Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la sensibilidad química de células primarias de mieloma múltiple frente a un panel de agentes quimioterapéuticos. Esto se logra primero mezclando células de mieloma múltiple aisladas de aspirado fresco de médula ósea con estroma derivado del paciente y colágeno previo al cultivo. En el segundo paso, la mezcla CEL se siembra en una placa de múltiples pocillos.

A continuación, las células se tratan con los agentes quimioterapéuticos de interés, y la placa se transfiere al incubador de un microscopio con platina motorizada para la obtención secuencial de imágenes de las células durante un período de incubación de 96 horas. En última instancia, se puede utilizar un algoritmo de análisis de imágenes digitales para generar curvas de viabilidad para cada fármaco y concentración. Las principales ventajas de esta técnica frente a los ensayos de viabilidad de punto final existentes son que puede utilizarse para probar varios agentes quimioterapéuticos frente a una única muestra del paciente, y que la viabilidad de las células del paciente puede medirse longitudinalmente durante varios días sin necesidad de separar las células del estroma o de la matriz.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de tumores hematopoyéticos, ya que teóricamente puede utilizarse para predecir la respuesta clínica a regímenes específicos de quimioterapia. Tuvimos por primera vez la idea de este protocolo cuando nos dimos cuenta de que sustituir nuestras placas microfluídicas originales por placas de pocillos múltiples reduciría considerablemente el costo y el tiempo necesarios para completar el experimento. Para preparar cultivos co-cultivos primarios de mieloma múltiple y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea con una pipeta multicanal, comience por suspender las células a seis veces la concentración final en RPMI 1640.

A continuación, mezcle 50 microlitros de cada tipo celular con colágeno tipo uno recién preparado hasta un volumen final de 300 microlitros. Luego, use una pipeta multicanal para dispensar manualmente ocho microlitros de la mezcla de matriz celular en el centro de cada pocillo de una placa de 384 pocillos y centrifugue la placa para concentrar todas las células en el mismo plano focal.

Después de centrifugar, incubar las placas en condiciones de cultivo celular durante una hora para permitir que el gel polimerice. Luego, añadir 80 microlitros de medio de crecimiento suplementado a cada pocillo e incubar la placa durante la noche para permitir que el estroma se adhiera al fondo de la placa. Para preparar cultivos co-cultivos de estroma de mieloma múltiple con un pipetizador robótico, comenzar suspendiendo 300 microlitros de células de mieloma múltiple positivas para CD138 y 300 microlitros de células estromales en RPMI 1640, medio a seis veces la densidad final deseada, tal como se acaba de demostrar.

Luego, mezcle ambos tipos de células juntos en un tubo de 1,5 mililitros etiquetado como CD138 positivo y coloque el tubo en un incubador de cultivo celular. A continuación, suspenda 60 microlitros de la línea celular de mieloma múltiple adecuada y 60 microlitros de las células estromales en RPMI 1640, medio a seis veces la densidad final deseada, y mezcle ambos tipos de células juntos en un tubo de 1,5 mililitros etiquetado como esta segunda línea celular y incube a 37 grados Celsius también. En el pipetador robótico, cargue el archivo de script de siembra celular.

Luego, coloque una caja de puntas para pipeta de 200 microlitros en la estación A, una placa de microtitulación en la estación B y una placa estéril de 84 pocillos en la estación E del robot. A continuación, mezcle la mezcla de células positivas para CD138 con el tubo de medio premezclado CD138 recién preparado y transfiera 1,5 mililitros de la solución celular resultante al pocillo número uno de la placa de microtitulación.

Coloque el resto de las células en hielo e inicie el programa. El robot sembrará los primeros 176 pozos de la placa de 384 pozos y luego hará una pausa. Utilice este tiempo para transferir las células CD138 positivas restantes al pozo número dos de la placa de microtitulación y reanudar el programa.

El robot verá los 144 pocillos restantes de la placa y volverá a pausarse. Ahora mezcle las células del tubo de la línea celular con un tubo de mezcla previa de línea celular recién preparada y transfiera el contenido al pocillo número tres de la placa de microtitulación. Luego, reanude nuevamente el programa, permitiendo que el robot siembre los 64 pocillos restantes de la placa de 84 pocillos.

