Name: Subcutánea angiotensina II infusión usando osmótica Bombas Induce aneurismas aórticos en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a inducir aneurismas aórticos en ratones mediante infusión subcutánea de angiotensina II con bombas osmóticas. Este método permite estudiar la dilatación aórtica torácica y abdominal en investigación cardiovascular.

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El trabajo de investigación presentado en este manuscrito fue financiado por una beca (HL107319 a Alan Daugherty y HL107326 a Lisa A. Cassis) de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de América. El contenido de este manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. La publicación de este manuscrito fue patrocinada por DURECT Corporation.

Declaración de Ética: Mouse estudios se llevan a cabo con la aprobación de la Universidad de Kentucky Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC número de protocolo: 2006-0009). Los ratones se sacrificaron a la terminación usando un cóctel de ketamina sobredosis (~ 210 mg / kg) y xilazina (~ 30 mg / kg). 1. Cálculo de la angiotensina II Importe NOTA: Este protocolo utiliza el ejemplo de infusión de AngII (1,000 ng / kg / min) durante 4 semanas en 4 receptor de LDL macho - / - ratones alimentados con una dieta enriquecida en grasa saturada. <ol><li> Pesar estudiar los ratones antes de calcular la cantidad de angiotensina II necesaria para perfusión. </li><li> Utilice la plantilla (Tabla 1) para calcular la masa AngII necesaria para el experimento. Utilice la opción &quot;Mean bombeo Rate&quot; se indica en la Instrucción de bombas como la &quot;tasa de bombeo&quot; en el paso 4 de la plantilla. En la plantilla, ficha Pasos 1-5 manualmente y Pasos 6-10 se calculan automáticamente. <ol><li> En la plantilla, asumir queratones ganará 1 g de peso corporal durante la infusión de AngII 1000 ng / kg / min durante 4 semanas. NOTA: Cada ratón puede tener el aumento de peso corporal muy diferente que dependerá de muchas variables, tales como la cepa de ratón y la dieta. Utilizamos rutinariamente &quot;0&quot; o &quot;1 g&quot;, basada en la propia experiencia de los estudios anteriores. </li><li> Calcula un volumen total de 300 l de solución de Ang II para cada ratón desde cada bomba requiere aproximadamente 250 l. </li></ol></li></ol> 2. Disolución de AngII <ol><li> Tienda liofilizado viales AngII a -20 ° C. Equilibrar viales AngII a RT antes de abrir. </li><li> Pesar la masa AngII calculado (7,3 mg, como se muestra en la Tabla 1) en un tubo de plástico estéril. NOTA: Por Merck Index, no utilice tubos de vidrio para la disolución ya una solución acuosa de angiotensina II tiene una fuerte afinidad por la unión a vidrio. </li><li> Añadir el volumen calculado de solución salina estéril (1.200 μl) en el tubo de plástico que contiene el liofilizado AngII, gorra, y mezclar bien por inversión hasta que la solución es clara. </li><li> Números Label ratón # 1, # 2, # 3 y # 4 en los tubos de plástico estériles individuales con tapas (0,5 - 1,5 ml). Preparar la solución de AngII bajo una campana laminar para cada ratón según el peso corporal, calculado en el paso 1.2 y en la Tabla 1. <ol><li> Por ejemplo, una pipeta 3,6 l de solución salina estéril en el tubo # 1, entonces la solución AngII 296,4 l, y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo con suavidad. </li></ol></li><li> Números de la etiqueta del ratón en tubos de plástico con tapas (4 ml, estériles). Estos serán utilizados para la incubación de las bombas como se describe en el Paso 3,13. </li></ol> 3. Relleno bomba osmótica <ol><li> Obtener bombas en dos partes separadas: el cuerpo principal de la bomba y el moderador de flujo (Figura 1). Cada caja tiene 10 cuerpos de bomba y moderadores de flujo que se envuelven individualmente. Anote el número de lote. NOTA: Siempre useguantes porque aceites transferidos desde las manos a la carcasa exterior de bombas afectarán negativamente a la función de bombeo. Use guantes estériles, gasas, tubos, agujas de llenado, y sopesar los barcos para preparar las bombas, para evitar el riesgo de infección del implante. </li><li> Abra sólo el número de cuerpos de bomba y moderadores de flujo necesarios para el estudio, ya que estos no pueden ser almacenados