ósea es inferior a 500.000. Es necesario determinar el volumen muerto del tubo que se está utilizando antes de sembrar las células y considerar este volumen en los cálculos de dilución. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el medio premezclado que contiene el colágeno sobre hielo para prevenir la polimerización antes de que las células estén listas. También ayudó a explorar cómo la heterogeneidad de la sensibilidad química de la carga tumoral puede determinar la profundidad y duración de la respuesta del paciente.

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Este video muestra un ensayo que investiga el papel de las células similares a los neutrófilos en la protección de las células de linfoma contra la citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos. Se establece un cocultivo en 3D, que consiste en linfoma y células similares a los neutrófilos, y se expone a la vincristina, un medicamento de quimioterapia. El contacto directo con las células similares a los neutrófilos induce una regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas en las células...

Determinación de la función de las células similares a los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a un fármaco de prueba

Las células humanas de mieloma múltiple (MM) requieren el microambiente de apoyo de células mesenquimales y componentes de la matriz extracelular para la supervivencia y proliferación. Hemos establecido un modelo in vivo de embriones en pollo con células de mieloma y mesenquimales humanas injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer en el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

El presente informe resume un protocolo que se puede utilizar para modelar la influencia del nicho del microambiente de la médula ósea en las células leucémicas, con énfasis en el enriquecimiento de la subpoblación más quimiorresistente.

Modelado Quimioterapia Leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

A granel gene expresión medidas nube célula individual diferencias en poblaciones celulares heterogéneas. Aquí, describimos un protocolo para análisis de expresión génica e índice cómo sola célula clasificación de Florescence activa célula clasificación (FACS) puede combinarse para delinear la heterogeneidad y immunophenotypically caracterizar poblaciones celulares molecularmente distintos.

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Introducimos un protocolo para medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral orgatípico. La estrategia experimental descrita aquí proporciona una plataforma para llevar a cabo pantallas de fármacos de rendimiento medio-alto en rodajas de tejido derivadas de tumores clínicos o de ratón en condiciones ex vivo.

Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico

Se desarrolló un sistema de ensayo de alto rendimiento in vitro de alta precisión para evaluar medicamentos contra el cáncer utilizando organoides tumorales (PDO) derivados del paciente, similares a los tejidos cancerosos, pero que no son adecuados para sistemas de ensayo de alto rendimiento in vitro con placas de 96 pocillos y 384 pocillos.

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Este protocolo describe una evaluación estandarizada de las sensibilidades de los medicamentos a los inhibidores de señalización dirigidos en modelos organoides derivados de pacientes con NSCLC.

Perfil de la sensibilidad a las terapias dirigidas en organoides derivados de pacientes con NSCLC con mutación de EGFR

Este protocolo describe un método semiautomatizado para exámenes de detección de fármacos con organoides de rendimiento medio a alto y software de análisis de imágenes automatizado e independiente del microscopio para cuantificar y visualizar las respuestas multiparamétricas a fármacos de un solo organoide para capturar la heterogeneidad intratumoral.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

Aquí, se describe un método basado en citometría de fosfoflujo para analizar la señalización aguas abajo de las vías mTORC1, JAK/STAT5 y MAPK en células de leucemia mieloide humana aguda xenoinjertadas en ratones y obtenidas de aspirados de médula ósea. Los niveles de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 y p-ERK1/2 se miden simultáneamente utilizando un citómetro de flujo espectral de última generación con alta sensibilidad.

Citometría de fosfoflujo intracelular de xenotrasplantes derivados de pacientes con leucemia mieloide aguda

Aprenda a cuantificar la quimiosensibilidad de células primarias de mieloma múltiple mediante un ensayo organotípico de alto rendimiento que reconstruye el microambiente óseo.

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria (Video) | JoVE Journal

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

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