Una vez sembrada la última poceta, centrifugar las células y transferir los cultivos co-cultivo al incubador de cultivo celular para la polimerización del colágeno. Después de una hora, cargar el script de la capa de medio en el robot y colocar una caja de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, un reservorio de reactivo con 31 mililitros de medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal, plasma de paciente y antibióticos en la estación B, y la placa CED 3 de 84 pocetas en la estación E. A continuación, ejecutar el programa. El robot transferirá 81 microlitros del medio suplementado a cada poceta.

Cuando el robot haya terminado, regrese las células al incubador para permitir que el estroma se adhiera al sustrato durante la noche. Para tratar las células sembradas con el fármaco de interés, primero cargue el script de la placa de fármaco en la capa de medio en la interfaz de usuario del pipeteador robótico. Luego, coloque una caja de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, un reservorio con 21 mililitros de RPMI 1640 suplementado con plasma de pacientes FPS y antibióticos en la estación B, y una placa vacía de 84 pozos en la estación E; ejecute el programa, y el pipeteador robótico añadirá 30 microlitros de medio a todos los pozos.

La placa de 384 pozos. A continuación, siga la plantilla agregando 200 microlitros de fármaco a 20 veces la concentración máxima en cada pozo de una placa de microtitulación para el control. Añada medio suplementado con plasma de pacientes FPS y antibióticos al pozo.

Luego, coloque una caja de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, la placa de microtitulación con fármacos en la estación B y una placa de 84 pocillos con medio en la estación C, y cargue el programa de la placa de fármacos. El pipetador robótico realizará una dilución seriada uno a tres, como se ilustra en esta figura. Ahora, coloque una caja nueva de puntas de pipeta de 120 microlitros en la estación A, la placa de 84 pocillos con fármaco diluido en la estación B y la placa de 84 pocillos con células sembradas en la estación C, y ejecute el programa de adición de fármaco.

El pipeteador robótico transferirá ocho microlitros de fármaco de cada pocillo de la placa de fármacos a su contraparte en la placa de células. Después de tratar el último pocillo, transfiera inmediatamente la placa de células al incubador del microscopio digital. Luego, para obtener imágenes de las células, limpie el interior del incubador de banco con una toallita húmeda con etanol y cambie cuidadosamente la tapa de la placa por la tapa del incubador.

A continuación, siga los pasos del software para agregar los puntos de referencia de las regiones de interés que se imaginarán sucesivamente durante el experimento. Finalmente, utilizando un objetivo de aumento de 5 o 10 x, enfoque las células hasta que las células de mieloma múltiple aparezcan como discos brillantes rodeados por un anillo oscuro y las células estromales sean apenas visibles. En este experimento, las células vivas de mieloma múltiple se colorearon artificialmente en verde, con una señal verde mínima o nula observada en las células estromales y en las células endoteliales de vena umbilical humana al final del experimento, a la concentración más alta del fármaco, cuando todas las células de mieloma múltiple estaban muertas.

A continuación, se utilizó el software del robot para iniciar el seguimiento de la pérdida gradual de viabilidad resultante de la exposición a las diferentes concentraciones de fármaco a lo largo del tiempo. Es importante observar cuidadosamente todos los pocillos sembrados antes de comenzar el proceso de adquisición de imágenes, ya que los artefactos pueden inducir a error al software de análisis de imágenes y conducir a resultados falsos. Por ejemplo, aquí se muestra el resultado de una densidad excesiva de células estromales o de un tiempo demasiado prolongado entre la tripsinización y la siembra, lo que provoca la formación de agregados celulares como se observa en esta imagen.

Si las líneas celulares se siembran a dos densidades altas, formarán colonias a medida que se repliquen, lo que reduce la precisión del algoritmo de análisis de imágenes digitales, ya que resulta cada vez más difícil distinguir una célula de otra. Asimismo, se sembraron demasiadas pocas células de mieloma múltiple cuando el número de células de mieloma múltiple obtenidas del aspirado de médula ósea es inferior a 500.000. Es necesario determinar el volumen muerto del tubo que se está utilizando antes de sembrar las células y considerar este volumen en los cálculos de dilución. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el medio premezclado que contiene el colágeno sobre hielo para prevenir la polimerización antes de que las células estén listas. También ayudó a explorar cómo la heterogeneidad de la sensibilidad química de la carga tumoral puede determinar la profundidad y duración de la respuesta del paciente.