una vez abiertos. Si se necesitan más de 10 bombas, asegúrese de que los números de lote de las bombas son las mismas para un estudio, ya que las bombas de distintos lotes tienen diferente volumen de llenado media y bomba Rate. </li><li> Pesar cada bomba (incluyendo tanto el cuerpo principal y moderador de flujo), y tenga en cuenta el peso de 4 decimales (por ejemplo, 1,1443 g de ratón # 1). Este peso, denominada &quot;bomba de Peso en vacío&quot; en la plantilla (tabla 1), se utilizará para calcular la relación de llenado. </li><li> Coloque la aguja de llenado de la bomba a una jeringa estéril de 1 cc y llenar cuidadosamente la jeringa con solución de Ang II de la forma adecuadatubo de plástico numerada. Es importante evitar que entre aire en la jeringa. </li><li> Eliminar todas las burbujas de aire y cuidadosamente la jeringa mientras la aguja está colocada hacia abajo. Mantenga la aguja / jeringa en esta posición para evitar la introducción de burbujas dentro de la bomba. </li><li> Introduzca suavemente la aguja de llenado en el cuerpo de la bomba. Avanzar en la punta de la aguja dentro de la bomba. No se apoye con la punta de la aguja firmemente en la parte inferior de la bomba. </li><li> Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para llenar la bomba con una solución de Ang II. Una sombra oscura dentro de la bomba indica el nivel de llenado. El volumen de llenado es de aproximadamente 246 l, según las instrucciones. </li><li> Deje de llenar la bomba y retire con cuidado la aguja tan pronto como una gota de fluido se levanta de la bomba. </li><li> Inserte moderador de flujo en la bomba a través del orificio en la parte superior del cuerpo de la bomba hasta que no se ve brecha entre la cabeza del moderador de flujo y la parte superior del cuerpo de la bomba (Figura 1). </li><li> La inserción de moderato en el cuerpo de la bomba conduce a alguna pérdida de líquido de la apertura de la moderador de flujo. Borrar cuidadosamente todo exceso de líquido que podría haber escapado durante la colocación de los moderadores. </li><li> Pesar bomba llena. Anotar el peso bajo &quot;Bomba Peso Lleno&quot; en la plantilla. </li><li> Calcula grado de llenado (%) = (Bomba de Peso &quot;lleno&quot; - &quot;vacío&quot;) x 1.000 / significa llenar el volumen x 100. <ol><li> Calcula Razón de llenado como se indica en la Tabla 1. Idealmente, llenando relación debe ser igual o mayor que 100%. Bomba de llenado si el grado de llenado es &lt;95% (implicando que las burbujas de aire puede estar presente en la bomba). </li></ol></li><li> Coloque la bomba de llenado en el tubo marcado con 4 ml (Paso 2.5), con frente a la cabeza moderador hacia arriba. Añadir un volumen suficiente de solución salina estéril para cubrir la bomba. Mantenga la bomba en el tubo de solución salina hasta la implantación. </li><li> Colocar los tubos en una incubadora a 37 ºC. Incubar las bombas de O / N (por lo menos 12 hr) para permitir el cebado parcial, y luego implantar en ratones. Bombación de Ang II comienza aproximadamente 24 horas después de la implantación, que permite a los ratones para recuperarse de la cirugía antes de cualquier posible estrés que surge durante AngII infusión. </li></ol> 4. Preparación para la implantación de la bomba <ol><li> Autoclave (modo de gravedad, ciclo de secado, 15 min) gasas, torundas de algodón y herramientas quirúrgicas incluyendo tijeras, pinzas hemostáticas, pinzas, grapas y grapadora al menos 1 día antes de la cirugía. </li><li> En una sala de procedimientos, preparar vaporizador para la anestesia utilizando isoflurano. Abre paños estériles en una campana de flujo laminar, y coloque cono de la nariz para la anestesia isoflurano. Coloque betadine, etanol al 70%, agua estéril, esterilizador de cuentas, preparado de antiséptico, torundas, gasas, y bombas llenas en una campana laminar. </li><li> Don una mascarilla y bata, a continuación, abra una cortina exterior en una campana laminar con las manos limpias. Póngase los guantes estériles y abrir el paquete en el interior estéril. </li></ol> 5. Procedimiento quirúrgico de la implantación de la bomba <ol><li> Coloque el ratón en un cham inducciónber con flujo de entrada de isoflurano a una velocidad de flujo de 1,5 - 2%. Monitorear el ratón durante 2 - 3 minutos después de decúbito. Afeitarse un área aproximadamente del tamaño de un cuarto, sobre el hombro izquierdo o derecho. </li><li> Coloque ratón en una campana laminar, con su nariz a ras con un cono conectado al flujo de salida isoflurano (Figura 2A). Coloque la cabeza del ratón hacia la mano dominante del cirujano. Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Asegúrese de que el ratón no tiene respuesta a la estimulación del dolor antes de la cirugía. Por ejemplo, la respuesta del pedal es un buen indicador para el dolor. </li><li> Swab y limpie zona afeitada con betadine seguido de tres toallitas con etanol al 70%. Don o cambiar los guantes estériles. </li><li> Utilice un bisturí quirúrgico para hacer una incisión ~ 1 cm detrás de la oreja sobre la lámina del hombro de la pata delantera. Esta incisión debe ser perpendicular a la cola. Tenga cuidado de cortar tejidos solamente la piel y no subyacente. </li><li> Hold forceps en una mano para abrir la incisión, y el uso de la otra mano para hacer un túnel subcutáneo debajo de la piel usando una pinza hemostática (Figura 2B). </li><li> Avanzar punta pinza hemostática hacia la cola, y crear un bolsillo para la bomba. Esto se logra abriendo cuidadosamente las mandíbulas de la pinza debajo de la piel para abrir una bolsa. Retirar la pinza de incisión. </li><li> Inserte la bomba dentro de la incisión con la cabeza moderador posicionado en la parte trasera del ratón (Figura 2C). Empuje suavemente la bomba completamente en el bolsillo. Debe haber suficiente espacio libre para cerrar la herida sin tensión o estiramiento de la piel. </li><li> Una vez que una bomba ha sido insertada, apriete firmemente ambos lados de la incisión, enderezar para que los bordes se encuentran, y colocar 1 o 2 clips para cerrar la herida (Figura 2D). Inspeccionar el sitio de la incisión para asegurar que no es el cierre completo de la herida, y que la bomba no está presionando directamente en el sitio. </li><li> Aplicar crema de lidocaína tópica(4% p / p) con un limpio ratón swab.Remove algodón desde el cono de la nariz, y lo coloca en una almohadilla caliente hasta que se recupera la conciencia. Después de recuperarse, el ratón se devuelve a su jaula. </li><li> Coloque los instrumentos quirúrgicos en un esterilizador de cuentas durante 10 segundos entre los ratones. Dejar enfriar antes de su uso. Guantes limpios con preparado de antiséptico entre los ratones. Controlar todos los ratones hasta que se logra la recuperación completa. </li><li> Supervise de cerca los ratones después de la cirugía. Inyectar un bolo de solución salina estéril (0,2 - 0,3 ml) por vía subcutánea si un ratón muestra signos de sufrimiento, la deshidratación o pérdida de peso aparente. Observar los ratones al menos dos veces al día durante los primeros 10 días, y al menos una vez cada día posteriormente. Realice una necropsia inmediatamente si algún ratones mueren durante AngII infusión. Retire los clips de la herida entre los 7 - 14 días después de la cirugía. </li></ol> 6. La recolección, Reparación, Servicio de limpieza, e Imagen de aortas <ol><li> Cortar abrir el tórax del ratón y cavidades abdominales ventral, corte open aurícula derecha, perfundir con solución salina a través del ventrículo izquierdo del corazón para eliminar la sangre en la aorta, y luego cosechar la aorta 27. </li><li> Coloque aortas recolectadas en tubos de plástico que contienen al menos 3 ml de paraformaldehído al 4% o 10% de formalina tamponada neutra durante 24 - 48 h 27. </li><li> Retire tejidos adventicia cuidado. Aorta Pin en cera negro con alfileres. Adquirir imágenes de la aorta con el mismo aumento. Incluir una regla en cada imagen para la calibración, como se muestra en la Figura 3. </li></ol> 7. En la cara de imagen de aortas <ol><li> Cortar aorta abierta longitudinalmente a través de la curvatura exterior e interior del arco aórtico, y cortar ramas principales abiertas incluyendo innominada, arteria carótida izquierda y la arteria subclavia izquierda. Pin aorta plana con adventicia externa que pone al lado de la cera negro. </li><li> Adquirir imagen en la cara de la superficie de la íntima de la aorta con la misma ampliación. Incluir una regla en cada imagen para la calibración, como se muestran en la Figura 4. </li></ol>

