Medidas de seguridad y procedimientos de operación en una (A) de laboratorio BSL-4: 2. Prácticas generales

El objetivo general de este procedimiento es demostrar las prácticas seguras al trabajar en un laboratorio con traje de nivel de bioseguridad 4, utilizando el ensayo de placas como ejemplo. Este procedimiento muestra las modificaciones necesarias para realizar un ensayo de placas estándar en un entorno de nivel de bioseguridad 4. Acompañándome en la demostración estará Tracey Burdette, una técnica del Laboratorio de Investigación Integrado.

Tras completar la lista diaria de verificación de los sistemas internos, limpie el gabinete de seguridad biológica de clase II rociando el interior, incluida la compuerta, con una solución desinfectante al 5% de amonio cuaternario dual. Luego, limpie el gabinete con toallas de papel, asegurándose de dejar dentro del gabinete la botella con la solución desinfectante para rociar las manos con guantes durante y después de finalizar el ensayo. Rocíe una solución de etanol al 70% dentro del gabinete y sobre la compuerta para eliminar la solución desinfectante pegajosa.

Prepare un recipiente para desechos en la cabina de seguridad biológica. Asegúrese de que la concentración final de la solución desinfectante de amonio cuaternario doble en el recipiente de desechos no sea inferior al 5 %, teniendo en cuenta cualquier líquido adicional que se agregue. Coloque el recipiente de desechos que contiene una solución desinfectante de amonio cuaternario doble al 5 % dentro de la cabina de seguridad biológica de clase II.

Realice todo el trabajo lo más cerca posible del centro interno de la cabina de seguridad biológica de clase II. El centro interno está diseñado para ser la posición más efectiva para proteger al operador. Retire 50 microlitros de la muestra de virus y del virus control y colóquelos en 450 microlitros de medio de Eagle modificado por Dulbecco con 2% de suero bovino fetal en pozos de dilución.

Continúe realizando diluciones seriadas hasta el grado necesario. Mezcle las muestras de virus al menos cinco veces con una punta de pipeta, cambiando las puntas después de cada dilución. Mezcle lentamente para minimizar la generación de burbujas de aire en las muestras.

Una vez finalizado, aparte los pocillos de dilución. Al desechar las puntas, enjuague cada punta con solución desinfectante del recipiente de desecho para descontaminar el interior y el exterior de la punta antes de expulsarla en el recipiente de desecho. Retire la mayor parte del medio de los pocillos de las placas de cultivo celular de seis pocillos.

Añada 100 microlitros de la muestra correcta en el pocillo adecuado de las placas previamente etiquetadas, en duplicado. Una vez finalizado, rocíe las manos con guantes con la solución desinfectante. Utilice una toalla de papel empapada con la solución desinfectante para limpiar el exterior de todas las placas antes de colocarlas en el incubador manualmente.

Mueva las placas con un movimiento en forma de ocho para asegurar una dispersión adecuada de la muestra sobre las células cada 15 minutos durante una hora. Añada dos mililitros de la mezcla de recubrimiento a cada pocillo y agite nuevamente con un movimiento en forma de ocho para lograr una distribución uniforme del recubrimiento en toda la superficie del pocillo. Sumerja completamente todos los materiales de desecho en solución desinfectante al 5 % en el recipiente de desechos durante un tiempo de contacto de al menos 10 minutos.

Rocíe el interior y exterior del recipiente de desechos, el interior de la cabina de seguridad biológica de clase II, el exterior de los equipos y las manos con guantes con una solución desinfectante al 5%. Deje que la solución permanezca en el recipiente de desechos y sobre las demás superficies durante un tiempo de contacto de 10 minutos. A continuación, retire los objetos de la cabina de seguridad biológica y llévelos al fregadero.

Coloque la pipeta usada en una bandeja para pipetas destinada a la autoclave. Vierta el contenido del recipiente de desechos en un colador colocado en el fregadero. Luego, lleve un recipiente para desechos biológicos que esté forrado con una bolsa roja de peligro biológico hasta el fregadero, y deseche el contenido del colador dentro de la bolsa roja de peligro biológico.

