Name: Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a construir un modelo organotípico tridimensional de la cavidad peritoneal humana utilizando células mesoteliales primarias y fibroblastos. Este método permite estudiar la adhesión, invasión y proliferación de células de cáncer de ovario.

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Agradecemos a todos los residentes y médicos tratantes, en particular al Dr. A.F. Haney (Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Chicago) por recolectar biopsias de epiplón. Además, agradecemos a Stacey Tobin y Gail Isenberg por editar cuidadosamente este manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo de Bears Care, el beneficiario benéfico del Chicago Bears Football Club, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) R21 NS075702 y la subvención R01 del Instituto Nacional del Cáncer CA111882 a E.L.

Todos los protocolos de investigación descritos han sido revisados ​​por la Universidad de Chicago Junta de Revisión Institucional (IRB). El consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía y el estudio fue aprobado por la Universidad de Chicago IRB. Un gabinete de seguridad biológica de tipo 2 y los guantes se deben utilizar para la manipulación de tejidos humanos para su protección y para reducir el riesgo de contaminación de las células. 1. Aislamiento y cultivo de células estromales no transformadas primarias <ol><li> Recogida de tejido humano y preparación. <ol><li> Obtener muestras de epiplón humana, 2 cm 3, eliminado durante una cirugía abdominal, y sumergirse de inmediato el tejido en solución salina tamponada con fosfato de RT (PBS) (Figura 2). Un pedazo de epiplón 3 cm x 2 cm típicamente produce 1 millón de células mesoteliales primarios humanos (HPMC) y 200.000 fibroblastos humanos primarios o fibroblastos normales omental (NOF). </li><li> Gira por la PBS el tejido se sumerge en 0,5 g durante 3min tan pronto como sea posible después de la recogida (&lt;2 h en PBS) y transferir el tejido fresco a 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml. Cortar el tejido dentro de 5 mm 3 piezas mediante el picado con escalpelos en un diámetro de 15 cm, placa de cultivo estéril (Figura 2B). </li></ol></li><li> Mesotelial humana primaria aislamiento de células 8 <ol><li> Para aislar HPMC, transferir el tejido picado en 50 ml tubos cónicos y esperar 1 min para los trozos sólidos floten a la parte superior (Figura 2 C + D). HPMC y los glóbulos rojos (RBC) estarán presentes en el líquido en la parte inferior. Usar una pipeta para eliminar el líquido de la parte inferior del tubo y en un nuevo tubo cónico. Girar el líquido hacia abajo a 0,5 xg durante 3 min y aspirar el sobrenadante del sedimento de HPMC / RBC. <ol><li> Repita el proceso tres veces: añadir 20 ml de PBS al tejido picada, deje el tejido se eleve, eliminar el líquido de la parte inferior con una pipeta y en el tubo de HPMC / RBC, girar hacia abajo, y extraiga laflotante. Después de todos los giros se han completado y se aspira el sobrenadante, el sedimento contiene HPMC y RBC. </li></ol></li><li> Plate todas las células del pellet en un matraz 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo (DMEM con 10% de suero bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de ácidos MEM aminoácidos no esenciales [81.4 mg / L], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]). </li><li> Realizar un lavado PBS secundaria para aislar HPMCs adicionales. <ol><li> Para lavar el PBS secundaria, agitar el tejido sólido que queda a 200 rpm, 37 ° C durante 10 minutos en 20 ml de PBS, a continuación, espere 1 minuto para el tejido flote a la cima. Retirar el líquido de la parte inferior del tubo en un nuevo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, y aspirar el sobrenadante. </li><li> Placa todo el HPMC / RBC desde el PBS secundaria de lavado en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo. </li></ol></li><li> Para aislar cualquier remaining HPMC, agitar el tejido picado a 200 rpm, 37 ° C grados durante 10 min en 20 ml de una mezcla 1: 1 0,25% de EDTA mM de tripsina 25: solución de PBS en volumen. Permitir que el tejido se eleve, recoger el líquido en la parte inferior del tubo en un nuevo tubo de 50 ml, y girar hacia abajo en 0,5 gx 3 min. <ol><li> Aspirar el sobrenadante y la placa todo el HPMC / RBC en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo. </li></ol></li><li> Cultivar las células en placas a 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado. Alimentación células sembradas por la adición de 15 ml de medio de cultivo completo en los días 3 y 5 sin necesidad de retirar los medios gastados. HPMC puede ser cultivadas durante 5-7 días antes de la división. <ol><li> Utilice HPMC de bajo paso (hasta el paso 2) en todos los experimentos para minimizar desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio de preferencia con un objetivo de 20x con capacidad de contraste de interferencia diferencial de plástico o objetivo 4-20x con contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste en el microscopio) para tomar todas las imágenes de las células, y un objetivo de 10x () en campo claro para analizar inmunohistoquímica 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB) tinción. </li></ol></li><li> Confirme que la HPMC son cúbicas y expresar citoqueratina 8 y vimentina realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3 A, C, E). </li></ol></li><li> NOF aislamiento 8 <ol><li> Preparar 10 ml de un stock de solución de colagenasa de tipo III (10x) mediante la combinación de una mezcla 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividad / ml de colagenasa de tipo III: actividad 714 unidades / ml de hialuronidasa en PBS. </li><li> Agitar el tejido epiplón picada que permanece después del aislamiento HPMC en 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas en 10 ml de el tipo de solución 10x colagenasa III diluido en medio libre de suero (DMEM con 1% de MEM vitaminas [93 mg / l], 1% aminoácidos no esenciales MEM [81.4 mg / L], 1% penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]). Tejido digerido se verá opaca y puede tener algunos escombros fibrosa (Figura 2E). </li><li> Centrifugar las células NOF solución que contiene en suspensión a 0,5 × g durante 3 min a RT, aspirar el sobrenadante y el sedimento de la placa en un matraz de 75 cm 2 en 13 ml de medio de crecimiento completo. </li><li> Retire los viejos medios y reemplazar con 15 ml de medio de cultivo completo fresco después de 24 horas. NOF puede cultivarse durante 1-3 días antes de la división. Nota proliferación de la NOF cesará cuando las células alcanzan la confluencia. </li><li> Confirme que los fibroblastos humanos primarios son células planas, alargadas y expresan vimentina pero no citoqueratina 8 realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3B, D, F). Utilice NOF bajo paso para experimentos (idealmente antes paso 3) para reducir al mínimo desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio con un objetivo de 20x con plástico capacidades DIC para la toma de todas las imágenes de fase de las células,y un objetivo de 10x en campo claro para analizar tinción inmunohistoquímica DAB. </li></ol></li></ol> 2. Revestimiento del organotípicos Cultura 8 <ol><li> NOF de lanzamiento del matraz de cultivo 75 cm de un enjuague con 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 25 mM durante no más de 5 min. Neutralizar la tripsina con al menos 3 veces el volumen de medio de crecimiento completo. </li><li> Transferencia de las células tratadas con tripsina en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 0,5 gx 3 min. Eliminar el sobrenadante y llevar a las células una copia de seguridad en 5 ml de medio de cultivo completo. Utilice un contador de células para contar las células recuperadas del matraz de cultivo. </li><li> Diluir las células en el volumen apropiado de medio de crecimiento completo a la placa 2.000-4.000 NOF por 100 l en una placa de negro, de fondo transparente, de 96 pocillos. Añadir 0,5 g / 100 l de colágeno de cola de rata I de la mezcla de células antes de la siembra. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 4 horas, o hasta que las célulasa adherirse a la superficie de la placa. </li><li> Soltar HPMC del matraz de cultivo usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1 y 2.2. Diluir las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento completo a la placa de 10.000-20.000 HPMC por cada 50 l en la parte superior de la NOF ya chapada con colágeno I en placas de 96 pocillos. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 18 horas antes de comenzar los experimentos. </li><li> Cultura proteína fluorescente verde (GFP) expresando las células del cáncer de ovario HeyA8 en medio de crecimiento completo. Células de cáncer ovárico HeyA8 están etiquetados con fluorescencia mediante la expresión de un vector lentiviral que expresa copépodos CGFP (Pcdh-CMV-MCS-EF1). Células de cáncer ovárico HeyA8 deben ser 80-90% de confluencia en el día de uso (fase de crecimiento logarítmica). Liberar células de la placa de cultivo y contar usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1-2.2 para las células primarias. </li><li> Permitir que las células de cáncer de ovario se recuperen en medio de crecimiento completo para 15-20 minutos a 37 ° C en untubo cónico con la tapa sellada débilmente. </li></ol> 3. Ensayo de adhesión 8 <ol><li> Después de la recuperación, sedimentar las células de cáncer de ovario haciendo girar durante 3 min a 0,5 × g y luego eliminar el sobrenadante y diluir las células en el volumen apropiado de medio libre de suero para lograr una concentración de 50.000 células / 100 l. </li><li> Invertir las placas de 96 pocillos con los cultivos organotípicos / NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 100 l de la suspensión de células de cáncer en medio libre de suero a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 30 min a 4 h. </li><li> Invierta la placa de 96 pocillos