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</ol>

La publicación de este artículo es patrocinado por Alzet.

Las bombas osmóticas entrega de Ang II por vía subcutánea es un método de rutina para la inducción de los aneurismas de aorta en ratones. Basado en datos de muchos laboratorios, ha habido hallazgos consistentes que este es un método fiable y reproducible para estudiar tanto AAAs 3,4 y 22-26 de AAT en ratones. Por lo tanto, este modelo de ratón se considera un modelo que recapitula varias características de los aneurismas aórticos humanos y proporciona una visión mecanicista en estas enfermedades devastadoras. Mientras que el envejecimiento es un factor de riesgo de AAA en los seres humanos, no se ha estudiado sistemáticamente por los AAA inducidos por angiotensina II en ratones. Sin embargo, parece incidencia y la gravedad de los AAA inducidas por AngII son similares en ratones a la edad de 8 - 48 semanas 4,5,7. En la actualidad, sólo hay unos pocos estudios que informaron TAA inducidos por angiotensina II en ratones a la edad de 8 - 24 semanas 22-26, que no presenten diferencias relacionadas con la edad aparente sobre la formación de TAA. Mujeres ratones tienen una incidencia mucho menor de los AAA de ratones machos infundidos con AngII 4,28. También vale la pena señalar que la incidencia de la inducida por Ang II AAA es mucho mayor en hipertensión que los ratones normo-cholesterolemic, que es más del 50% frente a menos del 30%, respectivamente. Además, es frecuente rotura de la aorta (aproximadamente 10 - 30%) tanto en ratones normo e hipercolesterolémicos durante AngII infusión. La infusión de Ang II a una velocidad de 1,000 ng / kg / min en ratones hipercolesterolémicos, tales como el receptor de LDL - / - ratones alimentados con una dieta o apolipoproteína Western (apoE) - / - ratones alimentados con una dieta normal o Western, tiene efectos máximos sobre AAA desarrollo 3,4,29. Esta velocidad de infusión es óptima para un estudio en el que se espera la manipulación de un gen de interés en ratones hipercolesterolémicos para reducir los AAA. Si se espera que una manipulación en ratones hipercolesterolémicos para aumentar AAAs, se recomienda para infundir AngII a una velocidad de 500 ng / kg / min o más baja 30. En contraste con los AAA, no hay ninguna demostraciónasociación nstrated entre el género masculino o la hipercolesterolemia y la inducida por Ang II TAA 25. Sin embargo, de manera similar a los AAA, si se espera que la manipulación de un gen de interés para aumentar la AAT, se recomienda una velocidad de infusión menor que 1000 ng / kg / min para AngII infusión. También es importante saber que la incidencia y la gravedad de los aneurismas aórticos inducida por AngII varían entre los ratones individuales y entre los estudios. Si los ratones no desarrollan aneurismas de aorta, una posibilidad potencial es que Ang II puede que no se han entregado con éxito en ratones. Para la validación de una alta tasa de infusión de Ang II, en kg min, se recomienda como 1000 ng / / medición de la presión arterial antes de, y durante, la infusión de Ang II utilizando un método de cola-brazalete no invasiva 31. AngII infusión a una velocidad de 1,000 ng / kg / min aumenta la presión arterial sistólica en ratones. Además, las concentraciones de renina en plasma se pueden medir durante AngII infusión o en la terminación desde Ang II tiene un voto negativo de rsecreción enin. Por lo tanto, la infusión de AngII conduce a reducciones en las concentraciones de renina en plasma. Si un ratón infundido con Ang II no tiene patologías aparentes aórticas, sin aumento de la presión arterial, y no hay disminución de la concentración de la renina plasmática, que indicaría que Ang II no se ha entregado de manera eficiente a través de la mini-bomba osmótica implantada. Le recomendamos quitar este ratón del estudio. También es importante señalar que algunos ratones no desarrollan aneurismas aórticos pesar del aumento de la presión arterial sistólica y la disminución de las concentraciones plasmáticas de renina. Estos ratones deben permanecer en el estudio. En resumen, AngII infusión se consigue mediante la implantación subcutánea usando bombas osmóticas para inducir aneurismas de la aorta en ratones. Este método ofrece AngII constantemente a una tasa definida para duraciones designadas que se utilizan para estudiar tanto los AAA y TAA.

