Name: Hemodinámica Caracterización de roedores modelos de hipertensión arterial pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a caracterizar la hemodinámica del corazón derecho en modelos de roedores con hipertensión arterial pulmonar mediante ecocardiografía y cateterización. Esta técnica permite evaluar intervenciones genéticas y farmacológicas en fisiología cardiovascular.

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SR cuenta con el apoyo de NIH K08HL114643, Gilead Research Scholars en Hipertensión Arterial Pulmonar y un Premio Burroughs Wellcome Fund Career Award para Científicos Médicos.

Todos los procedimientos descritos siguen las pautas de cuidado de animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duke. 1. Antes de comenzar el procedimiento de Nota: Antes de cualquier procedimiento de animales, asegúrese de que se haya obtenido permiso institucional adecuado. Al igual que con todos los procedimientos, utilizar medicamentos para el dolor apropiada para asegurar que no hay sufrimiento animal. <ol><li> catéteres inmediatamente con solución salina estéril con heparina (100 U / ml) para asegurar la permeabilidad. Marque un punto de la punta del catéter equivalente a la longitud desde el corazón a la mitad del cuello (aproximadamente 4 cm para ratas y 2 cm para ratones). </li><li> Anestesiar el ratón o rata. La elección de anestésico incluyen isoflurano (3-4% de inducción, mantenimiento 1,5% mezclado con 100% de oxígeno), la ketamina / xilazina (80 a 120/10 mg / kg) y pentobarbital (40 a 80 mg / kg) 6. <ol><li> Por ejemplo, con ketamina: xilazina (80 a 120 mg / kg: 10 a 16 mg / kg IP para ratones y 80 a 100 mg / kg: 5 a 10 mg / kg IP para las ratas), una dosis única tiene una duración de 20 a 50 min de la anestesia. Para la ecocardiografía, anestesiar ratón o una rata con isoflurano (3-4% para la inducción y el 1,5% para el mantenimiento). Evaluar la profundidad anestésica pellizcando el roedor en el área quirúrgica para confirmar que los reflejos de retirada están ausentes. Utilice la pomada veterinaria en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Nota: Los diferentes agentes anestésicos se pueden utilizar para obtener resultados fiables con el uso adecuado y optimización (revisado en otro lugar 6). Nuestra preferencia por cateterismo es el uso de ketamina: xilazina. La sobredosis de ketamina / xilazina puede disminuir profundamente el ritmo cardíaco y la función cardiaca, por lo que es fundamental para mantener la temperatura adecuada y el control respiratorio. Para mantener el ritmo cardíaco (&gt; 400 / min) en ratones, que habitualmente realizamos vagotomía bilateral. La cantidad de ketamina / xilazina aquí se suelen durar 20-30 minutos, lo cual es suficiente para llevar a cabo ya sea abierto o cateterismo cardíaco a tórax cerrado seguido dela eutanasia de los animales. </li></ol></li><li> Preparar la rata / ratón para el procedimiento quirúrgico (Figura 1). <ol><li> Afeitar el piel del pecho (para permitir la ecocardiografía) y de la región quirúrgica, en la parte derecha del cuello. </li><li> Fregar las regiones quirúrgicas afeitados con un barrido circular desde el centro hacia el exterior usando betadine, seguido de la limpieza con un algodón empapado en alcohol al 70%. </li><li> Colocar el animal sobre una plataforma quirúrgica con una almohadilla de calentamiento por debajo. Establecer el nivel de calentamiento para mantener una temperatura corporal de 37 a 37,5 ° C. Monitorear la temperatura del cuerpo con una sonda rectal. La hipotermia puede resultar en significativos bradicardia e hipertermia, taquicardia significativa en los resultados. </li></ol></li></ol> 2. ecocardiografía Nota: Una descripción completa de la ecocardiografía de roedor se describe en otro lugar 7. Para el ratón, antes de la anestesia, las imágenes pueden ser obtenidos en el animal despierto, sobrio manualmente. Para la rata,anestesia previa a la ecocardiografía se prefiere que las ratas son demasiado grandes para ser sujetado de forma manual mientras se está despierto). <ol><li> Paraesternal eje largo (PLAX) Ver. <ol><li> Colocar el animal en posición supina en la plataforma o restringir de forma manual. </li><li> Seleccione el modo B para proyectar una imagen en vivo 2D. </li><li> Alinear el transductor de ultrasonido con una frecuencia de 40 MHz para ratón o 25 MHz para las ratas a la línea paraesternal izquierda, y luego gire el transductor hacia la izquierda 30 ° con el indicador de la sonda que