Name: A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprende a realizar microscopía de lapso de tiempo para rastrear respuestas terapéuticas en células individuales de cáncer. Este método permite observar en tiempo real la heterogeneidad celular y el destino de las células tratadas.

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Agradecemos a Joshua Marcus por su apoyo técnico y a Jolien Tyler, Ph.D., Directora del Centro de Microscopía Óptica Richard J. McIntosh, por su asesoramiento técnico. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Colorado Boulder y la Escuela de Graduados de la Universidad de Colorado Boulder para J.D.O. R.T.B. está parcialmente respaldado por una beca de formación predoctoral de los NIH (T32 GM008759). Agradecemos a Karyopharm Therapeutics, Inc. por el selinexor y a Merck Serono por el inhibidor de la kinesina-5. Los plásmidos FUCCI proceden de Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japón) a través de MTA. mCherry-BP1-2 era de Addgene. HeLa que expresa H2b-mCherry y β-tubulina-EGFP son de Daniel Gerlich (IMBA, Academia Austriaca de Ciencias, Austria).

El siguiente protocolo utiliza los parámetros definidos por los experimentos en las Figuras 4 y 6 ajustes de adquisición con respecto a y las condiciones experimentales. Muchos de estos parámetros pueden ser modificados para adaptarse a otros experimentos (es decir, los tiempos de exposición, de agrupación, canales fluorescentes, etc.). Todos los procedimientos deben cumplir con las directrices y normas institucionales y ser aprobados por el comité institucional de bioseguridad. sitios web de fabricantes microscopio contienen información relevante para imágenes de células vivas. 1. Los microscopios y software de imágenes <ol><li> Realizar imágenes de células vivas en una amplia variedad de microscopios invertidos. Los microscopios más comunes son de campo amplio de epifluorescencia y confocal de hilado-disco. A continuación, utilizar un microscopio automatizado y motorizado de campo amplio de epifluorescencia con fuente de luz de haluro metálico de 200 vatios. </li><li> Obtener una etapa superior o un microscopio cámara ambiental. A continuación, utilice una etapa-tcámara ambiental op. </li><li> Utilizar software comercial para operar microscopios con utilidades para ejecutar la microscopía de lapso de tiempo. </li><li> Utilice el software ImageJ o disponible en el mercado para el análisis de imágenes. Muchas otras herramientas de análisis están disponibles comercialmente, y hay programas hechos a la medida muchos de los cuales han sido publicados 8,18. </li></ol> 2. La visualización de procesos celulares y respuestas fenotípicas <ol><li> Visualizar las células con microscopía de campo claro. Diferencial de contraste de interferencia y contraste de fases por sí solo puede ser muy informativo para estudiar las respuestas a las respuestas de drogas contra el cáncer. Estos procesos pueden incluir la mitosis, la motilidad celular y la apoptosis. </li><li> Visualizar las estructuras celulares, orgánulos y procesos con biosensores fluorescentes. Las sondas fluorescentes son informativos en el seguimiento de los procesos subcelulares específicos. Estos pueden incluir la dinámica de los microtúbulos, y la dinámica mitocondrial del retículo endoplásmico, la acumulación de proteínas y localización, yseñalización molecular (por ejemplo., fosforilación, calcio). </li></ol> 3. Preparación de las muestras <ol><li> Se cultivan las células en placas de certificados de cultivo de células en un estándar, incubadora de cultivo celular humidificado (por ejemplo, 37 ° C, 5% de CO 2, 80% de humedad relativa). <ol><li> Se cultivan las células HT1080 en MEM con EBSS. Suplemento a los medios con 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v piruvato / v de sodio y 1% v / v aminoácidos no esenciales. </li></ol></li><li> Dos días antes de la imagen, las células HT1080 placa de 50,000 Fucci en 3 pocillos de una placa inferior # 1.5 vidrio de 12 pocillos en una campana de flujo laminar estéril certificado. Ajustar el número de células sembradas para lograr ~ 60% de confluencia para el inicio del experimento. Dependiendo de la línea celular y la naturaleza del experimento, la densidad de las células puede ser menor. Nota: La densidad celular puede tener profunda influencia en el crecimiento de la línea celular y en los resultados experimentales. Contar las células para minimizar experimento a experimento variability debido a la densidad. <ol><li> Dependiendo de la cámara ambiental y las condiciones