Name: Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende un protocolo simplificado para analizar miRNA en tejidos clínicos de cáncer de próstata mediante PCR en tiempo real e hibridación in situ. Este método permite cuantificar y localizar microRNAs como biomarcadores potenciales.

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Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia en la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud (Número de Grant RO1CA177984; RO1CA138642), el proyecto de programa de VA sobre el cáncer de próstata (BX001604).

Se obtuvieron fijado en formol, embebido en parafina (FFPE) o muestras de cáncer de próstata congelados frescos del SFVAMC. Las muestras procedían de pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical en SFVAMC. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de la UCSF en Investigación en Seres Humanos. Alternativamente, los tejidos de cáncer de próstata microarrays se adquirieron de fuentes comerciales y se utilizan para miARN analiza por ISH. Se recogió información clínico-patológico y el seguimiento de los pacientes con cáncer de próstata analizados. 1. Muestras de Tejido <ol><li> Cortar muestras de tejido de cáncer de próstata en 10 micras secciones usando un microtomo y se tiñen con H &amp; E siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Revisar diapositivas teñidas para la identificación de focos de cáncer de próstata, así como adyacente epitelio glandular normal. Nota: Un patólogo certificado por la junta debe revisar las diapositivas H &amp; E manchadas y mark para el tumor y áreas normales. Utilice las diapositivas marcadas como guías en las secciones posteriores para miARN análisis del tumor vs áreas normales. </li></ol> 2. miARN análisis de expresión por PCR cuantitativa en tiempo real Nota: Este flujo de trabajo incluye los siguientes pasos: microdisección de captura por láser, de aislamiento de ARN total (incluyendo miARN y ARNm), Dosificación de los miRNAs maduros utilizando los ensayos de expresión TaqMan microARN que se detallan en los siguientes apartados. <ol><li> La extracción de RNA <ol><li> Aislamiento de miRNA de cáncer de próstata FFPE tejidos <ol><li> Microdisección de captura por láser (LCM) Nota: Realice los pasos 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 en una campana de extracción química. <ol><li> Preparar diapositivas de tejidos (10 micras secciones) de LCM. Deparrafinize secciones de tejido por inmersión en xileno (2x), durante 10 minutos cada uno, a continuación, se rehidratan los tejidos mediante la incubación de los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada agua(5 minutos). </li><li> Después de la rehidratación, las secciones de la mancha con hematoxilina durante 30 segundos seguidos por el agua. </li><li> Coloque los tejidos en etanol graduado (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min cada uno) y xileno (5 min). </li><li> Diapositivas secas en una campana de extracción y luego se coloca en el instrumento LCM para microdisección. </li><li> Realizar microdisecciones con el Sistema de LCM de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24. Uso patólogo marcado diapositivas como guías para la identificación de los focos de próstata cáncer, así como el tejido normal adyacente. Utilice el rayo láser a una 10-20 micras de diámetro impulsos con una potencia de un 70-90 mW. </li><li> Zonas de captura de interés con pulsos de láser infrarrojo en tapas LCM. Combinar celdas de 2-5 tapas para la extracción de miARN por muestra. Para asegurar la integridad del ARN extraído, inmediatamente procesar células capturadas para la extracción de miRNA. </li><li> Alternativamente, las células lisan en el tampón de extracción miRNA (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y store lisados ​​a -80 ºC. </li></ol></li><li> miARN Extracción y análisis de LCM microdissected tejidos <ol><li> Extraer el ARN total a partir de tejidos FFPE microdissected utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: El rendimiento de ARN de captura por láser miscrodissection es típicamente baja. Por lo tanto, el ARN se eluye en volúmenes bajos (20-30 l) y utiliza para perfiles de expresión mediante ensayos de expresión de microARN Taqman siguiendo las instrucciones del fabricante (también descrito en la sección 2.2). Optimización de ARN de entrada para la detección en tiempo real PCR de miRNAs maduros sugiere que 5 l del ARN eluido es óptima para cada reacción de transcripción inversa miRNA-específicos. Como un control endógeno, se utiliza RNU48 / RNU24. Para las reacciones de control, 2 l de la ARN eluido se utiliza para la reacción de transcripción inversa. </li></ol></li></ol></li><li> Aislamiento de miRNA de cáncer de próstata Los tejidos congelados <ol><li> HomogeNiza tejidos de la próstata resecados congelados moliendo los tejidos en nitrógeno líquido utilizando un mortero. Transferencia de tejido homogeneizado a un tubo de microcentrífuga con una espátula enfriado. Mantener el mortero / mano de mortero y una espátula a la misma temperatura por inmersión en nitrógeno líquido tejido de manera homogeneizada se pueden transferir fácilmente. </li><li> Añadir comercial isotiocianato de guanidina-fenol reactivo (1 ml / 0,1 g de tejido) para el tejido se homogeneiza y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Nota: los tejidos se homogeneizaron en reactivo isotiocianato de guanidina-fenol comercial se pueden almacenar a -80 ºC durante varios meses. </li><li> Añadir cloroformo al homogeneizado (0,2 ml de cloroformo / ml) y agitar enérgicamente durante 30 segundos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 3-5 min seguido de centrifugación a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC. </li><li> Pasar la fase acuosa superior a un tubo de 1,5 ml RNasa libre estéril fresco. </li><li> Añadir un volumen igual de alcohol isopropílico. Mezclar e incubar durante 10 millasn a temperatura ambiente seguido por centrifugación a 12.000 xg durante 20 min a 4 ºC para sedimentar el ARN. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar el precipitado de ARN con 1 ml de etanol al 70%. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante. Sedimentos de ARN en seco a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Disolver ARN en 50-100 agua libre de nucleasa l. </li><li> Realizar cuantificación de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop y determinar la integridad del ARN con una bioanalizador. Ajustar las concentraciones de ARN a 10 ng / l. Utilice 10 a 50 ng de ARN para la reacción de ADNc específica miRNA- seguida de análisis en tiempo real PCR (Sección 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR cuantitativa en tiempo real para análisis de expresión de miRNA Nota: miRNAs maduros ensayo usando un protocolo de RT-PCR de dos etapas como se describe a continuación. <ol><li> Transcripción inversa (RT) <ol><li> Reverse transcribir de ADNc a partir de ARN usando un kit de transcripción inversa miRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Utilice 10 a 50 ng de ARN total con miARN cebador específico del kit microARN Ensayos y RT. Utilice RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Diluir cDNA 1: 5 a 1:10 (dependiendo de la abundancia de los genes miARN analizados) y su uso en la detección de PCR en tiempo real como se describe en el siguiente paso. </li></ol></li><li> PCR en tiempo real para la detección de miARN maduro <ol><li> Amplificar productos de PCR de muestras de cDNA usando los ensayos microARN con una mezcla maestra universal rápida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar las muestras a RNU48 / RNU24 de control / RNU6B. Utilice el método comparativo Ct (ciclo umbral) para calcular los cambios relativos en la expresión génica en el rápido tiempo real PCR System. Analizar cada muestra por triplicado. </li></ol></li></ol></li></ol> Los análisis 3. miARN expresión por hibridación in situ (ISH) <ol><li> Pre-tratamiento de los tejidos <ol><li> Cortar 5 micras secciones de bloques de tejido de cáncer de próstata FFPE utilizando un micrótomo. </li><li&gt; Fix cortes de tejido mediante la incubación de los portaobjetos a 56 ° C durante 1 hora. Nota: Los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas para los análisis de miRNA. </li><li> Deparrafinize los tejidos por inmersión de los portaobjetos con xileno (2 x), durante 15 min cada uno. </li><li> Rehidratar los tejidos mediante la incubación de los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguido de agua destilada (5 min). </li><li> Fijar los portaobjetos con 4% de paraformaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS (2x) a temperatura ambiente durante 5 min cada uno. </li><li> Tratar los portaobjetos con 10 mg / ml de proteinasa K a 37 ºC durante 10 min en tampón de proteinasa K precalentado (Tris-HCL 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 1 mM). </li><li> Después del tratamiento con proteinasa-K, enjuague los portaobjetos con 0,2% de glicina en PBS durante 30 seg. </li><li> Lavado de los portaobjetos en PBS (1x) a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Fijar las diapositivas con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min. </li><li> Enjuague con diapositivasPBS durante 5 min. </li></ol></li><li> La hibridación <ol><li> Pre-hibridar los portaobjetos con solución de pre-hibridación para 4.3 horas a 55 ºC en una cámara húmeda. Use toallitas de laboratorio de tejido empapado en formamida al 50% / 50% de 5x SSC para mantener la cámara húmeda. </li><li> Utilice 5 &#39;sondas marcadas con digoxigenina a una concentración de un 20-50 nM en tampón de hibridación. Diluir sonda-miRNA específico (20-50 nM) y sonda de control U6 ARN nuclear pequeño (20 nm), se calienta a 90 ° C durante 4 minutos, colóquelo en el hielo, y añadir al hielo frío tampón de hibridación (2.4 ng / l ). </li><li> Retire la solución de pre-hibridación, añadir solución de hibridación (sonda + tampón de hibridación, 100 l por diapositiva), incubar durante 12 a 16 horas a temperatura de hibridación-sonda específica (temperatura de hibridación = sonda de 21 Tm ºC). Realizar hibridaciones en una cámara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Pasos de lavado <ol><li> Lavar los portaobjetos con 2x SSC durante 10 minutos a 45 ºC. </li><li> Lavar tse desliza con SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC. </li><li> Lavar los portaobjetos con SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada uno. </li><li> Incubar los portaobjetos con solución de bloqueo 1x durante 1-2 horas a temperatura ambiente </li></ol></li><li> Detección <ol><li> Incubar los portaobjetos con 1: 100 PBS diluido anticuerpo anti-digoxigenina AP-conjugado de 1-4 horas o durante la noche a 4 ºC. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS (3x) a temperatura ambiente durante 10 min cada uno. </li><li> Se lavan los portas (2x) con fosfatasa alcalina tampón (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween-20) a TA durante 5 min cada uno. </li><li> Incubar las diapositivas de sustrato BM púrpura AP en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hasta 20 horas. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y de lavado (2x) en agua. </li><li> Montar las diapositivas utilizando un medio de montaje acuoso y examinar con un microscopio. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen divulgaciones financieras.