apunta en la dirección caudal (cinco-once posición de línea) . Ángulo del transductor ligeramente (de balanceo a lo largo del eje corto del transductor en el mismo plano tomográfica) para obtener una vista completa cámara de LV en el centro de la pantalla. </li><li> Localizar y visualizar estas estructuras anatómicas (Figura 2A): el lumen del ventrículo izquierdo (VI); tabique interventricular (SIV); el lumen del ventrículo derecho (VD); aorta ascendente (AO); y la aurícula izquierda (AI). </li> &lt;li&gt; Cambiar al modo M, una vez que estas estructuras anteriores se visualiza claramente. Coloque la línea del indicador a través de la parte más ancha del lumen del VI utilizando AO como punto de referencia y también hacer que la mentira profundidad de foco en el centro de la cámara LV (Figura 2B). Hacer mediciones similares de la RV cambiando la angulación del transductor y la obtención de mediciones de modo M. </li><li> Usar el almacén de cine para crear un bucle de vídeo para grabar los datos de la medición fuera de línea (dimensión de la cámara LV, FS y el espesor de la pared del VI). </li><li> Obtener un trazado doppler del flujo de salida aórtico en modo Doppler PW colocando el cursor PW en la aorta y la grabación (Figura 2C). </li></ol></li><li> Paraesternal eje corto Ver (PSAX) a nivel de la aorta. <ol><li> Cambiar al modo B. </li><li> Rotar el transductor 90 ° en sentido horario desde el eje longitudinal paraesternal obtener el eje corto paraesternal (Figura 3). Mover y el ángulo del transductor hacia el cráneo de Identificaciónentify la vista en sección transversal de la válvula aórtica. </li><li> Identificar el tracto de salida del ventrículo derecho (TSVD) como una estructura en forma de media luna, localizado en la parte superior derecha de la aorta, continuó con valvas de la válvula pulmonar y la arteria pulmonar. </li><li> Mantenerse estable en la misma posición manualmente. Cambiar al modo Doppler PW. Nota: Una plataforma de la estación para la celebración de los roedores y la sonda se puede utilizar para minimizar el movimiento y la variación en la posición del transductor. </li><li> Coloque el proximal volumen de la muestra al nivel de la válvula pulmonar en el centro de la vía de salida del ventrículo derecho y, a continuación colocar el cursor en paralelo a la dirección del flujo sanguíneo a través del vaso (Figura 3B). Nota: Es importante ajustar el ángulo de muestreo a la dirección de flujo de sangre o utilizar el software de ultrasonido para corregir un cambio en el ángulo. Sin corrección, el ángulo máximo en el recipiente es de 30 °, que corresponde a ~ 15% subestimación de la velocidad. </li><li> adjUST la escala (la velocidad del flujo sanguíneo) según sea necesario para obtener una &quot;buena&quot; sobre Doppler, que tiene bordes blancos y un hueco en su interior que indica el flujo sanguíneo laminar oscuro (Figura 3C). Grabar el trazado Doppler. Nota: Un &quot;malo&quot; sobre Doppler no se acomoda suficientes bordes blancos y un hueco oscuro. </li><li> Si el cateterismo no se lleva a cabo en este momento, permitir que el roedor se recupere si se utiliza anestesia. No deje desatendido el roedor hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal y no devolverlo a la compañía de otros animales hasta que esté totalmente recuperado. Si se realiza un cateterismo, proceda a la Sección 3. </li></ol></li></ol> 3. Haga Cateterismo Cardíaco <ol><li> enfoque cerrado de tórax para la medición de la presión del VD <ol><li> Preparar: <ol><li> Conectar el transductor de presión al canal de entrada 1. En el software, configurar el canal 1 para la presión y channEL 2 de la frecuencia cardíaca. </li><li> Para convertir unidades en mmHg, registrar la traza de línea de base, realizar una calibración de la presión de forma manual utilizando un medidor de presión (si se utiliza un transductor de presión arterial y el tubo de PE). A continuación, realizar la conversión de unidades bajo el canal 1. </li><li> Para establecer la frecuencia cardíaca, apague la entrada del canal 2. Seleccionar las mediciones cíclicas bajo el canal 2 y seleccione el canal 1 para la fuente y dosis para la medición. </li></ol></li><li> Coloque el ratón / rata debajo de un microscopio de disección con el foco en profundidad y un aumento de 5x. </li><li> Incisión en la piel de la mandíbula con el esternón (Figura 1). Colocar un par de retractores a cada lado de la incisión para exponer completamente la zona cervical. </li><li> Sin rodeos