necesarias para el experimento, las células de la placa en platos individuales pocillos (típicamente de 35 o 60 mm), 4 bien placas de 35 mm, 6, placas de cultivo celular de 12 o 24 pocillos, o cubreobjetos diapositivas en varios formatos. Utilice placas con fondo de vidrio con vidrio # 1.5 como la mayoría de las lentes del objetivo están optimizados para este grosor del vidrio, y la imagen a través del plástico de cultivo de células es muy pobre. Nota: Algunas líneas de células no crecen y sobreviven en el vidrio. En estos casos, el vidrio se puede recubrir con el fin de mejorar la adherencia de células (por ejemplo., Poli-lisina o colágeno). Algunas compañías de fabricación de plástico para cultivo celular óptica, se debe determinar empíricamente si esta es una opción viable. </li></ol></li></ol> 4. Cámara Ambiental Set-up <ol><li> Antes de cualquier experimentación, la configuración de la cámara del medio ambiente de manera que funcione en ~ 80% de humedad y así la temperatura en la posición de la muestra es 37 o C. Las células cultivadas crecen en la mayoría atmósfera de aire de CO2 / equilibrio 5% debido a tampón de bicarbonato de sodio en el medio. Dependiendo de la configuración, o bien configurar el controlador ambiental al 5% de CO2 y se mezclará 100% de CO 2 con el aire, o el uso de pre-mezclado, certificado de gas de aire 5% de CO 2 / equilibrio. Siga las instrucciones del fabricante para caudales de gas. Nota: Algunas líneas celulares crecen en CO 2 medio -independiente en cuyo caso se pueden mantener sin CO 2. medios de formación de imágenes Específicamente diseñado también está disponible que limita la adición de compuestos autofluorescentes. El crecimiento en las tesis medios para el tipo celular deseado debe ser determinado empíricamente de antemano. </li><li> Antes de las imágenes, asegúrese de que se llene el depósito de agua (siguiendo las instrucciones del fabricante) con agua destilada estéril. Encienda la cámara ambiental a la temperatura deseada y colocarlo en el recuadro platina del microscopio. Para ahorrar combustible, no arranque el flujo en este momento. Nota: Si hay algún espacio libre entre la cámara de etapa-top y la inserción fase y / o cualquier tipo de tensión en los cables de conexión a la cámara puede introducir artefactos de movimiento en el experimento. <ol><li> Ponga los pedazos de lámina de parafina sobre los bordes de la abertura de inserción etapa antes de insertar la cámara en él para acoplar la cámara al escenario, y asegúrese de que no hay conexiones están tirando de la cámara. </li></ol></li><li> Deje que la cámara se equilibre a 37 ° C. Mantener una temperatura estable para evitar las fluctuaciones de temperatura durante la formación de imágenes que pueden afectar a la fisiología celular e introducir la deriva. Alcanzar equilibrado de la temperatura requiere típicamente 30 min a 1 hr, dependiendo del medio ambiente. <ol><li> Inserte un plato &quot;maniquí&quot; con el agua en los pozos en la cámara mientras se calienta. Un plato lleno de imágenes imita la muestra de agua, para ayudar a garantizar que la cámara se caliente lo suficiente y se estabilizó. Llenar la cámara con agua estéril pre-calentadoreduce el tiempo necesario para estabilización de la temperatura y reduce al mínimo la disminución de temperatura tras la adición de la muestra experimental. </li></ol></li></ol> 5. Microscopio Set-up <ol><li> Encienda el microscopio, equipo asociado, y los periféricos necesarios. <ol><li> Dependiendo de la fuente de luz, esperar a encenderlo hasta que sea necesario (por ejemplo., LED). </li></ol></li><li> Con el objetivo de torreta en una posición baja, seleccionar el 20X 0,7 NA objetivo de ser utilizado. </li><li> Coloque la muestra sobre el objetivo - esto hará que sea más fácil encontrar las células cuando la muestra está en la cámara. </li><li> Definir los parámetros de imagen en este momento si se conocen a partir de los experimentos anteriores. </li></ol> 6. El transporte de las células al microscopio y en la Cámara <ol><li> Transportar a las células para obtener imágenes de la incubadora a la cámara ambiental. Asegúrese de que esto se hace rápidamente para limitar los efectos de una comparativamente baja de CO 2 </sub&gt; ambiente y la disminución de la temperatura en las células. Siga todas las normas de bioseguridad institucionales para el transporte de muestras y de limpieza en caso de un derrame. <ol><li> Colocar las células en un recipiente de espuma de poliestireno sellado o bolsa de aislamiento para evitar grandes cambios