Medidas de seguridad y procedimientos de operación en una (A) de laboratorio BSL-4: 2. Prácticas generales

El objetivo general de este procedimiento es demostrar prácticas seguras cuando se trabaja en un laboratorio de bioseguridad de nivel 4 utilizando el ensayo de placa como ejemplo. Este procedimiento demuestra las modificaciones necesarias para realizar un ensayo de placa estándar en un entorno de nivel de bioseguridad 4. Demostrando el procedimiento conmigo con Tracey Burdette, una técnica del Centro de Investigación Integrada.

Al completar la lista de verificación diaria de los sistemas internos, limpie el gabinete de seguridad biológica de clase II rociando el interior, incluida la hoja, con una solución desinfectante de amonio cuaternario dual al 5%. Luego, limpie el gabinete con toallas de papel, asegurándose de dejar la botella rociadora que contiene la solución desinfectante dentro del gabinete para rociar las manos enguantadas durante y después de completar el ensayo. Rocíe una solución de etanol al 70% dentro del gabinete y la hoja para eliminar la solución desinfectante pegajosa.

Prepare un contenedor de residuos para el gabinete de bioseguridad. Asegúrese de que la concentración final de la solución desinfectante de amonio cuaternario dual en el contenedor de residuos no sea inferior al 5%, teniendo en cuenta cualquier líquido adicional que se añada. Coloque el contenedor de residuos que contiene una solución desinfectante de amonio cuaternario doble al 5% dentro del armario de bioseguridad de clase II.

Realice todo el trabajo lo más cerca posible del centro interior de la cabina de bioseguridad de clase II. El centro interior está diseñado para ser la posición más afectiva para protegerse. Extraiga 50 microlitros de muestra de virus y controle el virus y colóquelos en 450 microlitros de medio Dulbecco's Modified Eagle con 2% de suero bovino fetal en pocillos de dilución.

Proceda a hacer diluciones en serie tanto como sea necesario. Mezcle las muestras de virus al menos cinco veces con una punta de pipeta, cambiando las puntas de pipeta después de cada dilución. Mezcle lentamente para minimizar la generación de burbujas de aire en las muestras.

Al finalizar, deje a un lado los pozos de dilución. Al desechar las puntas, enjuague cada boquilla con una solución desinfectante del cubo de residuos para descontaminar el interior y el exterior de la boquilla antes de expulsar la punta en el cubo de residuos. Retire la mayor parte de los medios de los pocillos de las placas de cultivo celular de seis pocillos.

Añada 100 microlitros de la muestra correcta en el pocillo adecuado de las placas preetiquetadas por duplicado. Al finalizar, rocíe las manos enguantadas con la solución desinfectante. Use una toalla de papel empapada con solución desinfectante para limpiar el exterior de todas las placas antes de colocarlas en la incubadora a mano.

Agite las placas con un movimiento en forma de 8 para asegurar la dispersión adecuada de la muestra sobre las células cada 15 minutos durante una hora. Agregue dos mililitros de la mezcla de recubrimiento a cada pozo y moleste una vez más en un movimiento de figura de 8 para una distribución uniforme de la capa superior en toda la superficie del pozo. Sumerja completamente todo el material de desecho en una solución desinfectante al 5% en el cubo de residuos durante un tiempo de contacto de al menos 10 minutos.

Rocíe el interior y el exterior del cubo de residuos, el interior del gabinete de bioseguridad de clase II, el exterior del equipo y las manos enguantadas con una solución desinfectante al 5%. Deje que la solución permanezca en el cubo de residuos y en otras superficies durante un tiempo de contacto de 10 minutos. A continuación, retire los artículos del armario de bioseguridad y llévelos al fregadero.

Coloque la pipeta usada en una bandeja de pipetas para esterilizarla en autoclave. Vierta el contenido del cubo de basura en un colador en el fregadero. Luego, lleve al fregadero un contenedor de desechos de riesgo biológico que esté forrado con una bolsa roja de riesgo biológico y vierta el contenido del colador en la bolsa roja de riesgo biológico.