Los aneurismas aórticos exhiben expansión luminal permanente de la aorta que presagia ruptura y por lo general conduce a la muerte. Esta enfermedad se presenta en las dos regiones de la aorta abdominal y torácica, que se denominan como aneurismas aórticos abdominales (AAA) y aneurismas de aorta torácica (TAA), respectivamente. Debido a una comprensión incompleta de los mecanismos moleculares y procesos fisiopatológicos, no hay ninguna terapia médica probado que puede impedir la expansión o ruptura de cualquiera de los tipos de aneurismas aórticos. Puesto que es difícil de adquirir muestras de pacientes y realizar experimentos en seres humanos directamente, la investigación se centra en la definición de mecanismos de los AAA ha sido extrapolado frecuencia de los modelos animales. Un modelo animal comúnmente usado es la infusión subcutánea de la angiotensina II (AngII) en ratones. En comparación con otros métodos quirúrgicos para inducir AAA en ratones, como la perfusión elastasa intra-aórtica o aplicación peri-aórtica de cloruro de calcio que requieren laparotomía 1,2, esto method no requiere entrada en la cavidad del cuerpo y requiere experiencia quirúrgica mínimo 3,4. Infusión subcutánea de AngII a través de bombas osmóticas para inducir AAAs se informó inicialmente en baja densidad de lipoproteínas receptor (LDL) - / - ratones alimentados con una dieta enriquecida en grasa saturada 3, y posteriormente en apoE - / - ratones alimentados con una dieta normal de laboratorio 4. Muchos estudios recientes también han demostrado que induce AAAs AngII en ratones normolipidémicos 5-7. El enfoque de la infusión de AngII se ha aplicado para inducir los AAA y explorar mecanismos moleculares así como el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales (por ejemplo, 5-15) ya que este modelo recapitula muchas características observadas en los AAA humanos. Por ejemplo, los factores de riesgo de AAA humanos, como el tabaquismo, la edad y el género masculino también aumentan los AAA inducidos por angiotensina II en ratones 16,17. La asociación de hipercolesterolemia con AAA en el ser humano requiere aclaración. Sin embargo, tiene seres coherente que la hipercolesterolemia aumenta AngII inducida AAA en ratones 18. Patologías de los AAA inducidas por AngII en ratones son muy heterogénea y se caracterizan por la infiltración de macrófagos profunda, la degradación del colágeno, la formación trombótica y la resolución, y la neovascularización 19-21. En contraste con la ubicación de aorta infrarrenal más común de los AAA en los seres humanos, AngII inducida en ratones AAAs se producen en la región aórtica suprarrenal. Otra característica ubicua de inducida por Ang II AAA es la ruptura medial transmural, que conduce a la trombosis transmural. No está claro si la ruptura elastina transmural se produce en los seres humanos desde el desarrollo patológico de los AAA en los seres humanos no se ha estudiado exclusivamente debido a la falta de tejidos aneurismáticas de etapas anteriores. AngII infusión en ratones también conduce a la profunda expansión de la región de la aorta torácica, que está restringida principalmente a la aorta ascendente que es la región más común para TAA en los seres humanos <sup&gt; 19,22-26. Similar a los AAA inducidos por angiotensina II, TAA inducida durante AngII infusión también recapitular muchas características de AAT humana 25. Sin embargo, a diferencia de los AAA inducidos por angiotensina II, TAA inducidos por angiotensina II no están asociados con la hipercolesterolemia y no tienen diferencias de género. El objetivo general de la infusión de Ang II subcutánea en ratones es el estudio de las características patológicas y mecanismos moleculares de la AAA y la AAT.

<table><tbody><tr><td>Angiotensina II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>compuesto utilizado para inducir aneurismas aórticos</td></tr><tr><td>Bombas osmóticas Alzet</td><td>Corporación DURECT</td><td>Alzet Modelo 2004</td><td>factible para infusión de 28 días en ratones con un peso > 20 g</td></tr><tr><td>Dieta enriquecida con grasas saturadas</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>42% calorías/calorías para estimular la hipercolesterolemia en ratones receptores de LDL -/-</td></tr></tbody></table>

subcutánea angiotensina ii infusión usando osmótica bombas induce aneurismas aórticos en ratones

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Las bombas osmóticas suministran compuestos continuamente a un ritmo constante en animales pequeños. En este artículo se presenta un protocolo estándar utilizado para inducir aneurismas aórticos mediante infusión subcutánea de angiotensina II (AngII) a partir de bombas osmóticas implantadas. Este protocolo incluye el cálculo de la cantidad y disolución de AngII, el llenado de la bomba osmótica, la implantación de bombas osmóticas por vía subcutánea, la observación después de la implantación de la bomba y la extracción de aortas para visualizar los aneurismas aórticos en ratones. La infusión subcutánea de AngII a través de bombas osmóticas siguiendo este protocolo es una técnica fiable y reproducible para inducir aneurismas de aorta abdominal y torácica en ratones. La duración de la infusión oscila entre unos pocos días y varios meses, según el propósito del estudio. AngII 1.000 ng/kg/min es suficiente para proporcionar efectos máximos sobre la formación de aneurismas de aorta abdominal en modelos de ratón masculinos hipercolesterolémicos, como ratones con deficiencia de apolipoproteína E o con deficiencia de receptores de lipoproteínas de baja densidad. La incidencia de aneurismas de aorta abdominal inducidos por la infusión de AngII a través de bombas osmóticas es de 5 a 10 veces menor en ratones hembra hipercolesterolémicos y también menor en ambos sexos de ratones normocolesterolémicos. Por el contrario, los aneurismas de la aorta torácica inducidos por AngII en ratones no son hipercolesterolemia ni dependen del sexo. Es importante destacar que múltiples características de este modelo de ratón recapitulan las de los aneurismas aórticos humanos.