En este artículo se describe un flujo de trabajo simplificado para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. En el cáncer de próstata, varios estudios sugieren un papel importante de microRNAs en cáncer de próstata iniciación, progresión y metástasis. Sin embargo, los resultados en conflicto a menudo se obtuvieron en un miRNA específico 22 desde la extracción y análisis de miRNA métodos difieren ampliamente. En vista de la evi...

El cáncer de próstata es un tumor maligno masculina comúnmente diagnosticado que es una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer entre los hombres. En Estados Unidos, se estima que 220.800 nuevos casos y 27.540 muertes se reportaron en 2015 1. El cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea con enfermedad muy variable supuesto- tumores pueden ser indolente o muy agresivo. Un reto fundamental en el manejo clínico del cáncer de próstata es el que plantea la insuficiencia de los que actualmente se utilizan métodos / biomarcadores para la detección de enfermedades, el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento 2. Métodos de detección actuales incluyen antígeno (PSA) prostático específico y un examen rectal digital (DRE), seguido de las biopsias de próstata 3. Antígeno específico de próstata (PSA) es el biomarcador de cáncer de próstata más ampliamente utilizado que ha revolucionado significativamente la gestión clínica y la mejora de las tasas de supervivencia 4. Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes de PSA incluyendo lack de especificidad, cribado basado en PSA ha llevado a más de diagnóstico y sobre el tratamiento de la enfermedad. En vista de esto, los intensos esfuerzos se dirigen hacia la búsqueda de alternativas biomarcadores de cáncer de próstata, en particular los que puede predecir la agresividad de la enfermedad y conducir mejores decisiones de tratamiento 4,5. En los últimos años, los microRNAs (miRNAs) han surgido como prometedores biomarcadores de cáncer de próstata alternos. Los microARNs (miRNAs) constituyen una clase conservado evolutivamente de los pequeños RNAs no codificantes que suprimen la expresión de genes post-transcripcional a través de interacciones específicas de secuencia con los 3&#39;-regiones no traducidas (UTRs) de mRNA objetivos afines. Se estima que&gt; 60% de los mRNAs se conservan objetivos de miRNAs 6. genes miARN se encuentran en regiones intergénicas o dentro de intrones o exones de proteína / no proteico 7 genes de codificación. Estos genes son preferentemente transcritos por la ARN polimerasa II en primamiRNAs ry (pri-miRNAs, varias kilobases de largo) que bucle tallo en forma de estructuras secundarias forma de horquilla. Estos pri-miRNAs se procesan en miRNAs precursores (pre-miRNAs, 60-75 nucleótidos de largo) que se exportan al citoplasma y tratados posteriormente en miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de largo) 08.10. miRNAs regulan procesos celulares clave, incluyendo la proliferación, el desarrollo, la diferenciación y la apoptosis 11. Los estudios sugieren una desregulación generalizada de los perfiles de expresión de miRNA en diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de próstata 12-15. los perfiles de expresión de genes miARN se han notificado a ser ampliamente desregulado en el cáncer de próstata primario y metastásico. Alterada la expresión de miRNA se han relacionado con la progresión del cáncer de próstata, la agresividad y la recurrencia destacando el potencial pronóstico de miRNAs 12,14,16-19. Un creciente cuerpo de evidencia indica que los miRNAs juegan importantes papeles mecanicistas en la iniciación del cáncer de próstata, el desarrollo, el progresoion y la metástasis. En general, los miRNAs están surgiendo alternativas como biomarcadores prometedores para el diagnóstico del cáncer de próstata y el pronóstico que pueden distinguir entre los tejidos y ayuda normales y cancerosas en la estratificación de los tumores de próstata 12. También, miRNAs son objetivos importantes para el desarrollo de terapias eficaces contra el cáncer de próstata 20. Debido a su pequeño tamaño y resistencia a la actividad de RNasa endógena, miRNAs son biomarcadores estables que se pueden detectar fácilmente en tejidos fijados con formalina y 21 en las biopsias de próstata 22. Por otra parte, los perfiles de expresión de miRNAs se han comparado en los tejidos congelados y formol fija y se han encontrado para ser fuertemente correlacionada 21. Sin embargo, la expresión de los genes miARN perfiles en los tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata en gran medida relies en su detección precisa en tejidos clínicos. Aquí se describe un flujo de trabajo simplificado utilizado en nuestro laboratorio para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. Empleamos una combinación de PCR cuantitativa en tiempo real e hibridación in situ para miRNA los análisis de muestras clínicas, con el primero produciendo más información cuantitativa y el segundo para la visualización de la expresión diferencial de los genes miARN potenciales biomarcadores en una variedad de tejidos. Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miARN de FFPE y tejidos de la próstata congelados, la expresión análisis por Taqman-sonda basada miARN RT-PCR y miARN en la técnica de hibridación in situ utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) a base de sondas 23. Sondas basados ​​en LNA ofrecen mayor sensibilidad y especificidad en comparación con el ADN o ARN-sondas basadas y permite la detección robusta de todas las secuencias de genes miARN, independientemente de su contenido de GC y también permiten la discriminaciónción de las familias miARN. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA), con este último ofrece el potencial para acelerar el descubrimiento de biomarcadores miRNA.

<table><tbody><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix para LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternativamente, se puede utilizar el sistema Arcutus Xt de Life Technolgies.</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Sistema rápido de PCR en tiempo real&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>kit de transcripción inversa de microARN Taqman&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados/ Tecnologías de la Vida</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR universal rápida de Taqman &nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Sonda LNA marcada con DIG para sustrato U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP</td><td></td> Roche <td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de prehibridación&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Solución de hibridación&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Solución de bloqueo&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-anticuerpo anti-digoxigenina conjugado</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje acuosos&nbsp;</td><td>Laboratorios de Vectores&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (reactivo de isotiocianato-fenol de guanidina)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxilina</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