Coloque la bolsa de riesgo biológico en una bandeja de autoclave en un carrito. Cierre sin apretar las bolsas del autoclave con cinta adhesiva para permitir que el vapor entre en la bolsa. Y etiquetar una de las cintas del autoclave con las iniciales y la fecha.

Retire la varilla de metal perforada del autoclave y abra la parte superior. Coloque un vial indicador biológico que contenga esporas de Geobacillus stearothermophilus en la varilla metálica para que sirva como control de que el ciclo de esterilización en autoclave se completa con éxito. Coloque la bandeja del autoclave llena de residuos en el autoclave.

Ponga en marcha el autoclave y compruebe que el ciclo ha comenzado. La pantalla de funcionamiento del autoclave indicará el tiempo restante para esa ejecución. Una vez completado el período de incubación requerido, retire cuidadosamente las placas de ensayo de placa de la incubadora y colóquelas a mano en la cabina de bioseguridad limpia de clase II.

Aspire el medio y el material de recubrimiento con una pipeta y dispense en el recipiente de la solución desinfectante. Reemplace el medio con una mezcla de 10% de formalina tamponada neutra y 0,8% de violeta cristalino para inactivar el virus durante un tiempo de contacto de 30 minutos. Después de la inactivación, retire con cuidado la mezcla de formalina neutra tamponada / violeta cristal y colóquela en un contenedor de desechos separado para neutralizarla antes de desecharla.

En el fregadero, enjuague las placas para eliminar el exceso de manchas y luego coloque las placas en una bandeja para que se sequen por completo. Usa una caja de luz para contar las placas. Registre todos los recuentos y calcule los títulos de virus a partir de la ecuación estándar.

Para la extracción de muestras inactivadas del laboratorio BSL-4, coloque los tubos o placas en una bolsa termosellada. Rocíe el interior de la bolsa con una solución desinfectante o fijadora al 5%, para desinfectar el interior de la bolsa y el exterior de los tubos de muestra. Y luego selle la bolsa con calor.

Coloque esta bolsa en otra bolsa siguiendo el mismo procedimiento. Selle con calor la segunda bolsa y coloque las bolsas de doble sellado en un tanque de inmersión que contenga una solución desinfectante al 5% durante al menos 10 minutos, para desinfectar el exterior de las bolsas. Llene un libro de registro del tanque de inmersión dentro del laboratorio delineando el número y el tamaño de los tubos, el volumen de los tubos, el agente utilizado, el método de inactivación utilizado y la sala a la que se transferirán las muestras.

Seguir los procedimientos adecuados dentro del laboratorio de nivel de bioseguridad 4 es fundamental para garantizar la finalización segura y eficaz de los ensayos. Al consultar la lista de verificación interna diaria completada, el personal del laboratorio se asegura de que el equipo esté completamente operativo. La muestra de virus se diluye en serie para obtener placas que tienen de 30 a 300 placas por pocillo y para determinar el título del virus.

Una serie de factores afectan la formación de placas, incluido el tropismo del virus para las líneas celulares huésped, la técnica de inoculación, las condiciones para el crecimiento del virus, el rango de dilución apropiado y la selección de superposición. Los residuos generados en la cabina de bioseguridad durante el procedimiento se desinfectan dos veces. Los residuos se desinfectan adecuadamente una vez antes de retirarlos del armario de bioseguridad.

Posteriormente, los residuos se esterilizan en autoclave antes de salir del entorno de nivel 4 de bioseguridad animal. Siguiendo estos procedimientos, no se han registrado infecciones adquiridas en laboratorio durante la investigación de nivel 4 de bioseguridad animal en el Centro de Investigación Integrada de Frederick. Esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas dependiendo del número de muestras si la técnica se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, recuerde realizar las diluciones correctamente, contar las placas en consecuencia y cumplir con todas las precauciones de seguridad para garantizar un experimento seguro y exitoso. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de las limitaciones físicas impuestas por los trajes de presión positiva y el tiempo adicional requerido para completar un ensayo de placa estándar.