ambientales. </li></ol></li><li> Inserte el plato de formación de imágenes de la muestra en la cámara siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Después de que las células se han fijado dentro de la cámara ambiental, sellar la cámara para mantener un ambiente estable y gire inmediatamente a la fuente (s) de gas atmosférico. <ol><li> Como algunas cámaras ambientales no utilizan un apretado, tapa sellada, para retardar la evaporación, la capa estéril, aceite mineral embrión certificado en la parte superior del medio de crecimiento. Plástico para envolver de parafina de gas-permeable alrededor del perímetro bordes del plato de la muestra con cuidado de no obstruir el área de imagen de vidrio. , métodos de humidificación secundarias localizadas se pueden emplear. Condensación en la tapa de la placa de la muestra puede disminuir perforMance microscopía de campo claro de. </li></ol></li><li> Con el fin de minimizar los efectos de la deriva térmica temprano durante el experimento, espere 30 min antes de iniciar el lapso de tiempo. El tiempo requerido varía según el tamaño del plato de imagen y otros factores. Determinar empíricamente. </li></ol> 7. Configuración de la Imagen <ol><li> Seleccione las condiciones de imagen que mejor representan los datos. Tome precauciones para evitar la fototoxicidad mediante la limitación de los tiempos de exposición, utilizando menor intensidad de la luz y la selección de sondas que son excitados por longitudes de onda más largas de la luz. </li><li> Definir x, y y z del plano y la longitud de onda deseada (s) para cada posición a explorar. La resolución de tiempo está limitado por el número de posiciones y longitudes de onda. Para largo plazo de lapso de tiempo de la mayoría de los procesos celulares, adquiere una imagen cada 10 - 20 minutos; mayor resolución temporal (intervalos cortos, por ejemplo., 1 min) ofrece más puntos de datos y, por tanto, más robusto de seguimiento celular, sino que también se traduce en más integradoexposición a la luz y grandes conjuntos de datos. <ol><li> Como HT1080 FUCCI tiene proteínas fluorescentes verdes y rojos dinámicos (ver resultados representativos), utilice los siguientes tiempos de exposición: FITC / GFP - 50 ms, Texas Red / TRITC - 40 ms, 20 ms - campo claro. Utilice una bandeja de 2 x 2. </li></ol></li><li> Habilitar el enfoque automático controlado por software utilizando los parámetros por defecto en la configuración avanzada. Definir un rango de enfoque automático de 10 m con el tamaño de paso recomendado. Asegúrese de hacer esto antes de iniciar el lapso de tiempo. El enfoque automático con imágenes de campo claro y nunca con fluorescencia para reducir la fototoxicidad y photobleaching. <ol><li> Utilizar sistemas de autoenfoque controlados por software en cualquier microscopio con una platina motorizada, y centrarse directamente en la muestra. Sin embargo, pueden limitar la velocidad de adquisición del experimento. Hardware controlado sistemas de enfoque continuo funcionan bien para la microscopía de lapso de tiempo y mejorar la velocidad, lo que permite más posiciones para formar una imagen o una mayor tasa de adquisición. Sin embargo,dependen de la detección de la interfaz aire-vidrio y puede perder el enfoque de la muestra con las variaciones en el espesor del vidrio a través del pozo. </li></ol></li><li> Vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con los medios de comunicación que contiene la concentración de fármaco deseada que se ha calentado a 37 ° C. El reemplazo parcial de comunicación ayuda a reducir la deriva térmica. Las condiciones de este experimento son de vehículo (DMSO), 1 selinexor M y 10 M PD0332991. Nota: Este paso también se puede hacer después de comenzar la adquisición por una pausa y reiniciar el experimento. Esto permite el seguimiento longitudinal de las respuestas antes y después de la droga de células individuales. Si la estabilidad del fármaco o el metabolismo es una preocupación, haciendo una pausa y la sustitución de los medios de comunicación se puede hacer con el mismo método. Para la prueba de degradación del fármaco o el metabolismo, medios de células tratadas también se pueden colocar en las células naïve a probar la acción del fármaco. </li><li> Iniciar el lapso de tiempo. </li><li> A medida que el lapso de tiempo se ejecuta, asegúrese de que los campos fotografiados permanecen en el enfoque y la chamber mantiene una humedad de 37 ° C <ol><li> Ajuste el enfoque según sea necesario, tras interrumpir la adquisición durante el intervalo de tiempo entre los puntos