para eliminar los medios de comunicación y las células no adherentes. Utilice una pipeta multicanal a baja potencia para pipetear con cuidado y suavidad 100 l de PBS en cada pocillo, e invertir la placa de nuevo. Repita el PBS lavar una vez más. </li><li> Invertir para eliminar PBS y añadir 100 l de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Permita que la plancha reposar por 20 millasn para fijar las células. Después de 20 minutos, invierta la placa y añadir 100 l de PBS. </li><li> Tenga en cuenta que la fluorescencia total de pozos puede ser reportada o el número de células puede ser cuantificado. Para la cuantificación, primera placa de una curva estándar por duplicado utilizando células HeyA8 a una concentración de 1 millón de células / ml. <ol><li> Hacer la curva estándar desacelerándose 1 millón de células, la eliminación de los medios de comunicación, y que les permite sentarse en 1 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 min. </li><li> Células girar de nuevo y traer en 1 ml de PBS (células de recuento para confirmar 1.000.000 / ml de concentración). Plate 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, y 0 células en cada pocillo en duplicado, y añadir PBS para un volumen total final de 50 l en cada pocillo. </li></ol></li><li> Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm), escalando altos pozos (50.000 en la curva estándar). Utilice la curva estándar para calcular el número de células de cáncer de ovario se adhirieron a la organotypcultura ic en cada pocillo (Figura 4A-C). </li></ol> 4. Ensayo de proliferación de 10 <ol><li> Después de que las células de cáncer de ovario se recuperan (consulte los pasos 2.5 y 2.6 arriba), sedimentar las células por centrifugación durante 3 min a 0,5 xg y luego diluir las células en el volumen apropiado de 1% de FBS medios (DMEM con 1% de FBS, 1% MEM vitaminas [93 mg / l], 1% MEM no esenciales aminoácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]) para lograr una concentración de 4.000 células / 150 l. </li><li> Invierta la placa de 96 pocillos con los / cultivos organotípicos NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 150 l de la suspensión de células de cáncer en el 1% de medios FBS a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 72 hr. </li><li> Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente una vez al día (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm) para evaluar la proliferación relativade las células. Continuar el ensayo durante 96 horas, cambiando los medios de comunicación a las 48 h (Figura 5A-C). Tenga cuidado de no molestar a la cultura al cambiar los medios de comunicación (invirtiendo la placa es preferible). </li></ol> 5. Invasión Ensayo 8 <ol><li> Antes plateando la cultura 3D, agregue el colágeno de cola de rata 7,5 g I en 200 l de PBS a un 24 pocillos de inserción placa de cultivo (8 micras de tamaño de poro). Deje que la placa incubado O / N, a continuación, retire con cuidado la PBS con una pipeta inmediatamente antes plateando la cultura organotípico HPMC / NOF en los insertos recubiertos con colágeno (paso 2 anterior). </li><li> Preparar las células de cáncer de ovario que en el paso 3.1. Para la placa de las células de cáncer de ovario en los cultivos organotípicos en los insertos, utilice cuidadosamente una pipeta para eliminar el exceso de medios de comunicación de la parte superior de los insertos. Añadir 100 l de la suspensión de células cáncer de ovario en medio libre de suero a cada pocillo. </li><li> Añadir 750 l de medio de cultivo completo en el pozo por debajo de la inserción para inducir las células de cáncer eninvasión en los cultivos organotípicos. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 24 hr. Nota: células de cáncer ovárico que invaden el cultivo organotípico cruzará el inserto y permanecer en el lado inferior del inserto. </li><li> Después de 24 horas, sujete el inserto con pinzas y brevemente enjuague en un vaso de precipitados de PBS, a continuación, mueva el inserto en un pozo vacío. Frote la parte superior de cada inserto con ambos lados de un hisopo de algodón para un total de 1 min. Colocar rápidamente el inserto en una placa que contiene 750 l de paraformaldehído al 4% en cada pocillo. Permitir que cada inserto para sentarse en paraformaldehído durante 10 min antes de transferir los insertos en los pozos llenos con 750 l de PBS. </li><li> Ver las células invadidas (adheridas y se fija a la parte inferior de inserciones) con un microscopio con un aumento de 2,5 veces. Cuando todo el bien está dentro del campo de visión, ajustar la ampliación de 10x y tomar 5 fotos, uno cerca del centro y 1 en cada cuadrante del pozo, evitandotomando imágenes que están demasiado cerca de los bordes. Siga el mismo patrón para cada pozo. </li><li> Utilice el programa del fabricante para contar el número de células en cada imagen para obtener un número medio de células invadidas por campo en cada pocillo (Figura 6A-C) de acuerdo con su protocolo. </li></ol>