los análisis de expresión de mirna en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Un reto fundamental en el cáncer de próstata (CaP) manejo clínico se plantea por la insuficiencia de los biomarcadores que actualmente se utilizan para la detección de la enfermedad, diagnóstico, pronóstico y tratamiento. En los últimos años, microRNAs (miRNAs) han surgido como biomarcadores alternativas prometedoras para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de próstata. Sin embargo, el desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata depende en gran medida su detección precisa en tejidos clínicos. miARN análisis en muestras clínicas de cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El objetivo de este artículo es describir un flujo de trabajo simplificado para miARN analiza en FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata fresco congelado usando una combinación de cuantitativa en tiempo real PCR (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH). Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miRNA de FFPE y tissu próstata congeladoES y la expresión por análisis Taqman-sonda basada miARN RT-PCR. Además, se describe un método optimizado para ISH análisis de detección formiRNA en los tejidos de la próstata utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) - sondas basadas. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA).

Perfiles de expresión de miR-203 en muestras clínicas de cáncer de próstata primario LCM por RT-PCR análisis (Figura 1) Análisis de RT-PCR de la expresión relativa de miR-203 en LCM tejidos de cáncer de próstata primario y las regiones normales adyacentes emparejados se llevó a cabo como se describe en Saini et al. 15 RNU48 se utilizó como control. La siguiente tabla resume la relativa expresión de miR-203 en los tejidos tumorales de cáncer de próstata en...

Aquí describimos un protocolo simplificado para análisis de expresión de microARN (miARN) en tejidos clínicos archivados de cáncer de próstata (PCa) fijados en formol, incluidos en parafina (FFPE) o congelados frescos que emplean PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