de tiempo. </li></ol></li><li> Si es necesario, añadir agua a la cámara durante los experimentos más largos. Evitar el enfriamiento de la cámara mediante la adición de pre-calentado, agua destilada estéril a 37 ° C. </li></ol> 8. Poner fin al lapso de tiempo <ol><li> Cuando el experimento se ejecuta hasta que finaliza, detener la adquisición si no se ha configurado para detener automáticamente. </li><li> Asegúrese de que el lapso de tiempo se ha guardado correctamente en el disco duro, aunque la mayoría de los paquetes de software se guardan automáticamente durante la adquisición si no ha terminado correctamente los datos se pueden perder. </li><li> Retire la cámara del microscopio y disponer de las células en los residuos biológicos peligrosos siguiendo los procedimientos de bioseguridad institucional aprobados. </li></ol> 9. Seguimiento longitudinal y Análisis de Datos por lapsos de tiempo <ol><li> Elegir la metodología para el análisis de que esapropiarse de los procesos biológicos de interés. Muchos plugins para ImageJ, programas utilizando MATLAB, y plataformas personalizadas se han producido para aplicaciones específicas. La siguiente metodología abarca el seguimiento de los núcleos y el análisis de sondas fluorescentes nucleares como se demuestra en las Figuras 4 y 5. </li><li> Abrir las pilas de imágenes .tif para los canales utilizados en ImageJ. Asimismo, los archivos nativos abiertos desde el programa de captura directamente en ImageJ usando el plugin Bioformats. </li><li> Dibuje una región de interés (ROI) dentro del núcleo de una célula utilizando la imagen de campo claro o el canal del sello Nuclear (si se utiliza) y añadirlo a la gerente de retorno de la inversión. Nota: Si las células fotografiadas tienen una etiqueta nuclear (por ejemplo, la histona H2B-EGFP.), A continuación, el seguimiento automático de células puede ser utilizado para crear las regiones de interés (ROI) que representa los núcleos individuales a través del tiempo. </li><li> Continúe con el siguiente punto en el tiempo y la posición del retorno de la inversión dentro de la misma nucleus. Añadir el retorno de la inversión con el gerente retorno de la inversión. </li><li> Continuar para realizar un seguimiento y hacer ROIs para la célula individual hasta que haya un evento celular (mitosis, apoptosis, etc.) O de la célula ya no se puede seguir (es decir., Se mueve fuera de marco o termina el experimento). </li><li> Cuando se han establecido ROIs para las células a través del tiempo que están en el campo, superponerlos en los canales fluorescentes de interés. Medir la intensidad media de la fluorescencia en cada canal para cada punto de tiempo. Guardar la lista de retorno de la inversión para su uso posterior. <ol><li> Varias mediciones se pueden realizar dentro de la ROI para aplicaciones en diferentes experimentos. Haga clic en Análisis → Set Medidas ... para que aparezca un menú para elegir el método analítico (por ejemplo., La intensidad media en el retorno de la inversión, la intensidad integrada, etc.). </li></ol></li><li> Nota destinos celulares de células individuales (por ejemplo., La apoptosis, la división, mientras que el seguimiento de supervivencia). Esto permite la creación de curvas de supervivencia y furtheanálisis de la población r. </li><li> Con la intensidad media para ambos canales, crear un gráfico de dispersión para mostrar la dinámica del ciclo celular en respuesta a la terapéutica (Figura 5B, C). Nota: Las parcelas pueden ser creadas para las células individuales en el tiempo o de media sobre una población de células de orugas. formación de imágenes cuantitativa puede ser crítica para el establecimiento de respuestas complejas y relaciones de células en respuesta a la terapéutica del cáncer. A largo plazo la microscopía de lapso de tiempo, el seguimiento longitudinal y análisis de datos es un proceso de múltiples pasos, con muchas opciones para el tipo de herramientas de microscopía y análisis, y sigue el esquema general proporcionado en la Figura 1. </li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Ventajas de la microscopía de lapso de tiempo y Seguimiento Longitudinal El microscopio es un instrumento ideal para los estudios longitudinales de respuesta a los fármacos, ya que permite a los investigadores rastrear las células individuales y sus destinos, así como a toda la población. La variabilidad en la respuesta a los fármacos dentro de una población de células es un problema importante para el diseño terapéutica contra el cáncer. seguimiento longitudinal de células ...