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<li>Casey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+assay+to+measure+the+invasion+of+ovarian+carcinoma+cells+through+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix.</a> Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+modeling+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional modeling of ovarian cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nature Comm. , (2015).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+is+a+prognostic+factor+in+ovarian+cancer+and+an+effective+target+for+inhibition+of+peritoneal+dissemination+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion.</a> Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).</li>
<li>Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-2+functions+as+an+early+response+protein+in+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis.</a> Cell cycle. 8, 683-688 (2009).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+ovarian+cancer+metastasis+via+alpha+5-integrin%2C+which+is+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target.</a> Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-independent+activation+of+c-Met+by+fibronectin+and+%CE%B1%285%29%CE%B2%281%29-integrin+regulates+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis.</a> Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se estableció un modelo organotípico del microambiente peritoneal para evaluar la función individual y colectiva (s) de ambos los componentes celulares y innatas del microambiente en la diseminación del cáncer de ovario. Se proporcionan los protocolos específicos para el chapado y personalizar el cultivo organotípico 3D para investigar la adhesión de células de ovario cáncer, la proliferación y la invasión. Células epiplón humanos primarios mesoteliales y fibroblastos fueron aisladas de los pacientes y se usan en una pr...

El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal1. La mayoría de los pacientes son diagnosticados después de que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal. Una vez que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal, la cirugía citorreductora y la quimioterapia a menudo no son tratamiento suficiente para prevenir la recurrencia del cáncer y la quimiorresistencia, lo que resulta en una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 30%. La metástasis del cáncer de ovario se limita predominantemente a la cavidad peritoneal, y varios otros tipos de cáncer, incluidos los cánceres gástrico, de páncreas y de colon, hacen metástasis en los mismos sitios anatómicos en la cavidad peritoneal. En general, las células del cáncer de ovario se desprenden del carcinoma in situ en la trompa de Falopio o del tumor ovárico primario, viajan en el líquido peritoneal como células individuales o esferoides y se adhieren a las superficies revestidas de mesotelio del epiplón, el intestino y la pared abdominal2. 
El microambiente tumoral desempeña un papel importante en la progresión de la enfermedad y la quimiorresistencia en muchos cánceres3-6. La cavidad peritoneal es un microambiente único, con una monocapa de células mesoteliales que cubre la mayoría de las superficies (Figura 1A)7. El revestimiento mesotelial actúa como una barrera que crea una superficie de baja fricción, que tiende a proteger contra la adhesión de las células cancerosas8. Inmediatamente debajo de esta superficie revestida de mesotelial hay una capa compuesta predominantemente de fibroblastos y matriz extracelular (MEC), que promueven la adhesión e invasión de las células cancerosas8. Las células de cáncer de ovario secretan factores que inducen cambios en el revestimiento de las células mesoteliales que aumentan la adhesión, invasión y metástasis de las células de cáncer de ovario9,10. Las células de cáncer de ovario se adhieren a la superficie mesotelial a través de mecanismos mediados por integrinas y CD44 (Figura 1B)11-16. 
Históricamente, se han desarrollado varios modelos 3D para investigar las interacciones del cáncer de ovario con el microambiente. Algunos de los primeros modelos estudiaron la interfaz cáncer de ovario-MEC17-21, la comunicación entre el cáncer de ovario y las células mesoteliales13,14,21-24, o ambas25 (revisado por nosotros 26). Niedbala y cols. descubrió que las células de cáncer de ovario muestran una adhesión más rápida y firme a la MEC que a las células mesoteliales o al plástico solo25. Sin embargo, estos modelos no se asemejaban histológicamente al microambiente peritoneal. Por lo tanto, establecimos un modelo organotípico en 3D para replicar de manera más completa el microambiente del cáncer de ovario. Con el fin de comprender mejor el papel del microambiente y la interacción entre el cáncer y las células peritoneales en la diseminación peritoneal del cáncer de ovario, hemos desarrollado un modelo de cultivo organotípico in vitro en 3D del revestimiento de la cavidad peritoneal (esquema en la Figura 1C). El modelo propuesto está compuesto por fibroblastos humanos primarios y ECM, cubiertos con una capa de células mesoteliales humanas primarias: cada tipo de célula se aísla del epiplón humano. Desde el punto de vista histológico, este modelo se asemeja al revestimiento peritoneal u omental normal, y proporciona una superficie en la que podemos estudiar el microambiente tumoral, la interacción entre las células cancerosas y el tejido normal, y los procesos de adhesión, invasión y proliferación de las células cancerosas8.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Aislamiento y cultivo de células primarias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001304</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de un solo filo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 15 cm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de vidrio</td><td>?</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000044_3616914956</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitaminas</td><td>Corning</td><td>25-020-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Agitador&nbsp;</td><td>Centrífuga Thermo-Fisher</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Incubadora Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Incubadora de</td><td>CO2 con camisa de agua Thermo-Fisher Serie II modelo 3100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA, 1x (0.25%)</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Worthington Biochemical LS002592</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matraces T-75 BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td>353136</tr><tr><td>Matraces T-175 BD</td><td>Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>P2, P10, P20, P200 y P1000</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Corning</td><td>Puntas filtradas P2, P10, P20, P200 y P1000</td><td></td></tr><tr><td>Nombre del reactivo/equipo</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>2. Recubrimiento Cultivo 3D</fuerte></td>Contador de células Invitrogen Countess Countess Cámara de recuento de células Portaobjetos Invitrogen C10313 Tinción azul tripán (0,4%)Gibco 15250-061 Colágeno tipo I (cola de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rata)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> placa de 96 pocillos, fondo transparente, negro BD <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Biociencias</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre del reactivo / Equipo</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte</td><td>><fuerte>Comentarios/Descripción</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>3. Ensayo de adhesión</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>Xplorer 300</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 4% en PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Molecular Devices</td><td>Minimax</td><td></td></tr><tr><td>Nombre del reactivo/equipo</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>5. Ensayo de invasión</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular (8um, 24 pocillos)</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>hisopos de</td><td>algodón</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200m</td><td></td></tr><tr><td>Cell Profiler</td> de <td>dominio</td><td></td><td></td>público</tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Nombre del reactivo / Equipo< / fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios/Descripción</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>6. Anticuerpos</anti-integrina fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>y alfa; V&beta; 3 Anticuerpo, clon LM609</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1976</td><td></td></tr><tr><td>Beta 1&nbsp;</td><td>Oncosynergy</td><td>OS2966</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 5 [CD49e]</td><td>ID Pharmingen</td><td>555615</td><td></td></tr><tr><td>Beta 4 [CD104]</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB 2058</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario difusión en una cultura organotípicos del peritoneal cavity humano