El objetivo general de este video es describir un flujo de trabajo simplificado para análisis de microARN en muestras clínicas archivadas de cáncer de próstata, utilizando una combinación de PCR cuantitativa en tiempo real y hibridación NC dos con la implementación de sondas basadas en ácidos nucleicos bloqueados. Esto se logra primero aislado tejido de secciones de cáncer de próstata en FFPE mediante microdisección con láser, seguido de una extracción de microARN. A continuación, se utiliza una PCR-RT en dos pasos para cuantificar el microARN en el tejido y para localizar el microARN, se realiza un análisis de hibridación C dos utilizando sondas de LNA marcadas con digoxigenina y un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina detectado mediante BM purple.Los resultados presentados muestran la expresión de un microARN en tejidos clínicos de cáncer de próstata. Mediante estas técnicas, recientemente los microARN han surgido como biomarcadores alternativos prometedores para el cáncer de próstata. Sin embargo, el análisis de la expresión de microARN y las muestras clínicas de cáncer de próstata suelen ser difíciles debido a factores de confusión como la heterogeneidad de los tumores de próstata y elementos como la contaminación estromal.Llevamos trabajando en el campo de los microARN y ARN no codificantes durante los últimos 10 años. Hemos optimizado las condiciones para la expresión de microARN en diferentes estadios del cáncer de próstata. Consideramos que la expresión de microARN puede utilizarse como biomarcador diagnóstico y pronóstico porque se correlaciona con el resultado clínico del cáncer de próstata.También creemos que el microARN puede utilizarse para el tratamiento del cáncer de próstata mediante la tecnología de nanopartículas. El perfilado preciso de la expresión en el carcinoma de próstata a menudo se ve dificultado por la heterogeneidad de las lesiones. Esto se supera en parte mediante el uso de la microdisección con captura por láser o LCM para recolectar células epiteliales benignas o malignas puras y reducir su mezcla con las células estromáticas.Se ha encontrado que la MAC de tejidos de FFP archivados, seguida de un perfilado de la expresión de microARN, es una técnica sensible, confiable y rentable como método complementario optimizado en hibridación C dos, que ofrece una visión de dónde se expresan los microARN. Una vez que los tejidos se han recolectado y seccionado en cortes de 10 micrones, retire la parafina en una campana extractora, sumerja los portaobjetos en xileno durante 10 minutos dos veces y luego rehidrate los tejidos pasándolos a una serie de baños de alcohol progresivamente acuosos. A continuación, aplique una tinción con hematoxilina durante 30 segundos y enjuague los portaobjetos con agua.Ahora que están rehidratados, pase los tejidos a través de otra serie de alcoholes graduados comenzando con etanol al 70 %. Luego, sumerja los cortes en xilenos durante cinco minutos y déjelos secar al aire. Lleve los portaobjetos secos al instrumento de microdisección por captura láser. Utilice portaobjetos marcados por un patólogo para identificar los focos de cáncer de próstata y las áreas benignas o normales.Siga las instrucciones del fabricante para realizar la microdisección por captura láser. Ajuste el ancho del haz a entre 10 y 20 micrómetros y aplíquelo con pulsos de 70 a 90 milivatios. Utilice pulsos de infrarrojos para capturar las áreas de interés sobre tapas para microdisección por captura láser.Para cada muestra, agregue el contenido de la tapa a un tubo de recolección y procese inmediatamente las células para la extracción de microARN. Extraiga el ARN total utilizando un kit comercial según las instrucciones del fabricante. Eluya el ARN en 20 a 30 microlitros de agua libre de nucleasas y continúe rápidamente.A continuación, utilice un kit de reacción de transcriptasa inversa para sintetizar ADNc usando cebadores específicos para microARN. Prepare cada reacción utilizando entre 10 y 100 nanogramos de ARN total. Una vez obtenido, diluya el ADNc en un factor de cinco a 10 para obtener una concentración de aproximadamente uno a 20 nanogramos.Ahora prepare las reacciones de PCR por triplicado a partir del ADNc utilizando ensayos de microARN con una mezcla maestra universal rápida para el control. Utilice RNU 48 como plantilla para calcular el cambio relativo en la expresión génica. Utilice el método de CT comparativo para comenzar a pretratar las secciones de tejido de cinco micrones de grosor.Fije las laminillas a 56 grados Celsius durante una hora. A continuación, desparafine las laminillas con dos baños de xilol de 15 minutos cada uno a temperatura ambiente. Después de los baños de xilol, rehidrate los tejidos mediante una serie graduada de etanol. A continuación, sumerja los tejidos en agua durante cinco