A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

El objetivo general de este procedimiento es observar la respuesta terapéutica contra el cáncer en células individuales en cultivo. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, incluyendo la respuesta terapéutica heterogénea y el destino celular. Para comenzar, bajo una campana de flujo laminar estéril certificada, prepare las células HT1080 en placas certificadas para cultivo celular según el protocolo descrito y incube las células en una incubadora de cultivo celular humificada.

Dos días antes de la adquisición de imágenes, siembre 50.000 células HT1080 FuGENE por pocillo en el número deseado de pocillos de un plato de 12 pocillos con fondo de vidrio no. 1,5. Ajuste el número de células sembradas según su tasa de crecimiento y el plato utilizado para alcanzar aproximadamente un 60 % de confluencia al inicio del experimento.

Configure la cámara ambiental a aproximadamente 80 % de humedad con la temperatura en la posición de la muestra ajustada a 37 grados Celsius. Asegúrese de que el depósito de agua esté lleno con agua destilada estéril siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego encienda la cámara ambiental y ajústela a la temperatura deseada, colóquela en la platina del microscopio y realice la configuración.

Si hay espacio libre entre la cámara superior de la platina y el inserto de la platina, coloque trozos de película de parafina sobre los bordes de la abertura del inserto de la platina antes de insertar la cámara en él, para acoplar la cámara a la platina. Asegúrese de que ninguna conexión esté tirando de la cámara, ya que ambos factores pueden introducir artefactos de movimiento. Inserte un recipiente simulado con agua en la cámara y permita que la cámara se equilibre a 37 grados Celsius, luego mantenga una temperatura estable.

Para prepararse para la obtención de imágenes, encienda el microscopio, la computadora y todos los periféricos necesarios. Dependiendo de la fuente de luz, espere a encenderla hasta que sea necesaria. Con la torreta de objetivos en una posición baja, seleccione el objetivo de 20x con una apertura numérica de 0,7.

Luego, coloque la muestra sobre el objetivo, lo que facilitará encontrar las células cuando la muestra esté en la cámara. Después de transferir las células que se van a observar a la cámara ambiental, según el protocolo descrito, selle la cámara para mantener un entorno estable y encienda el gas atmosférico. A continuación, seleccione condiciones de adquisición de imágenes que prevengan la fototoxicidad limitando los tiempos de exposición y utilizando luz de menor intensidad.

Para encontrar los planos X, Y y Z y las longitudes de onda deseadas para cada posición que se va a imaginar. Para lapsos de tiempo prolongados de la mayoría de los procesos celulares, adquiera una imagen cada diez a veinte minutos. Una mayor resolución temporal proporciona más puntos de datos y un seguimiento celular más robusto, pero resulta en una exposición acumulada mayor a la luz y conjuntos de datos más grandes.

Dado que las HT1080 FuGENE tienen proteínas fluorescentes verdes y rojas dinámicas, utilice los siguientes tiempos de exposición y emplee una binarización de dos por dos. En la configuración avanzada, active el enfoque automático controlado por software utilizando los ajustes predeterminados. Defina un rango de enfoque automático de 10 micrómetros con el tamaño de paso recomendado.

En el cultivo experimental, para reducir la deriva térmica, reemplace la mitad del medio por medio que contenga el fármaco deseado previamente calentado a 37 grados Celsius. Finalmente, inicie la adquisición de imágenes con lapse de tiempo según el protocolo descrito en el texto. Estas películas muestran ejemplos de un par de líneas celulares de cáncer de mama MCF7 emparejadas que difieren únicamente en su estado de p53, las cuales fueron tratadas con un fármaco anticancerígeno que inhibe la quinesina-5, provocando así una detención mitótica.

Como se observa en esta figura, cuando se elimina p53 mediante una inhibición estable de p53, en lugar de detenerse después de salir de la mitosis, las células pasan por ciclos repetidos en los que entran en una segunda ronda de mitosis en vez de detenerse, y abandonan la mitosis sin división. Aquí se muestran células de carcinoma cervical Hela derivadas que expresan establemente el marcador de cromatina Histona 2b fusionado a mCherry y la beta tubulina fusionada a EGFP. Cuando se tratan con el fármaco estabilizador de microtúbulos paclitaxel, la alineación y segregación cromosómica se interrumpe durante la mitosis, lo que resulta en la formación de protuberancias nucleares y micronúcleos que son propensos al daño del ADN.

Esta línea celular expresa establemente los dos indicadores fluorescentes de ciclo celular basados en ubiquitina para CDT1, en naranja, y geminina en verde, y avanza normalmente a través del ciclo celular. Cuando las mismas células se tratan con el inhibidor de CDK46, las células progresan a través de la fase G2 y se dividen normalmente, luego se detienen fuertemente en la fase G1, lo que indica el potencial de efectos citostáticos efectivos en tumores en crecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que se puede seguir directamente, en tiempo real y durante varios días, la respuesta de una sola célula, en lugar de inferir dichas respuestas.