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

El patrón de metástasis del cáncer de ovario es marcadamente diferente al de la mayoría de los otros tumores epiteliales, porque rara vez se disemina hematógenamente. En cambio, las células de cáncer de ovario exfoliadas del tumor primario son transportadas por el líquido peritoneal a los sitios metastásicos dentro de la cavidad peritoneal. Estos sitios, sobre todo el peritoneo abdominal y el epiplón, son órganos cubiertos por una superficie revestida de mesotelio. Para investigar los procesos de diseminación del cáncer de ovario, montamos un complejo sistema de cultivo tridimensional que reconstruye in vitro el revestimiento de la cavidad peritoneal. Se aislaron fibroblastos humanos primarios y células mesoteliales del epiplón humano. Luego, los fibroblastos se mezclaron con la matriz extracelular y se cubrieron con una capa de las células mesoteliales humanas primarias para imitar las superficies peritoneales y omentales encontradas por las células de cáncer de ovario en metástasis. Como se muestra, el modelo organotípico resultante se utiliza para examinar las etapas tempranas de la diseminación del cáncer de ovario, incluida la adhesión, invasión y proliferación de las células cancerosas. Este modelo se ha utilizado en varios estudios para investigar el papel del microambiente (celular y acelular) en la diseminación temprana del cáncer de ovario. También se ha adaptado con éxito al cribado de alto rendimiento y se ha utilizado para identificar y probar inhibidores de la metástasis del cáncer de ovario.

