Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de cerebro sanos de animales adultos maduros que sean adecuados para experimentos de electrofisiología con pinzas de parche. Por lo tanto, este método optimizado de recuperación protectora NMDG para la preparación de cortes de cerebro permite a los investigadores explorar las propiedades intrínsecas y sinápticas de los tipos de células cerebrales en muchas regiones cerebrales diferentes y para animales de prácticamente cualquier edad. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica en particular es que permite preparar cortes de cerebro que tienen un mayor grado de preservación neuronal en comparación con las metodologías anteriores.

Y también que estos cortes de cerebro son más adecuados para la grabación de pinzas de parche. Este método se optimizó para el tejido cerebral de ratones adultos. Se puede utilizar para una variedad de otras especies, incluido el tejido cerebral humano resecado neuroquirúrgicamente.

Para comenzar este procedimiento, configure la estación de corte con la máquina cortadora de tejidos e instrumentos quirúrgicos. Fije una cuchilla inyectora de cerámica de circonio al brazo de la cuchilla con pegamento adhesivo rápido. A continuación, inserte el portamuestras y alinee el borde delantero de la hoja con el borde del portamuestras.

Dejando un pequeño espacio para asegurar que la hoja no raspe el metal. Llene un vaso de precipitados de 250 mililitros con 200 mililitros de NMDG HEPES aCSF. Y enfriarlo previamente en hielo con carbogenación constante durante más de 10 minutos.

A continuación, configure la cámara de recuperación inicial de cortes de cerebro llenándola con 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF. Y coloque la cámara en un baño de agua a 32 a 34 grados centígrados. Para configurar una cámara de retención de rebanadas de cerebro, llene el depósito con 450 mililitros de HEPES aCSF y deje que se caliente a temperatura ambiente bajo carburación constante hasta su uso.

A continuación, prepare la agarosa fundida para la inclusión en el tejido cortando un bloque de 2% de agarosa de un plato previamente preparado con el extremo abierto de un vial cónico de 50 mililitros. Tape sin apretar el frasco cónico y luego cocine en el microondas durante 10 a 30 segundos hasta que la agarosa comience a derretirse. No sobrecalentar.

Vierte la agarosa fundida en tubos de 1,5 mililitros. Mantenga la agarosa en estado fundido usando un termomezclador ajustado a 42 grados centígrados con una agitación vigorosa. Y asegúrese cuidadosamente de que la agarosa fundida no se solidifique prematuramente.

Enfríe previamente el bloque de enfriamiento de accesorios para la cortadora en hielo en este momento. En este procedimiento, haga un corte en la piel de la cabeza para exponer la escutelaria. Luego, usa unas tijeras finas súper cortadas para cortar la piel sobre la escutelaria.

Y hacer pequeñas incisiones lateralmente a ambos lados de la base ventral caudal del cráneo. Realice cortes superficiales adicionales comenzando en la cara dorsal caudal del cráneo, moviéndose en la dirección rostral hasta la línea media dorsal. Teniendo cuidado de no dañar el cerebro subyacente.

Después de eso, haga un corte final en T perpendicular a la línea media a la altura de los bulbos olfativos. Posteriormente, utilice las pinzas de punta redonda para agarrar el cráneo empezando por la cara medial rostral y despegue hacia la dirección lateral caudal en un lado. Repita este procedimiento para que el otro lado se abra.

Y quitar las mitades dorsales de la tapa del cráneo para exponer el cerebro. Saque suavemente el cerebro intacto y colóquelo en el vaso de precipitados de NMDG HEPES aCSF preenfriado. Y deje que el cerebro se enfríe uniformemente durante aproximadamente un minuto.

Ahora, use una espátula grande para transferir el cerebro del vaso de precipitados a la placa de Petri cubierta con papel de filtro. Recorte y monte el cerebro de acuerdo con el ángulo preferido de corte y la región cerebral deseada de interés. Trabaje rápidamente para evitar la privación prolongada de oxígeno durante la manipulación.

Luego, fije el bloque cerebral al portamuestras con pegamento adhesivo. Retraiga la pieza interior del portamuestras para retirar el bloque cerebral completamente hacia adentro. A continuación, vierta la agarosa fundida directamente en el soporte hasta que el bloque cerebral esté completamente cubierto de agarosa.