diseccionar para separar las glándulas salivales para exponer la vena yugular externa derecha con unas pinzas de punta fina romos (Figura 4A, B). </li><li> Con cuidado, aislar la vena yugular externa derecha desde el tejido conectivo circundante. </li> &lt;li&gt; Coloque dos piezas de sutura de seda (4-0; 6-0 para las ratas para ratones) por debajo de la vena yugular externa derecha, ligar la vena distal (lo más cercano a la mandíbula de lo posible), y luego atar un nudo flojo proximal ( Figura 4C). </li><li> Utilice tijeras iris para hacer una pequeña (corte) proximal &quot;nick&quot; al nudo atado distal. </li><li> Mantener el catéter con una pinza e inserta el catéter en el corte de la vena, y luego apretar el nudo proximal. Nota: Utilizamos generalmente polietileno (PE) -10 tubo (~ 2 tamaño Fr) para ratones y PE-50 (~ 3 Fr tamaño) para las ratas, que está conectado al transductor de presión regular a través de una aguja de 31 G o 21 G y calibrado. Marque el catéter con un marcador en una longitud que corresponde aproximadamente a la colocación de la punta en el ventrículo derecho. Como alternativa a un tubo de PE, un catéter micromanómetro se puede utilizar. Tirando suavemente el nudo distal puede ayudar a introducir el catéter. </li><li> Empuje suavemente el catéter en el corazón y el monitor de la derechala profundidad de avance de acuerdo a la marca. Supervisar el trazado de la presión en el software para verificar la ubicación del catéter e identificar la presión del VD (Figura 5). </li><li> Mantener el catéter inmóvil y recoger los datos durante 2 min (grabación al lado del botón de inicio de datos de palanca). </li><li> Proceder a la recogida de muestras (Sección 4). </li></ol></li><li> Enfoque a tórax abierto para el Análisis del bucle PV RV. Nota: análisis de bucle PV del ventrículo derecho no se puede realizar con un enfoque de tórax cerrado debido a la rigidez de la conductancia catéter, que no pasa de la SVC a la RA. Comercialmente catéteres conductancia disponibles están diseñados para el análisis de bucle PV LV. <ol><li> En el software establece el canal 1 de la conductancia; Canal 2 de la presión; y Canal 3 de la frecuencia cardíaca. </li><li> Intubate las ratas con un tubo de 16 G de teflón y conectar el tubo a un ventilador mecánico. Calcular y ajustar los parámetros de ventilación para los ratones o ratas utilizando el seguimientofórmulas ing 6: volumen corriente (V t, ml) = 6,2 x 1,01 M (masa = M animales, en kg); la frecuencia respiratoria (RR, min -1) = 53,5 x H -0.26 (Figura 6A). </li><li> Spread 70% de alcohol en la piel de reducir la propagación de la piel en el campo quirúrgico. </li><li> Hacer una incisión debajo de la apófisis xifoides y bilateralmente diseccionar la piel con unas tijeras hacia el flanco. </li><li> Corte a través de la pared abdominal y abrir la cavidad abdominal mediante disección bilateral a lo largo del diafragma. </li><li> Abrir el diafragma para exponer la punta del corazón y bilateralmente cortar la caja torácica (Figura 6A). Evitar la evaporación y el secado del tejido por pulverización salina en las cavidades torácica y peritoneal con una jeringa. Nota: Utilizamos generalmente una tijera de disección para abrir la cavidad torácica y abdominal jaula. El sangrado es por lo general no es significativo, pero si hay sangrado, electrocauterio se puede utilizar. </li><li> º cuidadosamente aisladoe vena cava inferior (IVC) del tejido conectivo circundante. </li><li> Coloque un pedazo de sutura de seda (4-0 para las ratas; 6-0 para los ratones) alrededor de la vena cava inferior, y luego atar un nudo flojo (o enhebrar la sutura a través de un tubo de teflón 16 G) (Figura 6B). </li><li> Perforar la pared libre del VD apical con un calibre de 27-30 aguja paralela a la pared libre del VD y retire la aguja. Tenga cuidado de no empujar la aguja en más de 4 mm. Nota: Como alternativa, un pequeño trozo de tubo de PE-60 se puede utilizar para guiar la punción del catéter de conductancia en el vértice RV. </li><li> Inserte la punta del catéter de conductancia a través de la herida de arma blanca en la pared libre del VD apical hasta que todos los electrodos están en el interior del ventrículo (Figura 6C). </li><li> Supervisar el circuito de volumen de presión en el software y luego ajustar la posición del catéter para obtener bucles en forma consistente que no demuestran variación respiratoria significativa (Figura 7B, C). </li><li> Grabarla línea de base PV bucles (grabación al lado del