El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo de lesión del oído interno mediante la administración estratégica de agentes ototóxicos directamente en la ventana redonda del oído interno del ratón. Esto se logra primero disecando la capa de grasa subcutánea y retirando suavemente el cuerpo muscular para revelar el periósteo de la bulla timpánica. El segundo paso consiste en destapar la bulla eliminando gradualmente fragmentos óseos hasta exponer la ventana redonda.

A continuación, se seca completamente el líquido visible de la oreja media y del nicho de la ventana redonda para permitir una visualización óptima del nicho de la ventana redonda. El paso final consiste en llenar el nicho de la ventana redonda con el agente ototóxico seleccionado sin alterar la arteria pedicular de la STA, seguido de repeticiones adecuadas según las especificaciones del agente. Finalmente, se utilizan procedimientos funcionales, incluyendo la respuesta auditiva del tronco encefálico y la evaluación morfológica, para demostrar la preservación selectiva o la degeneración de la microarquitectura coclear.

La principal ventaja de esta técnica, nuestra medida existente, es que el procedimiento permite una excelente exposición de la niche de la ventana coclear y del órgano espiral, de modo que el envejecimiento tóxico selectivo pueda aplicarse directamente. Las ventajas de esta técnica incluyen la preservación de la microarquitectura del oído interno, la evitación de la toxicidad sistémica, un inicio rápido del efecto, la degeneración selectiva de ciertos tipos celulares cocleares y resultados reproducibles. Esta técnica puede aplicarse con pocas modificaciones entre otras especies de roedores, incluyendo ratas, cobayos y gerbos.

Ahora demostraré el procedimiento en mi laboratorio. Todos los aspectos de la investigación con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comité institucional correspondiente de cuidado y uso de animales. Todos los procedimientos experimentales con vertebrados descritos aquí fueron aprobados según las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur.

Después de anestesiar al animal según los procedimientos aprobados, administre un analgésico preoperatorio de 0,1 miligramos por kilogramo. Aquí se utiliza buprenorfina. Verifique que el animal haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia.

No debe haber respuesta a un pellizco en el dedo del pie, y el reflejo de escritura debe estar ausente en los ratones, como se observa aquí. Aspire 0,2 mililitros de una solución acuosa que contenga el agente ototóxico seleccionado en una jeringa tuberculínica de un mililitro equipada con una aguja romita de calibre 28 y media pulgada, y expulse cualquier aire dentro de la jeringa, ya que las burbujas pueden impedir la correcta aplicación del agente. Utilice cortadoras eléctricas para eliminar el vello en la zona que se extiende desde el pliegue acefálico, desde la región rostral hasta la cintura escapular caudalmente.

Extienda la depilación desde la línea media sagital dorsal hasta el ángulo mandibular lateralmente. Utilice una cuchilla desechable para asegurar una preparación limpia y completamente afeitada. Esterilice la piel del área preparada según los protocolos institucionales.

Aquí se aplica tópicamente Betadine alternado con etanol de forma circular durante dos minutos. Coloque una pequeña almohadilla térmica debajo del cuerpo para mantener la temperatura corporal del animal. A 36 a 38 grados Celsius, asegure la cabeza del animal mediante un dispositivo sujetador de cabeza.

Ajuste suavemente una pinza pequeña sobre el dorso del hocico del animal para mantenerlo en su lugar. Confirme que el sujetador de la cabeza esté conectado rígidamente al centro de un brazo articulado en forma de U. Fije una varilla de un centímetro de ancho al brazo izquierdo de la U para usarla como apoyo lateral izquierdo de la cabeza, permitiendo el acceso al lado derecho.

Una vez asegurado firmemente en el soporte para la cabeza, coloque al ratón en posición decúbito lateral izquierdo. Coloque el cuerpo cuidadosamente sobre la superficie plana de operación para garantizar su estabilidad durante todo el procedimiento y evitar tensiones torsionales excesivas en las vértebras cervicales. Coloque un microscopio operatorio con capacidad de magnificación 10x y 20x sobre el campo quirúrgico.

Confirme que el microscopio pueda mantener su posición de forma autónoma para que ambas manos puedan utilizarse durante la cirugía mientras se trabaja bajo ampliación microscópica. Utilice tijeras afiladas o una hoja de bisturí para realizar una incisión retroauricular de uno a 1,5 centímetros, aproximadamente seis a ocho milímetros cefálicos al pliegue cefálico auricular. Evite cortar profundamente para preservar las estructuras vasculares subyacentes.

Realice una disección roma a través de la capa de grasa subcutánea. Si realiza la disección en dirección ventral a medial, tenga cuidado de evitar la vena yugular externa. Si se produce sangrado, utilice gelatina absorbible, esponjas o pellets de algodón para detener el flujo.

Una vez que la capa de grasa esté adecuadamente dividida, exponga la musculatura cervical. Un punto de referencia importante es una pequeña rama nerviosa del nervio craneal 11 que rodea el borde posterior del mastoides C CTO. Para extenderse hacia la oreja, utilice un retractor de retención automática para retraer suavemente el cuerpo muscular de la miositis del mastoides CTO en dirección posterior.

