Name: Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a preparar rebanadas cerebrales agudas mediante el método optimizado de recuperación protectora con NMDG. Esta técnica mejora la preservación neuronal para experimentos de electrofisiología de patch clamp en animales adultos.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Allen para la ciencia del cerebro. Los autores desean agradecer a los fundadores del Instituto Allen, Paul G. Allen y Jody Allen, por su visión, ánimo y apoyo. Agradecemos también el personal de apoyo técnico del Instituto de Allen para realizar genotipado, la cría y cuidado de los animales.

Los autores no tienen nada que revelar.

Na + Spike - mejora Gigaohm sello formación y éxito la grabación de la abrazadera del remiendo La versión inicial del método de recuperación protección NMDG fue diseñada específicamente para animales adultos y envejecimiento2,5. Algunos pioneros también han intentado aplicar esta metodología a corte juvenil cerebro animal (es decir, ratones < 30 días de edad). Sin embargo, se ha observado que a diferencia de la excepcional confirmado visualmente neuronal preservación con el método de recuperación protección NMDG en este rango de edad, gigaohm sello formación puede frecuentemente puesto hacia fuera, hacia la abrazadera del remiendo fallidos intentos de grabación. Una hipótesis es que NMDG cationes más fácilmente son atrapados en rebanadas de cerebro juvenil en relación con rebanadas del cerebro adulto y pueden impedir la formación de sello; sin embargo, gigaohm juntas pueden formar fácilmente mientras que rebanadas de cerebro juvenil están completamente sumergidos en NMDG aCSF (datos no mostrados), así indicando NMDG aCSF por sí no impide el gigaohm sello formación.
La transición rápida de solución de Na+ de bajo a alto al finalizar el paso de recuperación de rebanada de cerebro inicial causa daño a las membranas neuronales y perturba el proceso de formación de sello. Esto es intuitivo ya que la transición de bajo a alto Na+, temperatura de fría a caliente y elevación dramática de la Ca2 + Mg2 + relación entre llevar colectivamente a un resurgimiento masivo de la actividad sináptica espontánea. Esta fase de rebote inhibitorio en el cerebro rebanado procedimiento es probable que después de un insulto isquémico por reperfusión del espejo. Así, a otros mitigar daño de la membrana neuronal en la fase de recuperación inicial que se ha incorporado un gradual Na+ spike en procedimiento en el que la elevación de la concentración de Na+ en la cámara de incubación NMDG protección recuperación es lenta y reproducible con la sincronización exacta. Como en el procedimiento de recuperación protectora original, la disociación temporal de Na+ elevación de la temperatura y Ca2 +/Mg2 + cociente de la elevación es beneficiosa. Pero además, el Na+ spike en procedimiento conduce a aumento incremental en la concentración extracelular de Na+ sobre los primeros momentos y grandes aumentos hacia los puntos finales del tiempo, así que el tejido cerebral una oportunidad para acomodar mejor a los crecientes niveles de Na+ . Este procedimiento es que una alternativa al intercambio de solución gradual controlado por una bomba de perfusión o gravedad líneas de goteo que conducen a incrementos constantes en los niveles de Na+ y requieren atención para entrada y salida para evitar el desbordamiento de la cámara del sector. En particular, en este Na+ procedimiento de spike la osmolalidad de la solución en la cámara de corte poco a poco se levanta durante un período de varios minutos antes de las láminas vuelven a solución osmolalidad normal, pero esto no afectó negativamente la salud del sector o abrazadera del remiendo éxito la grabación. Una solución de corte de alta osmolaridad se ha utilizado anteriormente para las preparaciones de cerebro medio rebanada para mejor preservar las neuronas de dopamina para patch clamp grabaciones57,58, demostrando así que este temporal hyperosmolality puede ser beneficioso en algunos contextos.