botón de inicio de datos de palanca) durante al menos 10 segundos para obtener un número de bucles PV. </li><li> Tirar de la sutura colocada alrededor de la vena cava inferior para alterar las precargas y registrar los bucles PV. Analizar los datos fuera de línea y obtener diferentes parámetros de la función sistólica del VD (Figura 7D). Este análisis se ha descrito previamente 8. Nota: IVC alternativamente puede ser ocluida por fórceps. Supervisar el trazado de la presión de RV para confirmar la reducción de la precarga. </li><li> Realizar salinos y cubetas calibraciones como se ha descrito anteriormente para permitir una conversión de unidades de conductancia de 6 unidades de volumen. </li><li> Después de grabar los datos, tire suavemente el catéter y coloque la punta del catéter inmediatamente en un baño de agua con solución salina. Al terminar, limpiar el catéter según las instrucciones del fabricante. </li></ol></li></ol> 4. Recolección de muestras de corazón y pulmón Nota: Como los procedimientos aquí unare descrito como terminal, el animal debe ser sacrificado después de que cualquiera cerrado o tórax abierto cateterismo cardíaco derecho. <ol><li> La eutanasia a los ratones mediante la apertura del tórax (toracotomía bilateral) si se utilizó un enfoque de tórax cerrado, exanguination, o apagando el ventilador después de una sobredosis de anestesia. Nota: No se recomienda la dislocación cervical. </li><li> Para realizar la perfusión de inflación del pulmón, conecte el tubo de inflación en un ringstand para que infle el pulmón con una presión de 20 cm H 2 O (pero no abra la válvula para inflar aún los pulmones). </li><li> Sin rodeos diseccionar la tráquea de los alrededores de los músculos y el tejido conectivo. </li><li> Coloque un pedazo de sutura de seda (4-0 para las ratas, los ratones 6-0) alrededor de la tráquea, y luego atar un nudo flojo. </li><li> estirar suavemente la traquea presionando la cabeza y hacer un corte (70% de la circunferencia) cerca de la mandíbula. </li><li> Mantenga el estiramiento suave e insertar la cánula traqueal (20 g para los ratones o ratas de 16 G).Asegurar la cánula mediante la sutura. Conectar la cánula en el tubo de inflación y atar la sutura alrededor de la cánula para evitar el reflujo de fijadores. </li><li> Enjuagar los pulmones con PBS utilizando una jeringa de 10 ml de apuñalar a la pared libre del VD e inyectar hacia la arteria pulmonar. Nick la aurícula izquierda una vez que los pulmones empiezan a palidecer. </li><li> Se recoge el corazón por el corte en la raíz de la aorta. </li><li> Sujetar el lóbulo inferior del pulmón derecho de uso de una pinza hemostática mosquito y cortar el lóbulo inferior derecho. Colocar las piezas en tubos de microcentrífuga y congelamiento rápido en nitrógeno líquido. </li><li> Inflar el pulmón con 10% tamponada neutra de formalina durante 5 min y retirar la cánula de la tráquea seguida por ligación de la tráquea. </li><li> Diseccionar el pulmón fuera del tórax y fijar con un 10% de formalina tamponada neutra. Nota: Como alternativa, inflar el pulmón con los medios de corte óptimo (OCT, se diluyó 1: 1 con PBS) y congelar sin diluir en PTU para su posterior preparación de secciones congeladas. </li><li> Cuidadosamenteseparar las aurículas de los ventrículos y aislar la pared libre del ventrículo derecho mediante la disección junto con el tabique interventricular. </li><li> Pesar el RV y LV + tabique (LV + S) para calcular un índice de Fulton (RV / LV + S) 9, que cuantifica el grado de hipertrofia del VD. Nota: Índice TheFulton varía en diferentes modelos de PH. Rat 10: control, 0,28 ± 0,01; inducida por hipoxia, 0,57 ± 0,02; MCT-tratada, 0,51 ± 0,03. C57BL6 / J del ratón 11: control, 0.26 ± 0.01; SuHx (14 días), 0,40 ± 0,02; SuHx (21 días), 0,43 ± 0,01; SuHx (28 días), 0,44 ± 0,03. </li><li> Snap congelar la RV y LV + S en nitrógeno líquido o fijar en el 10% de formalina tamponada neutra. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos descritos aquí describen una caracterización integral de la hemodinámica y la función ventricular derecha en modelos de hipertensión pulmonar en roedores. Si bien el cateterismo cardíaco derecho, como se describe aquí, es un procedimiento terminal, la mortalidad asociada con la ecocardiografía es mínima, lo que permite la detección y el seguimiento de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, al igual que los pacientes con HP que han aumentado notablemente la mortalidad con anestesia17, en nu...