La microscopía de células vivas y el seguimiento longitudinal de las células individuales no es una técnica nueva. Desde los primeros microscopios, los aficionados y los científicos han observado y estudiado las células individuales y organismos, sus comportamientos y desarrollo 1-3. Un ejemplo famoso de la tarde David Rogers de la Universidad de Vanderbilt, en la década de 1950 muestra una neutrófilos humanos en un frotis de sangre persiguiendo una bacteria Staphylococcus aureus y, finalmente, el proceso de fagocitosis 4. Esta película en vivo de células es un excelente ejemplo de cómo los procesos se pueden observar múltiples y correlacionada en un solo experimento: detección de un gradiente químico, la mecánica y la velocidad de la motilidad celular, célula da forma a la dinámica, la adherencia y la fagocitosis de un patógeno. El advenimiento de los microscopios totalmente automatizados y cámaras digitales de alta sensibilidad se ha traducido en un número cada vez mayor de investigadores usando microscopía de hacer preguntas fundamentales de la biología celular que van from cómo las células se mueven 5,6 y 7,8 dividen a orgánulos dinámica y el tráfico de membrana 9-11. No fluorescente, la microscopía de campo claro, incluyendo contraste de fase (PC), que obtuvo el Premio Nobel de Frits Zernike en 1953, y el contraste de interferencia diferencial (DIC) permitir la observación de células y núcleos sino también las estructuras subcelulares incluyendo haces de microtúbulos , cromosomas, nucleolos, la dinámica de los orgánulos, y fibras de actina gruesas 12. Genéticamente codificada proteínas fluorescentes y el desarrollo de los tintes fluorescentes contra orgánulos han repercutido notablemente en la microscopía de lapso de tiempo 13-15. Aunque no es el foco de este artículo, las imágenes en esferoides celulares e in situ (microscopía intravital) utilizando confocal y microscopía multifotónica representan otra expansión del enfoque, y hay artículos en circulación que usan y discutir estos enfoques 16-19. Las respuestas de las células a la lucha contra la cancmedicamentos er o productos naturales se determinan en la escala molecular y celular. Comprensión de las respuestas celulares y los destinos después del tratamiento a menudo implica población ensayos de promedio (por ejemplo., Inmunotransferencia, medidas integrales así), o los puntos de tiempo fijos con la detección de inmunofluorescencia y citometría de flujo, que miden las células individuales. La heterogeneidad en las respuestas de células individuales a los fármacos dentro de una población, en particular en los tumores, puede explicar algunas de la variabilidad en la respuesta visto a través de las líneas celulares y los tumores que se tratan con el mismo fármaco a saturación. A largo plazo enfoques longitudinales para seguir una sola célula dada o una población de células es un enfoque menos común, pero muy poderosa que permite el estudio directo de las vías de respuesta moleculares, diferentes fenotipos (por ejemplo., La muerte celular o la división celular), la observación de la variabilidad de célula a célula dentro de una población, y cómo estos factores contribuyen a la dinámica de respuesta de la población de 20-22. Con optimismo, pudiendopara observar y cuantificar las respuestas de células individuales ayudará a mejorar nuestra comprensión de cómo funcionan las drogas, ¿por qué a veces no, y cómo utilizarlos mejor de ellos. La técnica de microscopía de largo plazo de lapso de tiempo, el seguimiento