minutos.A continuación, fije los tejidos con PFA al 4 % en PBS a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lave el fijador con dos lavados de cinco minutos en PBS. Ahora cargue la potente aase K a 10 microgramos por mililitro en el tampón precalentado de proteinasa K superior, e incube los tejidos en él a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Después del tratamiento, enjuague las laminillas con glicina al 0,2 % en PBS durante 30 segundos y lave las laminillas en PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, sumérjalas nuevamente en PFA al 4 % durante 15 minutos. Vuelva a eliminar el fijador con dos baños de PBS de cinco minutos cada uno.Los tejidos ya están listos para ser hibridados. Primero, dibuje un círculo hidrofóbico alrededor del tejido utilizando un bolígrafo de trazo para que la solución en los pasos posteriores permanezca sobre la sección del tejido. Incube los tejidos en tampón de prehibridación durante tres a cuatro horas a 55 grados Celsius.Realice esto en una cámara humidificada con toallas empapadas con una solución al 50 % de formamida y al 50 % de solución 5X SSC. Ahora prepare la sonda marcada específica para microARN y la sonda de control. Planifique realizar una dilución de 20 a 50 nanomolar, pero primero diluya las sondas con solo 25 microlitros de tampón de hibridación menos de lo necesario para la dilución final. A continuación, caliente las sondas a 90 grados Celsius durante aproximadamente cuatro minutos.Luego, coloque las sondas en hielo. Finalmente, diluya aún más las sondas con tampón de hibridación frío para alcanzar sus concentraciones finales de 20 a 50 nanomolares. Aplique ahora 100 a 400 microlitros de la solución de sonda sobre cada portaobjetos.Luego, incubarlos durante 12 a 16 horas a la temperatura adecuada de hibridación. Al día siguiente, realizar un lavado con solución SSC en varios pasos tras los lavados. Incubar las laminillas en solución de bloqueo a temperatura ambiente durante una a dos horas tras el bloqueo.Sumerja los tejidos en una solución de uno a 100 de anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina antio genina en PBS. Realice esta incubación de una a cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Posteriormente, elimine el anticuerpo en exceso realizando tres lavados con PBS, durante 10 minutos cada uno.Realice dos lavados de cinco minutos cada uno en un tampón de orina a temperatura ambiente. A continuación, incube los portaobjetos en BM purple, sustrato de fosfatasa alcalina protegido de la luz a temperatura ambiente, durante una hora hasta 20 horas. Al día siguiente, retire el BM purple con una irrigación en PBS al 0,1 % entre 20.Luego, lávelos dos veces con agua y monte las muestras con medios de montaje acuosos utilizando el protocolo descrito de extracción de microARN y RT-PCR. El microARN 2 0 3 se examinó en tejidos de cáncer de próstata y tejidos adyacentes normales. La expresión relativa varió en una fracción sustancial de los tejidos.Se utilizó RNU 48 como control. Los tejidos de cáncer de próstata se microdisectaron bajo el microscopio o se sometieron a microdisección láser (LCM) y luego se analizó la expresión relativa de microARN. La expresión de 3 83 en los tejidos tumorales se comparó con controles normales emparejados.El tejido preparado con MAC detectó la expresión de microARN de manera más confiable. En C, se realizó hibridación con el microARN 2 0 3 en tejido de cáncer de próstata normal y con metástasis ósea. U seis.La detección de ARN se utilizó como control basado en la intensidad de la tinción. La expresión del microARN 2 0 3 se puntuó del uno al cuatro en las células de cada tejido. Por lo tanto, se encontró que la expresión era estadísticamente más baja en el tejido metastásico óseo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la expresión de microARN en muestras clínicas de cáncer de próstata durante todo el flujo de trabajo. Es de suma importancia mantener un entorno libre de ARN. Además, trabajar con paraformaldehído y solución salina puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana extractora y usar equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.Tras seguir este procedimiento, realizamos un análisis estadístico para evaluar si los patrones de expresión de microARN están correlacionados con las variables clínico-patológicas de la enfermedad, lo que nos ayuda a responder preguntas clave, como si la expresión de un microARN particular tiene algún potencial pronóstico o diagnóstico asociado. Nuestro protocolo optimizado de hibridación de microARN en C dos puede aplicarse a cortes de tejido de cáncer de próstata o a matrices de tejidos de cáncer de próstata. Este protocolo también puede aplicarse a otros tipos de tejidos con optimización.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