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad de la vasculatura pulmonar asociada a la infiltración de células inflamatorias, proliferación de músculo liso y la apoptosis de las células endoteliales. Estos cambios dan lugar a la obliteración de las arteriolas pulmonares, que posteriormente conducen a la disfunción ventricular derecha (RV) y la insuficiencia cardíaca. Con el fin de comprender la fisiopatología de la HAP y la insuficiencia del VD en la HAP, se han desarrollado una serie de diferentes modelos, incluyendo modelos genéticos y farmacológicos, para el estudio de esta enfermedad (revisado en otro 1,2). De estos modelos, los más populares son la hipoxia inducida (Hx) HAP en el ratón y el monocrotaline (MCT) y modelos SU5416-hipoxia (SuHx) en la rata. En el modelo de Hx ratón, los ratones son expuestos a 4 semanas de la hipoxia (ya sea normobáricas o hipobárica, que corresponde a una altitud de 18.000 pies con una FiO2 de 0,10), con el desarrollo resultante de la proliferación medial, el aumento de Syst RVpresiones Olic y el desarrollo de la hipertrofia RV 3. MCT en una dosis única de 60 mg / kg en los resultados de daño a las células endoteliales pulmonares a través de un mecanismo claro que luego se traduce en el desarrollo de PAH 4. SU5416 es un inhibidor de los receptores endoteliales vasculares del factor de crecimiento (VEGFR) 1 y 2 bloqueador, y el tratamiento con una única inyección subcutánea de 60 mg / kg seguido de exposición a la hipoxia crónica durante 3 semanas resultados en la hipertensión pulmonar permanente con cambios patológicos similares a la observada en la enfermedad humana, con la formación de lesiones vasculares obliterantes 5. En los últimos años, varios modelos de ratones transgénicos para la hipertensión pulmonar se han desarrollado. Estos incluyen knockout y las mutaciones de la proteína morfogenética ósea del receptor 2 (BMPR2), como las mutaciones del gen BMPR2 se encuentran tanto en las formas familiares y idiopáticas de PAH, hemo oxigenasa-1 knockout y IL-6 sobreexpresión (revisado en otra parte 1,2). Estos diferentes modelos de roedores de PH tienen diferentes niveles de hipertensión pulmonar, hipertrofia del VD y la insuficiencia del VD. Mientras que los diversos modelos de ratones transgénicos hipoxia y el resultado en la HAP mucho más suave que el modelo de rata o bien 1, no se permite la comprobación de diferentes mutaciones genéticas y sus vías de señalización moleculares asociados. El modelo MCT resulta en PAH grave, aunque MCT parece ser tóxico para las células endoteliales en múltiples tejidos 4. El modelo se caracteriza por SuHx vascular cambia más similar a la observada en la HAP idiopática en humanos, aunque requiere tanto la manipulación y la hipoxia farmacológico exposición. Además, en todos estos modelos, puede haber una desconexión entre los cambios histopatológicos, presiones pulmonares y la función del VD asociados con el desarrollo de la HAP. Esto está en contraste con la enfermedad humana, donde por lo general hay una relación proporcional entre los cambios histopatológicos, la gravedad de pulmonary la hipertensión y el grado de insuficiencia del VD. Por lo tanto, se requiere una caracterización completa de estos modelos de roedores de PH, y consiste en la evaluación de la función ventricular derecha (normalmente mediante ecocardiografía), la hemodinámica (por cateterismo cardíaco) y la histopatología del corazón y los pulmones (a partir de la cosecha de tejidos). En este protocolo, se describen las técnicas básicas utilizadas para la caracterización hemodinámica de los modelos de PAH en la rata y el ratón. Estas técnicas generales se pueden aplicar a cualquier estudio del ventrículo derecho y la vasculatura pulmonar y no se limita a los modelos de PAH. Visualizando el RV por ecocardiografía es relativamente sencillo en ratas, pero es más difícil en los ratones debido a su tamaño y la geometría compleja de la RV. Por otra parte, algunos sustitutos utilizados para la cuantificación de la función del VD, como TAPSE, la arteria pulmonar (AP) tiempo de aceleración y PA Doppler muescas en forma de onda, no están bien validados en los seres humanos y se correlacionan débilmente con la evaluación de la PUhipertensión lmonary y la función del VD por la hemodinámica invasiva. Determinación de la hemodinámica RV se realiza mejor con un cerrado-pecho, para mantener los efectos de una presión intratorácica negativa con la inspiración, aunque cateterismo pecho abierto con un catéter de impedancia permite la determinación de la presión-volumen (PV) bucles y una caracterización hemodinámica más detallada . Al igual que con cualquier procedimiento, el desarrollo de la experiencia con los procedimientos es fundamental para el éxito experimental.