longitudinal, y el análisis de las respuestas de drogas está disponible para muchos investigadores y puede ser simple, utilizando únicamente la luz transmitida para observar las respuestas fenotípicas 20,21. Los principales componentes del enfoque incluyen: preparación adecuada de las células de interés, un microscopio automatizado con cámara ambiental, una cámara integrada con un ordenador para adquirir y almacenar las imágenes, y software para revisar el lapso de tiempo y medir y analizar las células y cualquier biosensores fluorescentes. Proporcionamos un protocolo detallado con muchos consejos para llevar a cabo la microscopía de lapso de tiempo de las células cultivadas durante el tiempo que el uso de varios días de campo claro y / o microscopía de epifluorescencia de campo amplio. Este protocolo se puede utilizar para cualquier línea celular que se puede cultivar en cultivopara estudiar sus respuestas a las terapias contra el cáncer. Proporcionamos ejemplos de datos adquiridos y analizados mediante múltiples diferentes biosensores fluorescentes codificadas genéticamente y un ejemplo de la microscopía de contraste de fase, discutir brevemente los diferentes tipos de sondas, las ventajas y desventajas de largo plazo de lapso de tiempo y el seguimiento longitudinal, lo que puede ser aprendido de este enfoque que es difícil de entender desde enfoques no directos, y algunas variaciones que esperamos que sea de interés y utilidad para los investigadores sin experiencia que no han considerado el uso del enfoque, y para los investigadores experimentados.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>fármaco estabilizador de microtúbulos</td></tr><tr><td>Etopósido</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>inhibidor de la topoisomerasa II</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1 inhibidor, regalo</td></tr><tr><td>Inhibidor de kinesina-5</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>regalo, también disponible en American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento celular</td><td>HyClone (Fisher) o Mediatech</td><td></td><td>muchas empresas disponibles</td></tr><tr><td>5% CO2/aire de equilibrio, certificado</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plato, fondo de vidrio de 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>muchas empresas disponibles</td></tr><tr><td>Plato de 35 mm y 4 pocillos, fondo de vidrio de 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>muchas empresas disponibles</td></tr><tr><td>Plato de 35 mm, fondo de vidrio cuadriculado</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>muchas empresas disponibles</td></tr><tr><td>Multipocillo, fondo de vidrio</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>muchas empresas disponibles</td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia invertida Olympus IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB</td><td>controlador Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III etapa motorizada</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV cámara</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. Unidad de control ambiental HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD con controlador</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td></td></tr> lanzamiento <tr><td>láser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA motor de luz</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT cámara de aglomeración</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