Los 4 del receptor de LDL masculina - / - ratones descritos en la sección Protocolo fueron sacrificados después de 4 semanas de AngII infusión. Aortas se recogieron, se limpian, y la imagen para visualizar dilataciones aórticas. Como se muestra en la Figura 3, aortas tienen varias características diferentes, incluyendo la expansión de la región suprarrenal (AAA; Figura 3a), la expansión de la región ascendente (AAT; Figura 3B), o la expansión de ambas regiones (presencia tanto de los AAA y AAT; figura 3C), mientras que la morfología de un ratón fue macroscópicamente normal (Figura 3D). La dilatación de la aorta abdominal se cuantifica midiendo la anchura ex vivo máxima de la región suprarrenal, como se ilustra por la línea roja en la Figura 3A. Para medir la dilatación de la aorta ascendente, aortas fueron cortadas abierto y puestas como se muestra en la Figura 4. Área de superficie de la íntima se midió en la región de la aorta ascendente (área rodeada por The líneas rojas en la figura 4A) para cuantifican TAA. Una regla se incluyó en cada imagen para normalizar las mediciones, como se muestra en ambas figuras 3 y 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" /> . Figura 1. Imagen Representante de bomba osmótica llena Cada bomba contiene dos partes: un cuerpo principal y un moderador de flujo. Después de llenar el cuerpo de la bomba con AngII, el moderador de flujo se inserta para sellar la bomba. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" /> Figura 2. Proceso de la cirugía de implantación de la bomba (A) del ratón se coloca en una campana laminar con un cono de nariz que es continuamente la liberación de isoflurano y oxígeno.; (B) una pinza hemostática recta se inserta en la incisión de la piel para hacer un túnel subcutáneo; (C) de la bomba se inserta a través de la<html> incisión de la piel con suavidad; (D) La incisión de la piel se grapa después de la inserción de la bomba. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" /> Figura 3. imágenes aórtica (ex vivo) de ratones infundidos con AngII AngII 1000 ng / kg / min se infundió en receptor de LDL hombre -. / - Ratones durante 28 días. (A) AAAs acompañada de trombosis; La línea roja (2,05 mm) muestra la medición de la anchura máxima de la aorta en la región suprarrenal. (B) Ascendente dilatación aórtica (TAA) con aorta abdominal macroscópicamente normal; (C) dilataciones profundos tanto en el ascenso y regiones de la aorta suprarrenal (TAA y AAAS); (D) de la aorta macroscópicamente normal sin aparente dilatación del ascendente o región de la aorta suprarrenal. 4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. In caras de las regiones de la aorta torácica de ratones infundidos con AngII AngII 1.000 ng / kg / min se infundió en el receptor de LDL masculina -. / - Ratones durante 28 días. Superficie esbozado por una línea roja representa la región de la aorta ascendente incluyendo parte del arco aórtico. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="2"> Dosis requerida </td><td></td><td> 1000 </td><td colspan="2"> ng / kg / min </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> Comience peso corporal (el más grande del ratón) </td><td> 24.8 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Ganancia de peso corporal total estimado </td><td> 1 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> Velocidad de bombeo </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> l / h </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Number de los ratones </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="2"> Dosis por hora para los animales </td><td></td><td> 1518 </td><td> ng </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Conc necesaria </td><td></td><td></td><td> 6072 </td><td> ng / l </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="2"> Por 300 solución ul </td><td></td><td> 1.82 </td><td colspan="2"> mg / l 300 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> SOLUCIÓN ES NECESARIO </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="2"> AngII total (mg) </td><td></td><td> 7.3 </td><td> mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="2"> Disuelto en solución salina y# 160; </td><td></td><td> 1200 </td><td> l </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ratón </td><td> Peso corporal </td><td> Factor de dilución </td><td colspan="2"> Volumen (l) </td><td colspan="2"> Bomba Peso (g) </td><td> Relación de Llenado </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Saline </td><td> Vacío </td><td> Lleno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296.4 </td><td> 3.6 </td><td> 1.1443 </td><td> 1.3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1.1677 </td><td> 1.4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263.7 </td><td> 36.3 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Factor de dilución = peso corporal del peso del ratón / cuerpo del ratón más grande </td><td></td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ratón </td><td> Peso corporal </td><td> Factor de dilución </td><td colspan="2"> Volumen (l) </td><td colspan="2"> Bomba Peso (g) </td><td> Relación de Llenado </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Saline </td><td> Vacío </td><td> Lleno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296.4 </td><td> 3.6 </td><td> 1.1443 </td><td> 1.3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1.1677 </td><td> 1.4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263.7 </td><td> 36.3 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Cálculo de la infusión de 28 días a través de bombas osmóticas.

La implantación subcutánea de bombas osmóticas proporciona un enfoque conveniente para suministro prolongado y consistente de compuestos. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente para estudiar las dos aneurismas de la aorta abdominal y torácica en ratones.