<table><tbody><tr><td>Sistema de imágenes Vevo 2100 (120V)&nbsp;</td><td>VisualSonics, inc.&nbsp;</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Estación de imágenes Vevo 2100&nbsp;</td><td>VisualSonics, inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transductores mecánicos de alta frecuencia</td><td>VisualSonics, inc.&nbsp;</td><td>MS250, MS550D, MS400</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido Parker &nbsp;</td><td>Laboratorios Inc.&nbsp;</td><td>01-08</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/35</td><td>ADInstrumentos</td><td>ML765</td><td></td></tr><tr><td>Labchart 8</td><td>ADInstrumentos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transductor BP con llave de paso y cable</td><td>ADInstrumentos</td><td>MLT1199</td><td></td></tr><tr><td>Kit de calibración del transductor BP</td><td>ADInstrumentos MLA1052</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Tip Catéter de presión para ratón</td><td>Millar</td><td>SPR-1000</td><td>Catéter alternativo disponible en Scisense FT111B (ratón) y FT211B (rata)</td></tr><tr><td>Catéter de presión Mikro-Tip para rata</td><td>Millar</td><td>SPR-513</td><td>Catéter alternativo disponible en Scisense FT111B (ratón) y FT211B (rata)</td></tr><tr><td>Millar Mikro-Tip&nbsp; catéter de asa PV ultraminiatura para ratones</td><td>Millar</td><td>PVR-1035</td><td>Catéter alternativo disponible en Scisense FT112 (ratón)</td></tr><tr><td>Millar Mikro-Tip catéter de asa PV ultra miniatura para ratas</td><td>Millar</td><td>SPR-869</td><td>Catéter alternativo disponible en Scisense FT112 (ratón)</td></tr><tr><td>Sistema PV Millar MPVS-300&nbsp;</td><td>Millar</td><td>MPVS-300</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Trenza de seda negra Carrete de 100 yardas</td><td>Roboz quirúrgico</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Trenza de seda negra Carrete de 100 yardas</td><td>Roboz quirúrgico</td><td>SUT-14-1</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris, delicadas, Integra Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-248</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección VWR, punta afilada/roma</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras delicadas VWR, 4 1/2"</td> <td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Hemostáticos de dos estrellas, Excelta</td><td>VWR</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Formalina con tamponamiento neutro</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Crotaline</td><td>Sigma</td><td>C2401</td><td></td></tr><tr><td>SU5416</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3037</td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Boom Stand Microscopio estereoscópico con zoom trinocular&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>SM-3BX</td><td></td></tr><tr><td>PE (Tubo de polietileno)-10</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>PE10 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>PE (Tubo de polietileno)-50</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>PE50 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>PE (Tubo de polietileno)-60</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>PE60 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de anestesia de isoflurano de mesa</td><td>Kent Scientific</td><td>ACV-1205S</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma quirúrgica multifuncional Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td> Juego de retractores <td>Surgisuite</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5002</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de inducción de anestesia</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia Bote de filtro de gas</td><td>Kent Scientific</td><td>ACV-2001</td><td></td></tr><tr><td>Cono de nariz para roedores</td><td>VetEquip</td><td>921431</td><td></td></tr></tbody></table>

hemodinámica caracterización de roedores modelos de hipertensión arterial pulmonar

Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad rara de la vasculatura pulmonar caracterizada por apoptosis de células endoteliales, proliferación de músculo liso y obliteración de las arteriolas pulmonares. Esto, a su vez, resulta en insuficiencia del ventrículo derecho (VD), con una morbilidad y mortalidad significativas. Los modelos de HAP en roedores, en ratón y rata, son importantes para comprender la fisiopatología subyacente a esta enfermedad rara. En particular, los diferentes modelos de HAP pueden estar asociados con diferentes grados de hipertensión pulmonar, hipertrofia del VD e insuficiencia del VD. Por lo tanto, una caracterización hemodinámica completa de ratones y ratas con HAP es fundamental para determinar los efectos de los fármacos o las modificaciones genéticas sobre la enfermedad. 
