Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano

El objetivo general de este experimento es crear un modelo organotípico que imite el microambiente peritoneal para mejorar nuestra comprensión de la biología del cáncer de ovario. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de ovario, como cómo las interacciones entre las células cancerosas y el microambiente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad, y cómo se pueden probar los posibles inhibidores de estas interacciones. La principal ventaja de esta técnica es que las células humanas primarias reales que forman las superficies de la línea de mesotelio de la cavidad peral se utilizan en el cocultivo de células de cáncer de ovario.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer de ovario, también se puede aplicar al estudio de otros cánceres que se diseminan por toda la cavidad peritoneal, como los cánceres gástrico, de páncreas y de colon. Al adquirir una muestra quirúrgica de epiplón humano, sumerja inmediatamente la muestra en PBS a temperatura ambiente. Dentro de las dos horas posteriores a la inmersión, transfiera el epiplón a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de PBS fresco, transfiera el lavado de PBS restante que contenga las células mesoteliales humanas primarias o HPMC y los glóbulos rojos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y centrifuga las células.

A continuación, vierta el contenido del tubo en una placa de cultivo estéril de 10 centímetros y utilice dos bisturíes para picar el tejido en trozos de cinco milímetros cúbicos. Para aislar las células mesoteliales humanas primarias o HPMC, transfiera los trozos de epiplón a un tubo cónico de 50 mililitros y espere un minuto. Para que las piezas sólidas floten hacia la parte superior, el HPMC se asentará en la parte inferior del tubo con los glóbulos rojos.

Use una pipeta para transferir el lavado de PBS que contiene células mesoteliales y glóbulos rojos al tubo que contiene las células granuladas y centrifugar las células. A continuación, añada 20 mililitros de PBS fresco al epiplón y recoja el PBS que contiene HPMC y RB C3 más veces se acaba de demostrar a las células peletizadas originales. Después de la placa de centrifugado final, las células en un matraz de 75 centímetros cuadrados en 15 mililitros de medio de crecimiento completo.

Para aislar HPMC adicional de la muestra de epiplón, agite el tejido sólido restante en 20 mililitros de PBS a 200 RPM y 37 grados Celsius. Después de 10 minutos, deje reposar la muestra durante un minuto para permitir que el tejido sólido suba a la parte superior del tubo. A continuación, recoja la HPMC y los glóbulos rojos de la parte inferior del tubo como se acaba de demostrar.

Ahora, centrifuga las células de este lavado secundario y colócalas en un matraz separado de 75 centímetros cuadrados en 15 mililitros de medio de crecimiento completo. Para aislar cualquier HPMC restante, agite el tejido durante otros 10 minutos, esta vez en una mezcla de PBS y 10 mililitros de tripsin EDTA y coloque estos HPMC y RBC en un matraz de 75 centímetros cuadrados, luego incube los cultivos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en un ambiente humidificado, alimentando las células plateadas con 15 mililitros de agua fresca. Medio de crecimiento completo en los días tres y cinco sin eliminar el medio gastado. Las HPMC se pueden identificar por su forma cuboidal y su expresión de citoqueratina ocho y mentón.

Para aislar los fibroblastos de epiplón normales, trate el tejido de epiplón picado restante con 10 mililitros de solución de colagenasa tipo tres 10 x recién preparada diluida en medio libre de suero durante seis horas con agitación al final del período de incubación, el tejido digerido se habrá vuelto opaco con la solución que contiene algunos desechos fibrosos, centrifugar la suspensión de fibroblastos de epiplón normal, y luego la cultura. Las células en 13 mililitros de medio de crecimiento completo. Después de 24 horas, reemplace el medio viejo con 15 mililitros de medio fresco de crecimiento completo.

Los fibroblastos del epiplón normal se pueden identificar por su forma plana y alargada, su expresión de vimentina y su falta de citoqueratina ayudan a la expresión. Para liberar los fibroblastos del epiplón normal del cultivo, enjuague el matraz de cultivo con 10 mililitros de PBS, seguido de tres mililitros de tripsina durante no más de cinco minutos. Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con al menos tres veces el volumen del medio de crecimiento completo y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros.

Gire las celdas y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de crecimiento completo. Luego cuente las células y dilúyalas a una concentración media de dos a cuatro veces 10 por 10 al tercer fibroblasto por cada 100 microlitros de crecimiento completo. A continuación, agregue 0,5 microgramos por cada 100 microlitros de colágeno de cola de rata, uno a las células y coloque 100 microlitros de células por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo negro y transparente

A continuación, transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular durante al menos cuatro horas o hasta que las células se adhieran a la superficie de la placa, mientras los fibroblastos de momento normal se asientan. Separe el HPMC de sus matraces de cultivo y diluya estas células a una o dos veces, 10 por el cuarto HPMC por cada 50 microlitros de medio de crecimiento completo. A continuación, añada 50 microlitros de HPMC por pocillo a los fibroblastos de epiplón normal adjuntos y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante al menos 18 horas antes de la experimentación.

Utilice la semilla al día siguiente, los cocultivos 3D ORGANOTYPIC con células de cáncer de ovario que expresan GFP de un cultivo confluente del 80 al 90% en la dilución adecuada para el ensayo posterior deseado, el péptido RGD y los anticuerpos bloqueantes contra los alfa cinco, beta uno y alfa cinco. Beta tres. Las integrinas inhiben la adhesión de las células de cáncer de ovario al cultivo organotípico, mientras que el péptido RAD y los anticuerpos de control y beta cuatro integrinas no lo hacen.

El péptido RRG D y los anticuerpos bloqueantes contra la integrina alfa cinco y beta uno también inhiben la proliferación de células de cáncer de ovario en el cultivo organotípico, mientras que el péptido RAD y los anticuerpos de integrina alfa cinco, beta tres y beta cuatro de control no lo hacen. Además, el péptido RGD y los anticuerpos bloqueantes contra la integrina alfa cinco y beta uno inhiben la invasión del cultivo organotípico 3D de células de cáncer de ovario. Si bien el anticuerpo alfa cinco beta tres integrina mejora este proceso como se esperaba de los datos del ensayo de adherencia y proliferación, el péptido RAD y los anticuerpos de integrina beta cuatro tampoco mostraron ningún efecto sobre la invasión de células cancerosas.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en siete a 12 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe usar un gabinete de seguridad biológica y el equipo de protección adecuado, incluida una bata de laboratorio y guantes después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de adhesión, invasión y proliferación, para responder preguntas adicionales sobre las interacciones de las células cancerosas con el microambiente después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer de ovario exploraran cómo el microambiente influye en las interacciones de las células cancerosas con las células de la cavidad peritoneal humana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células primarias del impulso humano y cómo construir un cultivo organotípico del revestimiento peral.