Subcutánea angiotensina II infusión usando osmótica Bombas Induce aneurismas aórticos en ratones

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las características patológicas y los mecanismos moleculares de las aneurismas aórticas en ratones. Esto se logra primero preparando una bomba osmótica con solución de angiotensina dos. Luego se crea una bolsa en la piel de la espalda del animal, en la cual se inserta la bomba.En última instancia, la dilatación de la aorta en las regiones aórticas torácica y abdominal puede evaluarse mediante imágenes ex vivo. Por lo tanto, primero implementamos esta técnica porque deseábamos definir el papel de la presión arterial cuando infundíamos angiotensina para promover el desarrollo de aterosclerosis. El procedimiento será demostrado por Deborah Hart y Angio banan, ambos miembros del Centro de Investigación Cardiovascular Soha para llenar las bombas osmóticas.Comience registrando el número de lote de las bombas y los moderadores de flujo incluidos con el cuerpo principal de la bomba y el flujo. Use guantes para evitar transferir aceite de las manos al exterior del carcasa de la bomba. A continuación, abra únicamente el número de bombas y moderadores de flujo necesarios para el estudio.Luego pese cada bomba, incluyendo tanto el cuerpo principal como el moderador de flujo, anotando el peso con cuatro decimales. Este peso, denominado peso de la bomba vacía en la plantilla, se utilizará para calcular la proporción de llenado una vez que se hayan pesado todas las bombas. Ate la aguja de llenado de la bomba a una jeringa estéril de un cc y llene cuidadosamente la jeringa con solución recién preparada de angiotensina dos procedente del tubo de plástico numerado adecuadamente.Retire cuidadosamente todas las burbujas de aire de la jeringa con la aguja orientada hacia abajo. Luego mantenga la jeringa en esta posición para evitar la introducción de burbujas en la bomba. Inserte suavemente la aguja de llenado en el cuerpo de la bomba.Cuando la aguja esté en su lugar, avance la punta hacia la bomba hasta que toque ligeramente el fondo de esta. Luego, presione lentamente el émbolo para dispensar aproximadamente 246 microlitros de la solución. La sombra oscura dentro de la bomba puede utilizarse para monitorear el nivel de llenado.La bomba está llena. Cuando una gota de fluido emerja de la bomba, retire cuidadosamente la aguja e inserte el moderador de flujo en la bomba a través del orificio en la parte superior del cuerpo de la bomba hasta que no se observe ninguna separación entre la cabeza del moderador de flujo y la parte superior del cuerpo de la bomba. Absorba cuidadosamente cualquier fuga adicional de fluido que resulte de la inserción.Luego pese la bomba llena y registre el peso en la celda correspondiente de la bomba y el peso lleno en la plantilla. A continuación, se puede calcular la relación de llenado utilizando la fórmula, y estos datos pueden introducirse en la celda de relación de llenado de la plantilla. Idealmente, la relación de llenado debe ser igual o mayor al 95%. Cuando la bomba esté llena, colóquela en un tubo plástico estéril de cuatro mililitros adecuado con la cabeza del moderador orientada hacia arriba, y agregue un volumen suficiente de solución salina estéril para cubrir la bomba.Luego, cuando todas las bombas hayan sido almacenadas, coloque los tubos en un incubador a 37 grados Celsius durante al menos 12 horas para permitir un cebado parcial de las bombas el día del implante. Usando bata, mascarilla y guantes, afeite un área del tamaño de un cuarto sobre el hombro de un ratón anestesiado y transfiera el animal a una cabina de flujo laminar. Después de colocar ungüento en los ojos del animal y confirmar la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo del pie, limpie y pase tres veces por el área afeitada con Betadine, seguido de tres pasadas con etanol al 70%.A continuación, utilice un escalpelo quirúrgico esterilizado en autoclave para hacer una incisión de un centímetro de largo en la piel, perpendicular a la cola y detrás de la oreja, sobre la escápula de la pata delantera. Luego, con una pinza en una mano, abra la incisión utilizando un hemostato. Con la otra mano, haga un túnel subcutáneo bajo la piel avanzando la punta del hemostato hacia la cola.Abra cuidadosamente las mandíbulas del hemostato para crear una bolsa para la bomba. Luego, sustituya el hemostato por la bomba correspondiente adecuada, colocando la cabeza moderadora en la parte trasera del ratón, e introduzca suavemente la bomba completamente en el bolsillo. Debe haber suficiente espacio libre para cerrar la herida sin tensión ni estiramiento de la piel.Una vez que la bomba esté en posición, pellizque y estire firmemente ambos lados de la incisión para que los bordes coincidan y cierre la piel con uno o dos clips quirúrgicos. Inspeccione el sitio de la incisión para asegurarse de que la herida esté completamente cerrada y de que la bomba no esté presionando directamente sobre la incisión. Luego, use un hisopo limpio para aplicar crema tópica de lidocaína en el área.Finalmente, transfiera el ratón a una almohadilla calefactora hasta que recupere la conciencia y luego devuelva al animal a su jaula. En este experimento, tras cuatro semanas de infusión de angiotensina mediante bombas implantadas como se acaba de demostrar, se obtuvieron estas aortas de ratones deficientes en el receptor de lipoproteínas de baja densidad para visualizar sus dilataciones aórticas. Como se observa en las imágenes, las aortas presentaron varias características diferentes, incluyendo la expansión de la región suprarrenal, la expansión de la región ascendente, o la expansión de ambas regiones, con un ratón que exhibió una morfología notablemente normal.Luego se cuantificó la dilatación de la aorta abdominal midiendo el ancho máximo ex vivo de la región senal, como se ilustra con la línea roja para medir la dilatación aórtica ascendente. Luego se abrió la aorta y se fijó como se muestra. Se midió el área de superficie íntima en la región aórtica ascendente con las reglas en cada una de estas imágenes y en las siguientes, incluidas para garantizar la estandarización de las mediciones una vez dominado el procedimiento.Este procedimiento no debería tardar más de cinco minutos por masa.