Aquí demostramos procedimientos estándar para la evaluación de la función ventricular derecha y la hemodinámica en modelos de HAP tanto en ratas como en ratones. La ecocardiografía es útil para determinar la función del VD en ratas, aunque la obtención de vistas estándar del ventrículo derecho es un desafío en el ratón despierto. El acceso para el cateterismo cardíaco derecho se obtiene por la vena yugular interna en ratones y ratas de tórax cerrado. Las presiones se pueden medir utilizando tubos de polietileno con un transductor de presión de fluido o un catéter de presión de micrómetro en miniatura. El análisis del bucle de presión-volumen se puede realizar en el tórax abierto. Después de obtener la hemodinamia, el roedor es sacrificado. El corazón se puede diseccionar para separar la pared libre del ventrículo izquierdo (VI) y el tabique, lo que permite evaluar la hipertrofia del VD mediante el índice de Fulton (RV/(LV+S)). Luego, se pueden recolectar muestras del corazón, los pulmones y otros tejidos, según sea necesario.

Como el cateterismo derecho en roedores es típicamente un procedimiento terminal que no es aplicable al seguimiento longitudinal, la ecocardiografía es una excelente alternativa no invasiva para la detección y el seguimiento 12. Mientras que la presión sistólica de la arteria pulmonar en la HAP humana en la ecocardiografía se deriva generalmente de regurgitación tricúspide que suele ser sencillo a obtener en el plano apical, ese punto de vista no se obtiene de forma fiable en roedores, la prevención de la est...

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad de las arteriolas pulmonares que conduce a su obliteración y al desarrollo de insuficiencia ventricular derecha. Los modelos de HAP en roedores son fundamentales para comprender la fisiopatología de la HAP. Aquí demostramos la caracterización hemodinámica, con cateterismo cardíaco derecho y ecocardiografía, en ratón y rata.

Hemodinámica Caracterización de roedores modelos de hipertensión arterial pulmonar

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle ...

El objetivo general de la ecocardiografía y la cateterización del corazón derecho en roedores es determinar la función del corazón derecho en diversos modelos de enfermedades cardíacas y pulmonares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de fisiología cardiovascular, como, ¿cuáles son los efectos de manipulaciones genéticas o de fármacos sobre el desarrollo de hipertensión pulmonar? La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un análisis integral de la función del corazón derecho en estos modelos de enfermedades cardíacas y pulmonares.Para visualizar el eje largo paraesternal del corazón de un roedor, comience colocando un roedor anestesiado en posición supina. Confirme el nivel adecuado de sedación mediante la compresión del dedo del pie y aplique una pomada veterinaria en los ojos del animal. A continuación, afeite el pecho y aplique gel ultrasónico.Seleccione el modo B para proyectar una imagen bidimensional en tiempo real. Luego, alinee un transductor de ultrasonido con la frecuencia adecuada a la línea paraesternal izquierda. Gire el transductor en sentido antihorario 30 grados, con el indicador de la sonda apuntando en dirección caudal.A continuación, incline ligeramente el transductor, moviendo el instrumento suavemente a lo largo del eje corto del transductor en el mismo plano tomográfico para obtener una vista completa de la cavidad del ventrículo izquierdo en el centro de la pantalla. Localice y observe la luz del ventrículo izquierdo, el tabique interventricular, la luz del ventrículo derecho, la aorta ascendente y la aurícula izquierda. Para visualizar el eje corto paraesternal a nivel aórtico, en modo B, gire el transductor 90 grados e incline el transductor hacia la región craneal para identificar la vista en sección transversal de la válvula aórtica.A continuación, manteniendo el transductor fijo en la misma posición, cambie al modo de Doppler de onda de pulso. Luego, coloque el volumen de muestra proximal al nivel de la válvula pulmonar, en el centro del tracto de salida del ventrículo derecho, y posicione el cursor paralelo a la dirección del flujo sanguíneo a través del vaso. Ajuste la escala según sea necesario a lo largo de la dirección del flujo sanguíneo para obtener un buen envolvente de Doppler, es decir, una imagen con bordes blancos y un interior oscuro, indicativo de un flujo sanguíneo laminar, y registre el trazado de Doppler.Para realizar una cateterización cardíaca derecha por vía torácica cerrada, coloque el roedor anestesiado bajo un microscopio de disección e incise la piel desde la mandíbula hasta el esternón. Coloque un par de retractores a cada lado de la incisión para exponer completamente la zona cervical. A continuación, separe las glándulas salivales mediante disección roma, seguido del uso de pinzas finas de punta roma para exponer la