Mediante la aplicación de un procedimiento optimizado que combina el método de recuperación protección NMDG y gradual Na+ spike en paso la utilidad de esta metodología de rebanada del cerebro se ha ampliado para cubrir menores a través de las edades animales adultos maduras. Este protocolo actualizado ahora es conveniente para una amplia gama de edades animales mediante un único óptimo NMDG aCSF formulación y procedimiento. Si es necesario, el procedimiento de punto Na+ puede ser aplicado con un retardo progresivamente más largo o más lento curso del tiempo para mejorar la viabilidad de las rebanadas de cerebro de animales más viejos, y hemos proporcionado a una guía básica de recomendado spike en horarios según para animales de edad (ver tabla 2). Mientras que hemos proporcionado un marco básico adecuado para una amplia gama de aplicaciones, pasos avanzados adicionales pueden ser exploradas para mejorar aún más la viabilidad y longevidad de las rebanadas de cerebro de animales adultos y envejecimiento. Por ejemplo, estrategias de restauración de glutatión son particularmente eficaces en este sentido y pueden aplicarse como se describe en otra parte2,6.
Mejora de rendimiento para impugnar experimentos El análisis de la conectividad sináptica por la grabación de abrazadera del remiendo es una aplicación exigente que requiere excelente preservación de la estructura neuronal y función para lograr una alta confiabilidad del éxito. Como el número de neuronas al mismo tiempo grabar sube linealmente, el nivel de dificultad técnica aumenta supra-linealmente. Hay numerosos modos de falla, y una de las causas más frecuentes de fracasos es la incapacidad para sellos de forma adecuada gigaohm en uno o más de las células apuntadas. Esto dramáticamente puede ralentizar el progreso, sobre todo cuando tres o más neuronas se registrarán simultáneamente. Consistente con el hallazgo de más rápido gigaohm sello tiempo de formación con el método de recuperación protección NMDG optimizado, hubo una notable mejora en la tasa de éxito y rendimiento de grabación de múltiples neuronas parche abrazadera experimentos con tanto adulto transgénicos rebanadas de cerebro de ratón y rebanadas de cerebro neuroquirúrgica humano adulto. La mejora de la eficiencia es seguramente atribuible a la formación de sello gigaohm más rápido y confiable y la mejor preservación neuronal de las rebanadas con este protocolo. Aunque este protocolo se centra en los beneficios expresamente para aplicaciones de grabación de la abrazadera del remiendo, se anticipan aumentos similares para otras aplicaciones experimentales difíciles donde la viabilidad de rebanada del cerebro es fundamental.

La preparación de rebanada cerebral aguda es un sistema esencial de modelo experimental en Neurociencia. Aproximadamente la mitad de un siglo, esta plataforma permite estudios dinámicos funcionales del cerebro vivo en una amplia variedad de especies animales y regiones anatómicas del cerebro. Si el uso es bioquímica, proyección de imagen funcional, morfología y electrofisiología, es de suma importancia para garantizar una óptima integridad y viabilidad de los tejidos en rodajas. Es por ello que la preparación de la rebanada del cerebro roedores juveniles altamente resistente (es decir, menores de día postnatal 30 para ratones) ha sido el preferido hasta la fecha. La dificultad en la obtención de cerebro suficientemente sano rebanadas de adulto maduro y crianza de animales ha demostrado para ser un desafío formidable para la mayoría y ha impuesto severas limitaciones para el estudio de la arquitectura funcional del cerebro maduro. Esto es particularmente cierto para la abrazadera del remiendo de grabación, una técnica que requiere preservación morfológica y funcional excelente y es indispensable para la caracterización detalladas propiedades intrínsecas y sinápticas de las neuronas individuales identificadas. Durante las últimas décadas, la gran mayoría de electrofisiólogos de abrazadera del remiendo se ha basado en un método de 'protección corte' utilizando sacarosa-sustituido bajo Na+ aCSF1 para la preparación de rodajas de cerebro sano de juvenil y en mucho menor medida, los animales adultos jóvenes. Este método se basa en la premisa que afluencia de Na+ pasiva y entrada de agua posterior y celular inflamación durante el paso de corte de la rebanada es el insulto predominante que lleva a la pobre supervivencia de las neuronas, particularmente para las neuronas ubicadas en la capas superficiales que son más propensos a mantener el trauma directo del movimiento de la hoja. Sin embargo, el método de corte protector todavía deja mucho que desear para la preparación de rebanada de cerebro de animales adultos maduros independientemente de la formulación particular aCSF implementado.