A continuación, sujete el bloque de enfriamiento de accesorios preenfriado alrededor del portamuestras durante diez segundos hasta que la agarosa se haya solidificado. Inserte el portamuestras en el receptáculo de la máquina cortadora y verifique la alineación adecuada. A continuación, llene el depósito con el resto de NMDG HEPES aCSF oxigenado preenfriado del vaso de precipitados de 250 mililitros y coloque la piedra de burbujas en el depósito durante el corte durante el corte, para garantizar una oxigenación adecuada.

A continuación, ajuste el micrómetro para comenzar a avanzar el espécimen de cerebro incrustado en agarosa. Inicie la cortadora y ajuste empíricamente la velocidad de avance y la frecuencia de oscilación al nivel deseado. Continúe avanzando y cortando el tejido en incrementos de 300 micrómetros hasta que la región del cerebro de interés esté completamente seccionada.

El tiempo total para el procedimiento de corte debe ser inferior a 15 minutos. Para la recuperación inicial de NMDG. Una vez finalizado el procedimiento de seccionamiento, recoja todas las rodajas con una pipeta de plástico para pastos recortada y transfiérelas a una cámara de recuperación a 34 grados centígrados llena de 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF.

El momento de la recuperación aguda del corte cerebral es muy importante para poder lograr un equilibrio entre la preservación morfológica y la recuperación funcional de las propiedades electrofisiológicas de cada neurona. Después de determinar el programa óptimo de aumento de sodio, de acuerdo con la edad del ratón, lleve a cabo el procedimiento de aumento de sodio del Paso Y agregando los volúmenes indicados de solución de pico de sodio en los momentos indicados. Agregue la solución de pico de sodio directamente en la chimenea del burbujeador de la cámara de recuperación inicial para facilitar la mezcla rápida.

El programa de aumento de sodio que se proporcionó con una variedad de diferentes rangos de edad es un muy buen punto de partida. Pero debe optimizarse y utilizarse para su propio diseño experimental específico. A continuación, transfiera todas las lonchas a la cámara de retención a largo plazo HEPES aCSF mantenida a temperatura ambiente.

Deje que los cortes se recuperen durante otra hora en la cámara de retención HEPES antes de los experimentos de registro de pinzas de parche. Aquí se muestran las imágenes representativas de IR DIC que se adquirieron de diversas regiones del cerebro y cortes agudos de un ratón de tres meses de edad para la evaluación de la preservación morfológica de las neuronas. Los resultados que se muestran aquí provienen del uso del método de corte protector NMDG de control sin un paso de recuperación protectora.

Mientras que estos resultados provienen del método optimizado de recuperación protectora NMDG. En general, se observa una mejora en la preservación neuronal con el método optimizado de recuperación protectora NMDG. Se comparó el método optimizado de recuperación protectora de NMDG con un procedimiento de aumento gradual de sodio con el método original de recuperación protectora de NMDG.

El tiempo promedio para la formación del sello GigaOhm y el registro de la pinza del parche se redujo drástica y significativamente cuando se aplicó el procedimiento de pico gradual de sodio junto con el paso de recuperación protectora NMDG. La preservación mejorada de las neuronas lograda con este método de corte de cerebro facilita aplicaciones experimentales desafiantes que incluyen, entre otras, la electrofisiología de la pinza de parche de múltiples electrodos para sondear la conectividad sináptica local. Como se ha demostrado aquí, el uso de cortes de cerebro neocortical ex vevo humanos adultos derivados de la neurocirugía.

Al ver este video, los científicos deberían tener una buena comprensión sobre cómo implementar nuestro método optimizado de recuperación protectora NMDG, incluido el nuevo procedimiento de pico de sodio que hemos descrito, para preparar cortes de cerebro que sean adecuados para grabaciones de pinzas de parche. Por lo tanto, después de dominar este protocolo, debería ser posible completar el procedimiento de corte de cerebro en menos de una hora cada día. Y debería producir cortes de cerebro reproducibles de alta calidad y funcionará para animales de prácticamente cualquier edad.

Por lo tanto, este procedimiento, este método puede ayudar a preparar cortes de cerebro que sean adecuados para abordar preguntas sobre la función cerebral utilizando técnicas como la electrofisiología, las imágenes ópticas en vivo y la optogenética, los ensayos de tráfico de receptores y otros tipos de ensayos funcionales para explorar la función de los tipos de células cerebrales. Por lo tanto, esta técnica también es útil porque ayudará a los investigadores a poder sondear funcionalmente diferentes regiones del cerebro, incluidas regiones del cerebro que tradicionalmente no son susceptibles de registro de parches de animales adultos en cortes de cerebro.