Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de Plasmodium falciparum

Los microRNAs humanos se translocan de los eritrocitos del huésped a los parásitos Plasmodium falciparum. En este trabajo se describen las técnicas utilizadas para transfectar microRNAs sintéticos en eritrocitos del huésped y aislar todos los RNAs de P. falciparum. Además, en este trabajo se detallará un método de aislamiento de polisomas en P. falciparum para determinar la ocupación ribosómica y el potencial traduccional de los transcritos de parásitos.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el papel de los microARN de eritrocitos en la regulación génica postranscripcional de los transcritos de plasmodium falciparum. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la malaria, como cómo los eventos de empalme de ARN con ARN pequeños del huésped o del parásito pueden afectar el potencial de traducción de los ARNm de fusión. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de capturar ARN totales y pequeños juntos en un solo grupo, lo que demuestra la presencia de ARN pequeños y ARN de fusión en una célula.

Además, este procedimiento utiliza perfiles de polisomas para mostrar cómo esos pequeños ARN afectan la traducción de sus productos de ARNm de fusión. Para comenzar, configure la transfección por 300 microlitros de glóbulos rojos en medio completo contra la malaria a 800 veces G durante cinco minutos. Lavar los eritrocitos dos veces con medio RPMI, resuspender las células en una mezcla completa de citocrito al 50% de hematocrito.

A continuación, transfiera las células a una válvula de electroporación y agregue 10 microgramos de micro ARN conjugado con biotina DYS th o un micro ARN de control negativo no conjugado. Para electroporar las celdas, coloque el vete en un electroporado y administre un solo pulso. A continuación, coloque una placa en las células e infórmelas con plasmodium falciparum después de cuatro horas, como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, añada 50 microlitros de ávido y perlas empaquetadas y peladas a 10 microgramos de ARN del parásito en un tubo de microcentro, e incube el tubo con rotación durante una hora a cuatro grados centígrados. Centrifugar la tira y las perlas a 800 veces G durante 30 segundos, y luego lavar el pellet con 500 microlitros de tampón RNP que contiene una dilución de uno a 1000 del inhibidor de ARN. A continuación, eluye, el ARN de las perlas de Resus, suspendiéndolas en 200 microlitros de ARN.

Captura el tampón de elución que contiene el exceso de biotina. Incubar las perlas durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación. A continuación, centrifugar las perlas a 800 veces G durante 30 segundos y recoger el ARN sobrenadante.

Es fundamental eluir con un exceso de biotina y utilizar la cantidad mínima de estreptococos ávidos y perlas para garantizar una elución específica adecuada. Esto reduce el enriquecimiento de ARN de fondo. Finalmente, determinar el grado de enriquecimiento de los transcritos de P falciparum y el enriquecimiento de micro ARN por R-T-P-C-R cuantitativo como se describe en el protocolo de texto para comenzar la separación de polisomas.

Primero coloque cinco mililitros de una solución de sacarosa al 50% en un tubo de ultracentrífuga. A continuación, coloque cuidadosamente cinco mililitros de una solución de sacarosa al 15% sobre la solución al 50%. A continuación, selle el tubo de degradado con perfil e incline con cuidado el tubo hasta que quede horizontalmente sobre la mesa de trabajo.

Asegúrese de que el tubo esté en una posición estable para evitar que ruede. Mantenga el tubo en esta posición durante al menos dos horas para permitir que se forme el degradado. Mientras tanto, recoja aproximadamente 100 mililitros de un cultivo asíncrono de sangre infectada con plasmodio a una temperatura del 3 al 5%.

Luego agregue 10 mililitros de medio de cultivo que contenga dos milimolares ciclo, heide, e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, centrifugar las células a 500 veces G durante siete minutos y luego lavarlas dos veces con 80 mililitros de PBS que contienen 200 micromolares cyclo heide resus. Suspenda el pellet en PBS con cicloheximida y colóquelo sobre hielo.

Granule las células y elimine el sobrenadante para estimar el volumen de la pastilla. A continuación, licitar las células en un volumen final de 4,25 mililitros de lisis, tampar e incubar durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con rotación. Los intentos anteriores de perfilar los polisomas y de las especies causantes de la malaria revelaron principalmente monos porque la lisis de ponentes conduce a la descomposición del polisoma en zonas mono.