Una solución simple pero efectiva a este problema ha sido descrito2,3,4,5,6 y denomina el método de corte de cerebro 'protección recuperación'. La versión original de este método utiliza un aCSF NMDG-sustituido, NMDG fue identificado como el más versátil y efectivo entre varios otros candidatos sodio iones sustitutos (como sacarosa, glicerol, colina y Tris). La formulación de los medios de comunicación fue reforzada por la adición de HEPES para resistir el edema de la rebanada del cerebro y proporcionan más fuerte pH buffer7, así como la adición de suplementos para contrarrestar los efectos perjudiciales del estrés oxidativo (tabla 1). Se determinó empíricamente que una incubación de recuperación inicial en baja Na+, baja Ca2 +, y alto Mg2 + NMDG aCSF inmediatamente después de corte de tejido de cerebro adulto era necesario y suficiente para mejora neuronal conservación sobre una amplia gama de regiones cerebrales, tipos de células y animales edad3,5,6.
En particular, las encarnaciones anteriores de lo que ahora es llamado el método de recuperación protección pueden encontrarse en la literatura1,8,9,10,11,12, 13, aunque todo el potencial para maduros adultos y envejecimiento animal cerebro rebanada y parche abrazadera grabación no fue reconocida o demostrada en estos trabajos anteriores. Además, matizadas variaciones procesales siguen apareciendo en apoyo de aplicaciones experimentales4,14,15,16. El cuerpo colectivo de trabajo de estos numerosos grupos de investigación imparte alta confianza en la robustez del método de protección recuperación para la preservación de tejido mejorado. El método de recuperación protección NMDG ahora ha sido ampliamente adoptado y aplicado en numerosos estudios de investigación publicados utilizando preparaciones de rebanada de cerebro de animales adultos. Estos estudios de corte aguda palmo neocortical3,17,18, hipocampo15,19,20,21, estriado22 , 23 , 24, midbrain25,26,27,28,29y cerebelo30,31,32, 33 , regiones de 34 y una variedad de tipos de neurotransmisor y neuromodulador incluyendo glutamatérgica4,30, GABAérgico18,20,31,35 ,36, dopaminérgico24,29,37,38, colinérgicos14,37,38, 39, noradrenérgicas40y serotonergic27,28 neurotransmisión. El método está también bien adaptado para el control de optogenetic de la actividad neuronal en sectores derivados de animales transgénicos3,39 o siguiendo en vivo inyecciones virales17,27, 28,40,41,42,43, como bien como Ca2 + proyección de imagen funcional de la actividad neuronal2,44 ,45,46. Análisis de corto plazo plasticidad4,47,48 y diversas formas de plasticidad a largo plazo16,de35,48 han sido registrados. Un reciente estudio aplicó el método de recuperación protección NMDG para facilitar amplia y sistemática de sondeo de la conectividad sináptica en la corteza visual en rebanadas de cerebro de ratón adulto maduro usando el octopatch grabación configuración49 — un poderoso demostración de la utilidad y la robustez de este método. El método de recuperación protección incluso se ha aplicado con éxito en contextos experimentales previamente imprevistos, tales como, mejor preservación de la vasculatura y del pericitos en el cerebro cortical adulto rodajas50, abrazadera del remiendo de la grabación trasplantado las poblaciones interneurona en 1 a 1,5 años de Alzheimer ratón modelos20y un cerebro adulto rebanada del receptor tráfico ensayo51.
El siguiente protocolo describe los procedimientos paso a paso para implementar un método de protección recuperación NMDG optimizado de preparación de rebanada del cerebro para mejorar la viabilidad de las rebanadas de cerebro agudo. Se discuten los principios para la mejor preservación neuronal, así como la demostración de los beneficios claros de esta metodología para abrazadera de parche neurona múltiples complejos experimentos de grabación en rebanadas de cerebro de ratón transgénico adulto joven y adulto maduro rebanadas de cerebro humano neuroquirúrgica. El siguiente protocolo validado para ratones de 21 días de edad a más de un años de edad, así como por muestras neuroquirúrgicas humanas derivadas de pacientes adultos.