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Imágenes por ultrasonido se ha convertido en una modalidad común para determinar las dimensiones luminales de aneurismas de aorta torácicas y abdominales en ratones. Este protocolo describe el procedimiento para adquirir imágenes de ultrasonido bidimensional confiable y reproducible de la aorta ascendente y abdominal en ratones.

Imágenes por ultrasonido de la Aorta torácica y Abdominal en ratones para determinar dimensiones de aneurisma

Describimos un protocolo quirúrgico para inducir consistentemente aneurismas de la aorta torácica descendentes robustos en ratones. El procedimiento consiste en la toracotomía izquierda, la exposición a la aorta torácica y la colocación de una esponja empapada en elastasa pancreática porcina en la pared aórtica.

Modelo Quirúrgico Murino de Aneurisma aórtico torácico descendente fortuito tópico

Este novedoso modelo crea aneurismas aórticos infrarrojos robustos en cerdos utilizando una combinación de angioplastia con balón, perfusión por elastasa/colagenasa, aplicación tópica de elastasa y administración oral de compuestos-aminopropionitrilo, que interfiere con la reticulación de colágeno.

Modelo porcino del aneurisma aórtico abdominal infrarrenal

El presente protocolo describe un método quirúrgico estandarizado para el modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de elastasa a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en ratones.

Modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por la aplicación perivascular de elastasa

Este protocolo describe la implantación consecutiva de una bomba osmótica para inducir aneurisma aórtico abdominal mediante la liberación de angiotensina II en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE) y de un puerto de acceso vascular con un catéter de vena yugular para tratamiento farmacológico repetido. El monitoreo del desarrollo del aneurisma por ultrasonido 3D se lleva a cabo de manera efectiva a pesar de los implantes dorsales.

Tratamiento farmacológico mediante catéter venoso central en un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal inducido por angiotensina II y monitorización por ecografía 3D

Este protocolo describe un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal (AAA) inducido por fosfato de calcio para estudiar las características patológicas y los mecanismos moleculares de los AAA.

Un modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por fosfato de calcio

Este manuscrito presenta un protocolo para establecer un modelo de aneurisma de aorta abdominal en ratón utilizando cloruro de calcio y elastasa, combinando las ventajas de los métodos de modelado anteriores. Este modelo se puede utilizar para investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a los aneurismas de aorta abdominal.

Un modelo de aneurisma de aorta abdominal de ratón por infiltración periadventicial de cloruro de calcio y elastasa

Este protocolo describe un enfoque quirúrgico metódico para modelar aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones mediante una combinación de aplicación directa de elastasa a la aorta infrarrenal y administración de ß-aminopropionitrilo a través del agua potable.

Modelado avanzado de aneurisma de aorta abdominal en ratones mediante combinación de elastasa tópica y ß-aminopropionitrilo oral

Este protocolo proporciona un procedimiento detallado, paso a paso, para la inducción de la disección aórtica torácica en ratones. En concreto, incluye el cálculo preciso de las dosis necesarias de β-aminopropionitrilo y angiotensina II, el procedimiento de llenado de la bomba osmótica y la técnica de implantación de la bomba osmótica.

Modelo murino de disección aórtica torácica inducida por infusión oral de β-aminopropionitrilo y angiotensina II subcutánea

Este protocolo proporciona un método repetible y fiable para inducir aneurismas de la aorta abdominal (AAA) en ratones C57BL/6 mediante sensibilización con elastina y aplicación de elastasa perivascular, como un modelo AAA que incorpora un componente de sensibilización inmune.

Creación fiable de un modelo de aneurisma aórtico abdominal murino utilizando sensibilización con elastina y elastasa perivascular

Aprende a inducir aneurismas aórticos en ratones mediante infusión subcutánea de angiotensina II con bombas osmóticas. Este método permite estudiar la dilatación aórtica torácica y abdominal en investigación cardiovascular.

Subcutánea angiotensina II infusión usando osmótica Bombas Induce aneurismas aórticos en ratones

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