a través del espejo: microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el estudio de la terapéutica contra el cáncer

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

La respuesta de las células individuales a los medicamentos contra el cáncer contribuye de manera significativa en la determinación de la respuesta de la población, y por lo tanto es un factor contribuyente importante en el resultado global. Inmunotransferencia, citometría de flujo y experimentos con células fijas se utiliza a menudo para estudiar cómo las células responden a los fármacos contra el cáncer. Estos métodos son importantes, pero tienen varias deficiencias. La variabilidad en las respuestas de drogas entre el cáncer y las células normales, y entre las células del cáncer de origen diferente, y transitoria y respuestas raras son difíciles de entender utilizando ensayos de promedio de la población y sin ser capaz de rastrear y analizar longitudinalmente directamente. El microscopio está particularmente bien adaptado a las células de imágenes en vivo. Los avances en la tecnología nos permiten rutinariamente celdas de imagen a una resolución que permite no sólo el seguimiento de celda, sino también de la observación de una variedad de respuestas celulares. Se describe un enfoque en el detalle que permite la formación de imágenes continua de lapso de tiempo delas células durante la respuesta a los fármacos para la esencia tanto como se desee, típicamente hasta 96 horas. El uso de variaciones del enfoque, las células pueden ser monitorizados por semana. Con el empleo de biosensores fluorescentes genéticamente codificados procesos numerosas vías, y las respuestas pueden ser seguidos. Mostramos ejemplos que incluyen el seguimiento y la cuantificación del crecimiento celular y la progresión del ciclo celular, dinámica de los cromosomas, daño en el ADN, y la muerte celular. También se discuten las variaciones de la técnica y su flexibilidad, y poner de relieve algunos errores comunes.

A largo plazo la microscopía de lapso de tiempo y el seguimiento longitudinal directa permite el estudio de muchos efectos contra el cáncer durante la respuesta a los fármacos. Siguiendo el esquema general en la Figura 1, múltiples ejemplos de células se muestran expresión de reporteros fluorescentes validados que trata con fármacos anti-cáncer, orugas, y se analizaron usando diferentes enfoques. Fase microsco...

Aquí, describimos un método de microscopía de lapso de tiempo a largo plazo para rastrear longitudinalmente células individuales en respuesta a terapias contra el cáncer.