Aquí utilizamos un tampón de lisis que lisis el eritrocito y los parásitos simultáneamente para preservar el patrón de polisomas de plasmodium falciparum, transfiriendo el lisado a tubos de microcentrífuga y luego girando a 16, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. En un tubo ultracentrífugo preenfriado de cinco mililitros por separado, agregue 1,25 mililitros de solución fría de almohadilla de sacarosa 0,5 molar usando una jeringa con una aguja de calibre 27. Coloque con cuidado 3,75 mililitros del sobrenadante lisado por encima de la almohadilla de sacarosa.

Centrifugar la muestra a 366.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 146 minutos. Durante este tiempo, regrese lentamente el tubo de ultracentrífuga matado con sacarosa a una posición vertical y déjelo reposar sobre hielo durante al menos 15 minutos. Después de retirar el lisado de la ultracentrífuga, recoja cuidadosamente el sobrenadante en un dos cónicos de 15 mililitros.

Almacene el sobrenadante a menos 80 grados centígrados para preservar la fracción de ARN no unida a los ribosomas. A continuación, vuelva a suspender el pellet de ribosoma en 500 microlitros de suspensión Resus, tampador pipeteando durante cinco minutos para mezclar y centrifugar la muestra a 16.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Para eliminar el material insoluble, retire con cuidado el sello de parámetro en el tubo de gradiente para evitar perturbar el gradiente y, a continuación, coloque la suspensión ribosómica en la parte superior con una jeringa y una aguja de calibre 27.

Después de centrifugar el tubo a 200.000 veces G a cuatro grados Celsius durante 180 minutos, almacene los gradientes a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para cargar en el fraccionador. Coloque un tubo de ultracentrífuga vacío en el fraccionador de gradiente y lave el sistema con agua libre de ARN durante cinco minutos. Durante el lavado, ajuste la sensibilidad del detector de absorbancia UV a 254 nanómetros a 0,2.

Aunque esto puede necesitar ser ajustado dependiendo de la señal. A continuación, ponga la señal de referencia a cero a medida que el agua fluye a través del detector. Después de lavar el colector, invierta el flujo de fluido a través del fraccionador para vaciar las líneas y luego retire el tubo de ultracentrífuga vacío.

Pase una solución de sacarosa al 60% a través del FRACCIONADOR hasta que salga del aparato de agujas. A continuación, coloque el tubo de gradiente cargado en la parte superior de la cámara de carga y apriete el sello. Perfora el fondo del tubo con la aguja.

A continuación, restablezca la velocidad de flujo del fraccionador a 12,5 por 10 y recoja fracciones de 18 segundos en tubos de microcentrífuga. Inicie el flujo directo de la solución de sacarosa al 60% para eluir las fracciones antes de que la primera gota de la solución de gradiente ingrese a un tubo de microcentrífuga. Comience tanto la recolección como la grabación en vivo de la absorbancia a la señal de 254 nanómetros.

Cuando la señal absorbente cae bruscamente en la interfaz de la solución de sacarosa al 50% y al 60%, detenga el flujo y la grabación. Almacene las fracciones de gradiente a menos 80 grados centígrados. A continuación, invierta el flujo de fluido hasta que la solución al 60% se vacíe fuera del tubo de ultracentrífuga.

Retire el tubo y comience el análisis del siguiente gradiente. La transfección de glóbulos rojos con microARN 4 5 1, seguida de la recuperación de los híbridos de ARNm de micro NA biotinilados, reveló un enriquecimiento de los transcritos de fusión PKAR. La transfección de micro ARN simulada o no relacionada no enriqueció la transcripción de PKAR.

Los datos muestran los picos elucianos de las subunidades ribosómicas 40 s y 60 s, el ribosoma a DS y las fracciones de polisomas que contienen el número indicado de ribosomas. Los ribosomas se asociaron con los transcritos aislados de la ICP que residen dentro de los glóbulos rojos. El análisis de sangre del norte demostró que los ribosomas y el polisoma estaban asociados con el 18 S y el 28 SRNA.

Junto con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la digestión de R nase H, los ensayos de protección de ribonucleasas y la transferencia del norte para validar adicionalmente la presencia de RM de microARN. Fusiones de NA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar microARN en eritrocitos y, posteriormente, capturar ARN pequeños con ARN total, incluidas las transcripciones quiméricas. También debería ser capaz de recuperar el polisoma para determinar la ocupación ribosómica y, por lo tanto, el potencial de traducción de estos transcritos de fusión.