<table><tbody><tr><td>Comprestomo VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Cortadora de tejidos vibratoria (recomendado)</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>fosfato de sodio monobásico dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5761</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Ascorbato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF constituyente</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Componente anestésico 1</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Componente anestésico 2</td></tr><tr><td>Pinzas romas curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07 Herramientas de</td><td>disección cerebral</td></tr><tr><td>Tijeras de disección fina (supercut)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Herramientas de disección cerebral</td></tr><tr><td>Tijeras grandes y resistentes 7''</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18 Herramientas de</td><td>disección cerebral</td></tr><tr><td>Espátula de metal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Herramientas de disección cerebral</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Herramientas de disección cerebral</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4 cámara de retención de</td><td>corte</td>cerebral</tr><tr><td>malla de nylon&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Para la construcción de cámaras de recuperación de lonchas pequeñas Vasos</td></tr> de <tr><td>precipitados de vidrio Pyrex (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Para la construcción de cámaras de recuperación de lonchas pequeñas</td></tr><tr><td>Plato de plástico de 35 mm, redondo</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Para la construcción de cámaras de recuperación de lonchas pequeñas</td></tr><tr><td>Piedras difusoras de gas (10 y micro; m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Para carbogenación constante (burbujas finas)</td></tr><tr><td>Agarosa Tipo I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Para la inclusión de muestras de cerebro Puntas de</td></tr><tr><td>micro cargador</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Para el llenado de electrodos de abrazadera de parche</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Para hacer una plataforma de disección personalizada</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Para el ajuste del pH de los medios</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Para el ajuste del pH de los medios</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Para el ajuste del pH de los medios</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico 3 mL graduadas</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Para la transferencia de rebanadas</td></tr><tr><td>Cuchillas inyectoras cerámicas de circonio</td><td>Cadence Cuchillas especiales</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 vidrio de borosilicato capilar con filamento</td><td>King Glass Company</td> ID <td>de cotización personalizada</td><td>: 0,87 mm, diámetro exterior 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>Fosfocreatina disódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>Gluconato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S0389</td><td>Solución de pipeta interna</td></tr><tr><td>Baño de agua caliente (2,5 L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td></td></tr><tr><td>Varios Papel de filtro rondas</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>diverso Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Miscelánea</td></tr><tr><td>10X Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Jeringas diversas</td></tr> de <tr><td>30 mL</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Jeringas diversas</td></tr><tr><td>de 1 mL</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Miscelánea</td>de</tr><tr><td>25 agujas de calibre 5/8</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Miscelánea</td></tr><tr><td>Termomezclador (con bloque de tubo de 1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Para mantener la agarosa fundida&nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado n-metil-d-glucamine recuperación protección método

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Este protocolo es una guía práctica para el N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Numerosos estudios recientes han validado la utilidad de este método para mejorar la preservación neuronal y viabilidad de rebanada de cerebro total. La aplicación de esta técnica por pioneros ha facilitado investigaciones detalladas en función cerebral utilizando diversas aplicaciones experimentales y que abarcan una amplia gama de edades animales, regiones del cerebro y tipos de la célula. Se describen los pasos para llevar a cabo la técnica de corte de cerebro protección recuperación utilizando una formulación de medios de comunicación de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) NMDG optimizada y un procedimiento mejorado para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano para electrofisiología de la abrazadera del remiendo. Con este enfoque actualizado, se observa una mejora sustancial en la velocidad y fiabilidad del gigaohm sello de formación durante la abrazadera del remiendo dirigido experimentos de grabación manteniendo excelente preservación neuronal, facilitando así un reto aplicaciones experimentales. Resultados representativos son siempre de la abrazadera del remiendo de la neurona de múltiples experimentos para ensayo de grabación conectividad sináptica en rebanadas de cerebro neocortical preparado a partir de ratones transgénicos adulto joven y madurados ejemplares adultos de Neurocirugía humanas. Además, el método de recuperación protección NMDG optimizado de corte de cerebro es compatible con animales juveniles y adultos, por lo tanto resolver una limitación de la metodología original. En Resumen, una sola formulación y procedimiento de corte de cerebro se pueden implementar a través de diversas especies y edades para lograr preservación excelente de la viabilidad y el tejido.