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la respuesta terapéutica contra el cáncer en células individuales en cultivo. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, incluyendo la respuesta terapéutica heterogénea y el destino celular. Para comenzar, bajo una campana de flujo laminar estéril certificada, prepare las células HT1080 en placas certificadas para cultivo celular según el protocolo descrito y incube las células en una incubadora de cultivo celular humificada.Dos días antes de la adquisición de imágenes, siembre 50.000 células HT1080 FuGENE por pocillo en el número deseado de pocillos de un plato de 12 pocillos con fondo de vidrio no. 1,5. Ajuste el número de células sembradas según su tasa de crecimiento y el plato utilizado para alcanzar aproximadamente un 60 % de confluencia al inicio del experimento.Configure la cámara ambiental a aproximadamente 80 % de humedad con la temperatura en la posición de la muestra ajustada a 37 grados Celsius. Asegúrese de que el depósito de agua esté lleno con agua destilada estéril siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego encienda la cámara ambiental y ajústela a la temperatura deseada, colóquela en la platina del microscopio y realice la configuración.Si hay espacio libre entre la cámara superior de la platina y el inserto de la platina, coloque trozos de película de parafina sobre los bordes de la abertura del inserto de la platina antes de insertar la cámara en él, para acoplar la cámara a la platina. Asegúrese de que ninguna conexión esté tirando de la cámara, ya que ambos factores pueden introducir artefactos de movimiento. Inserte un recipiente simulado con agua en la cámara y permita que la cámara se equilibre a 37 grados Celsius, luego mantenga una temperatura estable.Para prepararse para la obtención de imágenes, encienda el microscopio, la computadora y todos los periféricos necesarios. Dependiendo de la fuente de luz, espere a encenderla hasta que sea necesaria. Con la torreta de objetivos en una posición baja, seleccione el objetivo de 20x con una apertura numérica de 0,7.Luego, coloque la muestra sobre el objetivo, lo que facilitará encontrar las células cuando la muestra esté en la cámara. Después de transferir las células que se van a observar a la cámara ambiental, según el protocolo descrito, selle la cámara para mantener un entorno estable y encienda el gas atmosférico. A continuación, seleccione condiciones de adquisición de imágenes que prevengan la fototoxicidad limitando los tiempos de exposición y utilizando luz de menor intensidad.Para encontrar los planos X, Y y Z y las longitudes de onda deseadas para cada posición que se va a imaginar. Para lapsos de tiempo prolongados de la mayoría de los procesos celulares, adquiera una imagen cada diez a veinte minutos. Una mayor resolución temporal proporciona más puntos de datos y un seguimiento celular más robusto, pero resulta en una exposición acumulada mayor a la luz y conjuntos de datos más grandes.Dado que las HT1080 FuGENE tienen proteínas fluorescentes verdes y rojas dinámicas, utilice los siguientes tiempos de exposición y emplee una binarización de dos por dos. En la configuración avanzada, active el enfoque automático controlado por software utilizando los ajustes predeterminados. Defina un rango de enfoque automático de 10 micrómetros con el tamaño de paso recomendado.En el cultivo experimental, para reducir la deriva térmica, reemplace la mitad del medio por medio que contenga el fármaco deseado previamente calentado a 37 grados Celsius. Finalmente, inicie la adquisición de imágenes con lapse de tiempo según el protocolo descrito en el texto. Estas películas muestran ejemplos de un par de líneas celulares de cáncer de mama MCF7 emparejadas que difieren únicamente en su estado de p53, las cuales fueron tratadas con un fármaco anticancerígeno que inhibe la quinesina-5, provocando así una detención mitótica.Como se observa en esta figura, cuando se elimina p53 mediante una inhibición estable de p53, en lugar de detenerse después de salir de la mitosis, las células pasan por ciclos repetidos en los que entran en una segunda ronda de mitosis en vez de detenerse, y abandonan la mitosis sin división. Aquí se muestran células de carcinoma cervical Hela derivadas que expresan establemente el marcador de cromatina Histona 2b fusionado a mCherry y la beta tubulina fusionada a EGFP. Cuando se tratan con el fármaco estabilizador de microtúbulos paclitaxel, la alineación y segregación cromosómica se interrumpe durante la mitosis, lo que resulta en la formación de protuberancias nucleares y micronúcleos que son propensos al daño del ADN.Esta línea celular expresa establemente los dos indicadores fluorescentes de ciclo celular basados en ubiquitina para CDT1, en naranja, y geminina en verde, y avanza normalmente a través del ciclo celular. Cuando las mismas células se tratan con el inhibidor de CDK46, las células progresan a través de la fase G2 y se dividen normalmente, luego se detienen fuertemente en la fase G1, lo que indica el potencial de efectos citostáticos efectivos en tumores en crecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que se puede seguir directamente, en tiempo real y durante varios días, la respuesta de una sola célula, en lugar de inferir dichas respuestas.

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Medicina

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Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Este protocolo describe un método de imagen residente tumor-infiltración T CD8 células con anticuerpos fluorescente acoplados dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la migración de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.

Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

Este protocolo describe el marcaje de anticuerpo único (SAL) para resolver la organización espacial a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática. Al aprovechar las interacciones acumulativas anticuerpo-epítopo a nivel de molécula única, el SAL de membrana (mSAL) mapea las distribuciones locales de epítopos mientras captura simultáneamente el comportamiento de unión de anticuerpos en el entorno celular nativo.

Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

Aprende a realizar microscopía de lapso de tiempo para rastrear respuestas terapéuticas en células individuales de cáncer. Este método permite observar en tiempo real la heterogeneidad celular y el destino de las células tratadas.

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer (Video) | JoVE Journal

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

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