El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas

El objetivo general de este procedimiento es separar las endosporas bacterianas de las muestras complejas de la comunidad microbiana, como los sedimentos. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la microbiología sobre la presencia y abundancia de endosporas en muestras naturales. Se basa en una diferencia de resistencia entre las endosporas y las células vegetativas hacia los productos químicos y el calor. La principal ventaja de esta técnica es que el método no es destructivo para las endosporas, por lo que se pueden utilizar para experimentos posteriores como el cultivo, la cuantificación y las pruebas metabólicas.

Aunque hemos diseñado este método para trabajar con la ecología de las bacterias formadoras de endosporas, también se puede utilizar en campos como la exobiología o la industria alimentaria, en los que las esporas pueden ser beneficiosas o perjudiciales. Después de preparar las soluciones y el equipo de acuerdo con el protocolo de texto, bajo una cabina de bioseguridad esterilizada con UV, use cucharas de metal flameado con etanol para agregar tres gramos de muestra de sedimento a tubos estériles de 50 mililitros previamente pesados. Usando una bureta estéril graduada, agregue 15 mililitros de una solución estéril de hexametafosfato de sodio filtrada al 1% o SHMP a la muestra.

Con un dispersor u homogeneizador de líquidos y un rotor de dispersión estéril, homogeneice la muestra a 17.500 RPM durante un minuto. Deje reposar la muestra durante dos minutos y repita la homogeneización. Deje reposar la muestra durante 10 minutos para que se asienten las partículas más pesadas.

Transfiera el sobrenadante que contiene la biomasa celular a un tubo limpio de 50 mililitros, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Añadir otros 15 mililitros de alícuota de SHMP al pellet sedimentado y repetir la homogeneización antes de recoger el sobrenadante y combinarlo con la primera alícuota. Centrifugar la muestra a 20 veces G durante un minuto y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 50 mililitros antes de desechar el pellet.

Una vez que la unidad de filtración y la bomba de vacío se hayan preparado de acuerdo con el protocolo de texto, use llama de etanol para esterilizar las pinzas y agregar una membrana de nitrocelulosa estéril a la unidad de filtración. Añada la mitad de la muestra de sobrenadante que se acaba de preparar en la unidad de filtración por membrana y utilice la bomba de vacío para recoger las células de la membrana. Cuando el líquido haya pasado completamente a través del filtro, detenga la bomba de vacío.

Use pinzas esterilizadas para quitar cuidadosamente la membrana y colóquela en una placa de Petri estéril. Con un trozo nuevo de membrana estéril, repita la filtración con la mitad restante de la solución. Para separar las endosporas de las células vegetativas en la biomasa recién recolectada, descongele la membrana si estaba congelada y use tijeras esterilizadas flameadas con etanol para cortarla en pedazos más pequeños.

Transfiera las piezas de membrana a un tubo estéril de dos mililitros y agregue 900 microlitros de tampón 1X TE. Mezclar bien por vórtice para liberar la biomasa de la membrana. Incubar el tubo a 65 grados centígrados y 80 RPM durante 10 minutos.

Luego, retire el tubo de la incubadora y deje que se enfríe durante 15 minutos. Añadir 100 microlitros de lisozima recién preparada hasta una concentración final de dos miligramos por mililitro e incubar la muestra a 37 grados centígrados y 80 RPM durante 60 minutos para lisar las células vegetativas. Una vez completada la lisis, agregue 250 microlitros de 3 hidróxido de sodio normal y 250 microlitros de solución de SDS al 6% a la muestra.

Incubar a temperatura ambiente y 80 RPM durante 60 minutos. A continuación, prepare una unidad de filtración estéril que contenga membranas de 25 milímetros de diámetro mediante autoclave. Después de que la unidad de filtración se enfríe, coloque una membrana de nitrocelulosa de 25 milímetros de diámetro y 0,2 micrómetros sobre ella.

Agregue la muestra a la membrana y use la bomba de vacío para filtrar el líquido, capturando las endosporas en la membrana, mientras pasa el material de la célula vegetativa. Para lavar los detergentes residuales, agregue dos mililitros de solución fisiológica estéril a la membrana y aplique la bomba de vacío. Cuando el líquido esté completamente filtrado, apague la bomba y deje la membrana en la unidad de filtración.

Para llevar a cabo el tratamiento con DNasa directamente sobre la membrana, agregue 450 microlitros de agua estéril, 50 microlitros de tampón de reacción de DNasa 1X y 0,5 microlitros de enzima DNasa en la membrana y déjela reposar a aproximadamente 25 grados centígrados durante 15 minutos. El ADN extracelular previamente liberado de las células lisadas se digiere enzimáticamente y luego se lava. Esto garantiza que la preparación final de las endosporas esté libre de ADN externo, lo que es clave para el análisis posterior, como el análisis molecular.

Es importante recordar que no debe haber fugas en el aparato de filtro y que la muestra no se seca. Después de la incubación, agregue un mililitro de solución fisiológica y encienda la bomba para lavar la enzima residual de la muestra. Use pinzas estériles para transferir la membrana que contiene endosporas a una placa de Petri estéril.

Analice la muestra de acuerdo con el protocolo de texto. El protocolo demostrado en este vídeo de lisis dirigida de células vegetativas da como resultado una muestra de endospora purificada y un aumento significativo en la fracción de firmicutes formadoras de endosporas. En la secuenciación de amplicones del gen de ARN ribosómico 16S, las firmicutas en muestras no tratadas corresponden solo del 8% al 19% de las secuencias.

Por el contrario, las firmicutas postratamiento representaron el 90,6% y el 83,9% de la muestra rica en endosporinas. Los dos órdenes principales de firmicutes formadores de endosporas, bacillales y clostridiales, estaban enriquecidos, mientras que los firmicutes no formadores de endosporas como los lactobacillales estaban ausentes. También se demostró la eficacia del tratamiento utilizando cultivos puros.

Se trató una preparación de endosporas y un cultivo de células vegetativas, se incubaron todas las células y se midió el crecimiento con una densidad óptica de 600 nanómetros. Como se muestra aquí, se observó crecimiento en los cultivos de endosporas, mientras que no se observó crecimiento en el cultivo de E. coli tratado, lo que indica que las células vegetativas están dañadas irreversiblemente. Una vez dominado, y si las soluciones y el equipo se han preparado previamente, esta técnica debe realizarse en unas cinco horas.

Es importante recordar que hay que evitar toda contaminación trabajando en condiciones estériles y asegurando la esterilidad de las soluciones y de todos los equipos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el cultivo, el aislamiento y las pruebas metabólicas para responder preguntas adicionales sobre la identificación de cepas y el potencial metabólico de las endosporas. Además, la extracción posterior de ADN y la secuenciación metagenómica se pueden realizar para analizar la diversidad de especies y la presencia de genes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo separar las endosporas de las muestras ambientales. No olvide que trabajar con detergentes como el SDS puede ser extremadamente peligroso. No olvide usar equipo de protección personal.