A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

El objetivo general de este procedimiento es observar la respuesta terapéutica anticancerosa en células individuales en cultivo. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, incluida la respuesta terapéutica heterogénea y el destino de las células. Para comenzar, bajo una campana de flujo laminar estéril certificada, prepare las células HT1080 en placas certificadas para cultivo de acuerdo con el protocolo de texto e incube las células en una incubadora de cultivo celular humidificada.

Dos días antes de la toma de imágenes, coloque 50.000 células HT1080 FuGENE por pocillo en el número deseado de pocillos de una placa de 12 pocillos con fondo de vidrio n.º 1,5. Ajuste el número de células plateadas en función de su tasa de crecimiento y del plato utilizado para lograr aproximadamente un 60% de confluencia para el inicio del experimento.

Configure la cámara ambiental a aproximadamente el 80% de humedad con la temperatura en la posición de la muestra establecida en 37 grados Celsius. Asegúrese de que el depósito de agua esté lleno de agua destilada estéril siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, encienda la cámara ambiental a la temperatura deseada y colóquela en la platina y el conjunto del microscopio.

Si hay algún espacio libre entre la cámara superior del escenario y el recuadro del escenario, coloque trozos de película de parafina sobre los bordes de la abertura del empotrado del escenario, antes de insertar la cámara en ella, para acoplar la cámara al escenario. Asegúrese de que no haya conexiones tirando de la cámara, ya que ambas pueden introducir artefactos de movimiento. Inserte un plato ficticio con agua en la cámara y deje que la cámara se equilibre a 37 grados centígrados y luego mantenga una temperatura estable.

Para configurar la obtención de imágenes, encienda el microscopio, la computadora y los periféricos necesarios. Dependiendo de la fuente de luz, espere para encenderlo hasta que lo necesite. Con la torreta del objetivo en una posición baja, seleccione el objetivo de apertura numérica de 20x 0,7.

A continuación, coloque la muestra sobre el objetivo, lo que facilitará la búsqueda de las células cuando la muestra esté en la cámara. Después de transferir las células que se van a visualizar a la cámara ambiental, de acuerdo con el protocolo de texto, selle la cámara para mantener un entorno estable y encienda el gas atmosférico. A continuación, seleccione las condiciones de imagen que eviten la fototoxicidad limitando los tiempos de exposición y utilizando luz de menor intensidad.

Para encontrar los planos X, Y y Z y las longitudes de onda deseadas para cada posición que se va a fotografiar. Para el lapso de tiempo a largo plazo de la mayoría de los procesos celulares, adquiera una imagen cada diez a veinte minutos. Una mayor resolución de tiempo proporciona más puntos de datos y un seguimiento de células más robusto, pero da como resultado una exposición a la luz más integrada y conjuntos de datos más grandes.

Como HT1080 FuGENE tiene proteínas florescentes verdes y rojas dinámicas, use los siguientes tiempos de exposición y use un contenedor de dos por dos. En Configuración avanzada, habilite el enfoque automático controlado por software con la configuración predeterminada. Defina un rango de enfoque automático de 10 micrómetros con el tamaño de paso recomendado.

En la placa experimental, para reducir la deriva térmica, reemplace la mitad del medio con un medio que contenga el medicamento deseado que se haya calentado a 37 grados Celsius. Finalmente, inicie el lapso de tiempo y adquiera imágenes de acuerdo con el protocolo de texto. Estas películas muestran ejemplos de un par de líneas celulares MCF7 derivadas del cáncer de mama que difieren solo en su estado de p53 y que fueron tratadas con un medicamento contra el cáncer que inhibe la kinesina-5, lo que resulta en un paro mitótico.

Como se ve en esta figura, cuando p53 es eliminado por p53 estable, en lugar de detenerse después de salir de la mitosis, las células pasan por ciclos repetidos en los que entran en una segunda ronda de mitosis en lugar de detenerse, y dejan la mitosis sin división. Aquí se muestran células Hela derivadas del carcinoma cervical que expresan de manera estable el marcador de cromatina Histone 2b fusionado con mCherry y beta tubulina fusionado con EGFP. Cuando se trata con el fármaco estabilizador de microtúbulos paclitaxol, la alineación y segregación de los cromosomas se interrumpe durante la mitosis, lo que da lugar a la formación de protuberancias nucleares y micronúcleos que son propensos a dañar el ADN.

Esta línea celular coexpresa de manera estable los dos indicadores del ciclo celular de ubiquitina florescente para CDT1, en naranja, y geminina en verde, y progresa a través del ciclo celular normalmente. Cuando las mismas células se tratan con el inhibidor de CDK46, las células progresan a través de la fase G2 y se dividen normalmente, luego se detienen fuertemente en la fase G1, lo que indica el potencial de efectos citostáticos afectivos en tumores en crecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que se puede seguir la respuesta de una sola célula, directamente, en tiempo real en el transcurso de muchos días en lugar de inferir esas respuestas.