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de cerebro sanos de animales adultos maduros que sean adecuados para experimentos de electrofisiología con pinzas de parche. Por lo tanto, este método optimizado de recuperación protectora NMDG para la preparación de cortes de cerebro permite a los investigadores explorar las propiedades intrínsecas y sinápticas de los tipos de células cerebrales en muchas regiones cerebrales diferentes y para animales de prácticamente cualquier edad. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica en particular es que permite preparar cortes de cerebro que tienen un mayor grado de preservación neuronal en comparación con las metodologías anteriores.Y también que estos cortes de cerebro son más adecuados para la grabación de pinzas de parche. Este método se optimizó para el tejido cerebral de ratones adultos. Se puede utilizar para una variedad de otras especies, incluido el tejido cerebral humano resecado neuroquirúrgicamente.Para comenzar este procedimiento, configure la estación de corte con la máquina cortadora de tejidos e instrumentos quirúrgicos. Fije una cuchilla inyectora de cerámica de circonio al brazo de la cuchilla con pegamento adhesivo rápido. A continuación, inserte el portamuestras y alinee el borde delantero de la hoja con el borde del portamuestras.Dejando un pequeño espacio para asegurar que la hoja no raspe el metal. Llene un vaso de precipitados de 250 mililitros con 200 mililitros de NMDG HEPES aCSF. Y enfriarlo previamente en hielo con carbogenación constante durante más de 10 minutos.A continuación, configure la cámara de recuperación inicial de cortes de cerebro llenándola con 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF. Y coloque la cámara en un baño de agua a 32 a 34 grados centígrados. Para configurar una cámara de retención de rebanadas de cerebro, llene el depósito con 450 mililitros de HEPES aCSF y deje que se caliente a temperatura ambiente bajo carburación constante hasta su uso.A continuación, prepare la agarosa fundida para la inclusión en el tejido cortando un bloque de 2% de agarosa de un plato previamente preparado con el extremo abierto de un vial cónico de 50 mililitros. Tape sin apretar el frasco cónico y luego cocine en el microondas durante 10 a 30 segundos hasta que la agarosa comience a derretirse. No sobrecalentar.Vierte la agarosa fundida en tubos de 1,5 mililitros. Mantenga la agarosa en estado fundido usando un termomezclador ajustado a 42 grados centígrados con una agitación vigorosa. Y asegúrese cuidadosamente de que la agarosa fundida no se solidifique prematuramente.Enfríe previamente el bloque de enfriamiento de accesorios para la cortadora en hielo en este momento. En este procedimiento, haga un corte en la piel de la cabeza para exponer la escutelaria. Luego, usa unas tijeras finas súper cortadas para cortar la piel sobre la escutelaria.Y hacer pequeñas incisiones lateralmente a ambos lados de la base ventral caudal del cráneo. Realice cortes superficiales adicionales comenzando en la cara dorsal caudal del cráneo, moviéndose en la dirección rostral hasta la línea media dorsal. Teniendo cuidado de no dañar el cerebro subyacente.Después de eso, haga un corte final en T perpendicular a la línea media a la altura de los bulbos olfativos. Posteriormente, utilice las pinzas de punta redonda para agarrar el cráneo empezando por la cara medial rostral y despegue hacia la dirección lateral caudal en un lado. Repita este procedimiento para que el otro lado se abra.Y quitar las mitades dorsales de la tapa del cráneo para exponer el cerebro. Saque suavemente el cerebro intacto y colóquelo en el vaso de precipitados de NMDG HEPES aCSF preenfriado. Y deje que el cerebro se enfríe uniformemente durante aproximadamente un minuto.Ahora, use una espátula grande para transferir el cerebro del vaso de precipitados a la placa de Petri cubierta con papel de filtro. Recorte y monte el cerebro de acuerdo con el ángulo preferido de corte y la región cerebral deseada de interés. Trabaje rápidamente para evitar la privación prolongada de oxígeno durante la manipulación.Luego, fije el bloque cerebral al portamuestras con pegamento adhesivo. Retraiga la pieza interior del portamuestras para retirar el bloque cerebral completamente hacia adentro. A continuación, vierta la agarosa fundida directamente en el soporte hasta que el bloque cerebral esté completamente cubierto de agarosa.A continuación, sujete el bloque de enfriamiento de accesorios preenfriado alrededor del portamuestras durante diez segundos hasta que la agarosa se haya solidificado. Inserte el portamuestras en el receptáculo de la máquina cortadora y verifique la alineación adecuada. A continuación, llene el depósito con el resto de NMDG HEPES aCSF oxigenado preenfriado del vaso de precipitados