Retrovirus endógenos humanos (HERV), que ocupan 8% del genoma humano, conservan la capacidad de codificación de los escasos pero cien mil repeticiones terminales largas (LTRs). A Affymetrix microarray costumbre fue diseñado para identificar la expresión locus HERV individual y se utilizó en los tejidos de cáncer de próstata como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.

La identificación basada en microarrays de expresión individual HERV Loci: Aplicación al descubrimiento de biomarcadores en el cáncer de próstata

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

El objetivo de este protocolo es utilizar la microdisección de captura láser como un método eficaz para aislar poblaciones puras de tipos celulares de tejidos prostáticos heterogéneos para el análisis de ARN posterior.

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

La inmunohistoquímica es una poderosa técnica de laboratorio para evaluar la localización y expresión de proteínas dentro de los tejidos. Los métodos semiautomatizados actuales de cuantificación introducen subjetividad y, a menudo, crean resultados irreproducibles. En este trabajo, describimos los métodos para la inmunohistoquímica multiplexada y la cuantificación objetiva de la expresión y colocalización de proteínas mediante imágenes multiespectrales.

La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

Aquí presentamos un protocolo para detectar la expresión de miRNA en muestras de pacientes con cáncer de mama utilizando hibridación in situ de miRNA.

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Este protocolo modificado de extracción mejora de ARN y ADN rendimientos de las regiones seleccionadas, más precisamente de interés en los bloques de tejido histopatológicos.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Este manuscrito describe la optimización de un panel de biomarcadores utilizando un ensayo multiplex grano magnético para clasificar los cánceres de mama.

Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende un protocolo simplificado para analizar miRNA en tejidos clínicos de cáncer de próstata mediante PCR en tiempo real e hibridación in situ. Este método permite cuantificar y localizar microRNAs como biomarcadores potenciales.

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

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