Divida suavemente la fascia transparente que envuelve el cuerpo muscular. Retraiga también suavemente la glándula parótida y la vena yugular externa en dirección opuesta. Con una buena retracción del cuerpo muscular CTO Masto, es visible la cúpula brillante del periósteo de la bulla timpánica en el aspecto coddle de la bulla, inserción de un músculo cervical más profundo.

La mastoiditis esternocleidomastoidea entrará en la vista. Coloque un retractor autoadherido para mantener separado el mastoides CTO mediante una técnica con ambas manos, y use con cuidado bisturí bipolar para dividir el periósteo del bulto y exponer el hueso subyacente. Luego, utilice pinzas u un curetaje otológico para elevar y empujar suavemente el periósteo en dirección periférica, exponiendo completamente la cúpula del bulto.

Ahora utilice un taladro dental con accionamiento por correa y una punta cónica de uno o dos milímetros para perforar cuidadosamente un orificio guía de dos milímetros a través del hueso del bulbo. Perfore entre el margen coddle de la cúpula y la línea visiblemente opaca que se extiende a través de la cara rostral del bulbo. A continuación, perforar cuidadosamente un segundo orificio guía cercano para facilitar la apertura del hueso del bulbo; usando un par de pinzas de punta de joyero, retire el bulbo en dirección dorsal y coddle.

Tenga cuidado de no perforar la arteria EDL que se encuentra justo debajo del cartílago del tímpano. Minimice la cantidad de hueso removido para evitar la entrada excesiva de líquido al oído medio antes de aplicar el agente. Utilice una mecha de papel para eliminar todo el líquido visible en el oído medio y en la fosa de la ventana redonda hasta que sea visible el hueso seco.

Este paso es crucial para el éxito del protocolo. Mientras observa el área con el máximo aumento, utilice una aguja fina conectada a una jeringa tuberculina de un mililitro para aplicar una gota del agente ototóxico directamente en la fosa de la ventana redonda, llenándola completamente. Deje que el agente permanezca en la fosa de la ventana redonda durante 10 minutos.

En las etapas iniciales, observe atentamente el reemplazo de un pequeño reflejo de luz en la base del nicho seco por un menisco de líquido opaco y brumoso. Esto indica que el nicho se está llenando adecuadamente. Cuando hayan transcurrido completamente 10 minutos, absorba completamente el agente y reemplácelo con una nueva aplicación del mismo agente.

El número de aplicaciones depende del agente utilizado. El tiempo de exposición generalmente oscila entre 30 y 60 minutos. Tras la aplicación final, deje al toro sin tapar y use pinzas para cerrar el tejido blando sobre el sitio quirúrgico.

Utilice una sutura monofilamento no absorbible de cuatro hilos para cerrar la piel sobre el sitio quirúrgico. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula doméstica limpia, que debe estar equipada con cama y alimento blando. Monitoree los animales diariamente hasta el sacrificio y la recolección de tejido coclear de adultos C-B-A-C-A-J.

Se expusieron ratones de ambos sexos al agente ototóxico Hept etanol. La difusión a través de la ventana redonda. Se observaron aumentos significativos en los umbrales de respuesta auditiva en ratones tratados con Hept desde el día postoperatorio uno hasta el día 14, en comparación con animales control que recibieron una cirugía simulada con administración de solución salina en lugar de Hept.

El etanol no demostró cambios significativos en el umbral en ninguna frecuencia ensayada. La inmunomarcación contra un canal de potasio rectificador interno mostrado en verde sirvió como un método indirecto para visualizar el daño y la recuperación de las estructuras cocleares. La intensidad de la marcación disminuyó notablemente dentro de las teria vais.

El primer día posterior a la cirugía, se observó evidencia de integridad nuclear alterada y condensación cromosómica, típica de la apoptosis celular, en la contratinción nuclear mostrada en rojo. Cuando se cuantificó la intensidad de la tinción de los canales de potasio en las áreas de oídos tratados con estrato, se demostró un valle inicial seguido por un cambio significativo de regreso hacia la intensidad del control siete días después de la exposición al hept, continuando la recuperación a partir de entonces. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en un lapso de 30 a 60 minutos si se realiza adecuadamente.

Es importante recordar que una exposición adicional o recarga puede ayudar a evitar la dilución no deseada del agente auto tóxico por la condensación sanguínea o el líquido intersticial. Sin embargo, se debe tener precaución con este enfoque, ya que tiende a aumentar el riesgo de lesionar inadvertidamente la arteria cedal o introducir líquido intersticial en la fosa de la ventana redonda. Esta técnica mínimamente invasiva permite un estudio detallado de delicados procesos bioquímicos y ha sido fundamental para avanzar en nuestra investigación dirigida a comprender el potencial regenerativo coclear in vivo.