El cultivo organotípico se ensambló mezclando primero los fibroblastos humanos primarios con colágeno de tipo I y luego superponiendo esta cultura con 5 veces el número de células mesoteliales. El cultivo se incubó durante al menos 18 horas antes de que se añadieron células de cáncer de ovario para estudiar la adhesión, invasión o proliferación. Cada ensayo se repitió con múltiples (n = 3-5) culturas 3D obtenidos de diferentes pacientes y numerosos pozos fueron probados en cada condición para la adhesión (n = 5), la pro...

Aquí, presentamos un protocolo para construir un modelo tridimensional in vitro del revestimiento de la cavidad peritoneal, compuesto por células mesoteliales humanas primarias y fibroblastos estratificados con matriz extracelular, como herramienta para investigar la adhesión, invasión y proliferación de las células de cáncer de ovario.

Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

El objetivo general de este experimento es crear un modelo organotípico que imite el microambiente peritoneal para mejorar nuestra comprensión de la biología del cáncer de ovario. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de ovario, como cómo las interacciones entre las células cancerosas y el microambiente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad, y cómo se pueden probar posibles inhibidores de estas interacciones. La principal ventaja de esta técnica es que se utilizan células humanas primarias reales que forman el mesotelio, el cual recubre las superficies de la cavidad peritoneal, en el cultivo celular en co-cultivo con células de cáncer de ovario.Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer de ovario, también puede aplicarse al estudio de otros cánceres que se diseminan a través de la cavidad peritoneal, como los cánceres gástrico, pancreático y de colon. Tras obtener una muestra quirúrgica humana de epiplón, sumerja inmediatamente la muestra en PBS a temperatura ambiente. Dentro de las dos horas posteriores a la inmersión, transfiera el epiplón a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de PBS fresc

modeling-early-steps-ovarian-cancer-dissemination-an-organotypic

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El ensayo de depuración mesotelial se describe aquí se aprovecha de las células de la etiqueta fluorescente y time-lapse microscopía de vídeo para visualizar y medir cuantitativamente las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales. Este ensayo permite simular las primeras etapas de la metástasis del cáncer de ovario.

Ensayo in vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico

Se describen las metodologías para el establecimiento...

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

En este video, demostramos el desarrollo de un modelo tridimensional in vitro del revestimiento de la cavidad peritoneal. Este cultivo organotípico puede ayudar a investigar la adhesión, invasión y proliferación de las células de cáncer de ovario.

Modelado de la metástasis del cáncer de ovario en el revestimiento de la cavidad peritoneal: un método para establecer un modelo 3D in vitro del revestimiento peritoneal

En este video, establecemos un cultivo de órganos omental ex vivo superpuesto con células de cáncer de ovario que expresan GFP para estudiar la colonización del cáncer de ovario dentro del explante de epiplón. Este protocolo analiza las estructuras de las células inmunitarias dentro del epiplón conocidas como manchas lechosas que promueven las metástasis.

Modelado de la colonización de células de cáncer de ovario por epiplón: un método ex vivo para establecer la colonización por manchas lechosas de células de cáncer de ovario marcadas con fluorescencia en explantes de epiplón murino

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Describimos un protocolo que implementa enfoques in vivo y ex vivo para estudiar la colonización del cáncer de ovario por los tejidos adiposos peritoneales, particularmente el epiplón. Además, presentamos un protocolo para cuantificar y analizar las estructuras de las células inmunitarias en el epiplón conocidas como manchas lechosas, que promueven las metástasis del tejido adiposo peritoneal.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

Para aclarar el proceso de múltiples etapas de diseminación peritoneal de carcinoma de ovario, el estudio actual presenta un modelo experimental murino de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal a través de la inoculación ortotópico con estas células tumorales.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario

Para estudiar la progresión del tumor de ovario en un modelo fisiológicamente relevante, esferoides multicelulares se cultivaron en un microdispositivo bajo un flujo de fluido simulado. Este modelo 3D dinámico emula el medio ambiente intraperitoneal con los componentes celulares y mecánicas donde se produce la metástasis del cáncer de ovario.

Modelización del comportamiento del cáncer de ovario en un esferoide multicelular Microdevice 3D dinámico peritoneal

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.

Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Aprende a construir un modelo organotípico tridimensional de la cavidad peritoneal humana utilizando células mesoteliales primarias y fibroblastos. Este método permite estudiar la adhesión, invasión y proliferación de células de cáncer de ovario.

Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano

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