de 250 mililitros y coloque la piedra de burbujas en el depósito durante el corte durante el corte, para garantizar una oxigenación adecuada.A continuación, ajuste el micrómetro para comenzar a avanzar el espécimen de cerebro incrustado en agarosa. Inicie la cortadora y ajuste empíricamente la velocidad de avance y la frecuencia de oscilación al nivel deseado. Continúe avanzando y cortando el tejido en incrementos de 300 micrómetros hasta que la región del cerebro de interés esté completamente seccionada.El tiempo total para el procedimiento de corte debe ser inferior a 15 minutos. Para la recuperación inicial de NMDG. Una vez finalizado el procedimiento de seccionamiento, recoja todas las rodajas con una pipeta de plástico para pastos recortada y transfiérelas a una cámara de recuperación a 34 grados centígrados llena de 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF.El momento de la recuperación aguda del corte cerebral es muy importante para poder lograr un equilibrio entre la preservación morfológica y la recuperación funcional de las propiedades electrofisiológicas de cada neurona. Después de determinar el programa óptimo de aumento de sodio, de acuerdo con la edad del ratón, lleve a cabo el procedimiento de aumento de sodio del Paso Y agregando los volúmenes indicados de solución de pico de sodio en los momentos indicados. Agregue la solución de pico de sodio directamente en la chimenea del burbujeador de la cámara de recuperación inicial para facilitar la mezcla rápida.El programa de aumento de sodio que se proporcionó con una variedad de diferentes rangos de edad es un muy buen punto de partida. Pero debe optimizarse y utilizarse para su propio diseño experimental específico. A continuación, transfiera todas las lonchas a la cámara de retención a largo plazo HEPES aCSF mantenida a temperatura ambiente.Deje que los cortes se recuperen durante otra hora en la cámara de retención HEPES antes de los experimentos de registro de pinzas de parche. Aquí se muestran las imágenes representativas de IR DIC que se adquirieron de diversas regiones del cerebro y cortes agudos de un ratón de tres meses de edad para la evaluación de la preservación morfológica de las neuronas. Los resultados que se muestran aquí provienen del uso del método de corte protector NMDG de control sin un paso de recuperación protectora.Mientras que estos resultados provienen del método optimizado de recuperación protectora NMDG. En general, se observa una mejora en la preservación neuronal con el método optimizado de recuperación protectora NMDG. Se comparó el método optimizado de recuperación protectora de NMDG con un procedimiento de aumento gradual de sodio con el método original de recuperación protectora de NMDG.El tiempo promedio para la formación del sello GigaOhm y el registro de la pinza del parche se redujo drástica y significativamente cuando se aplicó el procedimiento de pico gradual de sodio junto con el paso de recuperación protectora NMDG. La preservación mejorada de las neuronas lograda con este método de corte de cerebro facilita aplicaciones experimentales desafiantes que incluyen, entre otras, la electrofisiología de la pinza de parche de múltiples electrodos para sondear la conectividad sináptica local. Como se ha demostrado aquí, el uso de cortes de cerebro neocortical ex vevo humanos adultos derivados de la neurocirugía.Al ver este video, los científicos deberían tener una buena comprensión sobre cómo implementar nuestro método optimizado de recuperación protectora NMDG, incluido el nuevo procedimiento de pico de sodio que hemos descrito, para preparar cortes de cerebro que sean adecuados para grabaciones de pinzas de parche. Por lo tanto, después de dominar este protocolo, debería ser posible completar el procedimiento de corte de cerebro en menos de una hora cada día. Y debería producir cortes de cerebro reproducibles de alta calidad y funcionará para animales de prácticamente cualquier edad.Por lo tanto, este procedimiento, este método puede ayudar a preparar cortes de cerebro que sean adecuados para abordar preguntas sobre la función cerebral utilizando técnicas como la electrofisiología, las imágenes ópticas en vivo y la optogenética, los ensayos de tráfico de receptores y otros tipos de ensayos funcionales para explorar la función de los tipos de células cerebrales. Por lo tanto, esta técnica también es útil porque ayudará a los investigadores a poder sondear funcionalmente diferentes regiones del cerebro, incluidas regiones del cerebro que tradicionalmente no son susceptibles de registro de parches de animales adultos en cortes de cerebro.

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Investigación

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Neurociencia

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