Coloque la bolsa de riesgo biológico sobre una bandeja de autoclave colocada en un carrito. Cierre las bolsas de autoclave con cinta de forma suelta para permitir que el vapor penetre en la bolsa. Y etiquete una de las cintas de autoclave con sus iniciales y la fecha.

Retire la varilla metálica perforada del autoclave y abra la tapa. Coloque un vial indicador biológico que contenga esporas de Geobacillus stearothermophilus dentro de la varilla metálica para verificar que el ciclo de esterilización del autoclave se complete correctamente. Coloque la bandeja del autoclave llena de residuos dentro del autoclave.

Inicie la autoclave y verifique que el ciclo haya comenzado. La pantalla de operación de la autoclave indicará el tiempo restante para esa corrida. Una vez completado el período de incubación requerido, retire cuidadosamente las placas del ensayo de placas del incubador y colóquelas a mano dentro de la cabina de seguridad biológica clase II limpia.

Aspire el medio y el material de recubrimiento con una pipeta y dispense en el recipiente de solución desinfectante. Reemplace el medio con una mezcla de formalina tamponada neutra al 10% y violeta cristal al 0,8% para inactivar el virus durante un tiempo de contacto de 30 minutos. Después de la inactivación, retire cuidadosamente la mezcla de formalina tamponada neutra/violeta cristal y colóquela en un recipiente de desecho separado para ser neutralizada antes de su eliminación.

En el lavabo, enjuague las placas para eliminar el exceso de tinción y luego colóquelas en una bandeja para que sequen completamente. Utilice una caja luminosa para contar las placas. Registre todos los conteos y calcule los títulos virales a partir de la ecuación estándar.

Para la eliminación de muestras inactivadas del laboratorio BSL-4, coloque los tubos o placas en una bolsa sellable térmicamente. Rocíe el interior de la bolsa con una solución desinfectante o fijadora al 5 %, para desinfectar el interior de la bolsa y el exterior de los tubos de muestra. A continuación, selle la bolsa térmicamente.

Coloque esta bolsa dentro de otra bolsa siguiendo el mismo procedimiento. Selle térmicamente la segunda bolsa y coloque las bolsas doblemente selladas en un tanque de inmersión que contenga una solución desinfectante al 5% durante al menos 10 minutos, para desinfectar el exterior de las bolsas. Complete un registro del tanque de inmersión dentro del laboratorio especificando el número y tamaño de los tubos, el volumen en los tubos, el agente utilizado, el método de inactivación empleado y la sala a la que se transferirán las muestras.

Seguir los procedimientos adecuados dentro del laboratorio de nivel de bioseguridad 4 es fundamental para garantizar la finalización segura y eficaz de los ensayos. Al consultar la lista de verificación interna diaria completada, el personal del laboratorio se asegura de que el equipo esté completamente operativo. La muestra del virus se diluye en serie para obtener placas que tengan entre 30 y 300 placas por pocillo y para determinar la titulación del virus.

Varios factores afectan la formación de placas, incluyendo el tropismo del virus por líneas celulares huésped, la técnica de inoculación, las condiciones para el crecimiento del virus, el rango adecuado de dilución y la selección del recubrimiento. Los desechos generados en la cabina de seguridad biológica durante el procedimiento se desinfectan dos veces. Los desechos se desinfectan adecuadamente una vez antes de retirarlos de la cabina de seguridad biológica.

Posteriormente, los desechos se autoclavan antes de salir del entorno de nivel de bioseguridad para animales 4. Al seguir estos procedimientos, no se han registrado infecciones adquiridas en el laboratorio durante la investigación de nivel de bioseguridad para animales 4 en la Instalación de Investigación Integrada en Frederick. Esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas, dependiendo del número de muestras, si se realiza adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, recuerde realizar las diluciones correctamente, contar las placas de manera adecuada y cumplir con todas las precauciones de seguridad para garantizar un experimento seguro y exitoso. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de las limitaciones físicas impuestas por los trajes de presión positiva y del tiempo adicional necesario para completar un ensayo estándar de placas.