vena yugular externa derecha.Aislar cuidadosamente la vena yugular externa derecha del tejido conectivo circundante y colocar dos trozos de sutura de seda debajo de la vena yugular externa derecha. Ligar distalmente la vena lo más cerca posible de la mandíbula y hacer un nudo suelto proximalmente. Con tijeras de iris, realizar una pequeña incisión en la vena yugular externa proximal al nudo atado distalmente.A continuación, marque el catéter a una longitud aproximadamente equivalente a la distancia desde la vena yugular externa hasta el corazón. Luego, utilizando fórceps, inserte el catéter en la incisión y apriete el nudo proximal. Introduzca suavemente el catéter hacia el corazón derecho, controlando la profundidad de avance según la marca en el catéter y verificando la ubicación del catéter in situ mediante el registro de presión en la pantalla del ordenador.Una vez que se haya identificado un registro de la presión del ventrículo derecho, estabilice el catéter para la recopilación de datos. Para obtener bucles de presión-volumen del ventrículo derecho, intube a continuación al roedor. A continuación, realice una incisión por debajo del proceso xifoides y diseccione bilateralmente la piel con tijeras hacia la zona lateral.Para abrir la cavidad abdominal a través de la pared abdominal, realice una disección bilateral a través de la pared abdominal por debajo del diafragma. Luego, abra el diafragma para exponer el ápice del corazón y corte bilateralmente la caja torácica. Aísle cuidadosamente la vena cava inferior del tejido conjuntivo circundante y coloque gasa estéril empapada en solución salina normal sobre la cavidad abdominal y los sitios de intubación.A continuación, utilizando un pequeño trozo de tubo PE 60, guíe la punción del catéter de conductancia hacia el ápice del ventrículo derecho e introduzca la punta del catéter a través de la herida punzante hasta que todos los electrodos estén dentro del ventrículo. Ahora supervise el bucle de presión-volumen en el software, ajustando la posición del catéter según sea necesario para obtener bucles con forma consistente que no muestren variaciones respiratorias significativas. Para obtener una familia de bucles de presión-volumen, aplique suavemente presión sobre la vena cava inferior para disminuir el llenado del ventrículo derecho.A continuación, se pueden calcular varios parámetros hemodinámicos a partir de estos datos. Para realizar la perfusión por inflado del pulmón, primero conecte el tubo de inflado a un soporte con anillo. A continuación, disecque romo la tráquea del músculo circundante y del tejido conectivo, y coloque un trozo de sutura de seda alrededor de la tráquea.A continuación, haga un nudo suelto en la sutura, presione la cabeza para estirar suavemente la tráquea y corte el 70 % de la circunferencia de la tráquea cerca de la mandíbula. Manteniendo la tráquea estirada, inserte una cánula traqueal y asegure la cánula con una sutura. Conecte la cánula al tubo de insuflación, luego punce la pared libre del ventrículo derecho con una jeringa de 10 mililitros llena con PBS y lave los pulmones, inyectando hacia la arteria pulmonar.Cuando los pulmones comiencen a aclararse, haga una incisión en la aurícula izquierda una vez. Luego, corte la raíz de la aorta para extraer el corazón. Finalmente, infle el pulmón con formalina neutra tamponada al 10 % durante cinco minutos y retire la cánula traqueal.A continuación, ligue la tráquea, extirpe el pulmón de la cavidad torácica y fije el tejido pulmonar con formalina neutra tamponada al 10% fresca. Una vista parasternal en eje corto a nivel aórtico puede visualizarse fácilmente en roedores, lo que permite registrar y medir trazados Doppler de la arteria pulmonar, cuyas formas se han asociado con el grado de hipertensión pulmonar. En una cateterización cardíaca derecha con el tórax cerrado en un ratón expuesto a hipoxia crónica, la presión sistólica del ventrículo derecho se eleva hasta 45 milímetros de mercurio, hallazgo consistente con una hipertensión pulmonar significativa.En una cateterización de la cavidad derecha del corazón con tórax abierto en una rata normal, la presión sistólica del ventrículo derecho se observa a un nivel significativamente más bajo de 27 milímetros de mercurio. El procedimiento puede completarse completamente en pocos minutos si la técnica se domina y se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que el roedor esté adecuadamente anestesiado y de que no existan fuentes significativas de sangrado ni de desecación del tejido que podrían provocar hipervolemia.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una caracterización hemodinámica completa del corazón derecho. La práctica es fundamental para dominar estas técnicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Hemodinámica Caracterización de roedores modelos de hipertensión arterial pulmonar

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