Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los eventos dinámicos dentro del microambiente tumoral a través de microspy multifotónico intravital de alta resolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el microambiente tumoral, como qué eventos dinámicos están involucrados en la permeabilidad vascular y las interacciones multicelulares. La principal ventaja de esta técnica es que se puede observar y medir la cinética de los eventos en el microambiente tumoral.

Antes de comenzar el procedimiento, encienda todos los componentes del microscopio y del láser, incluidos los dos láseres de fotones y los detectores. Y ajuste la caja de calefacción a 30 grados centígrados para precalentar el escenario. Limpie la platina del microscopio y el inserto de la platina con etanol al 70%.

Cuando la platina esté seca, coloque una gota grande de agua sobre el objetivo del microscopio de 25 x 1,05 NA para mantener el contacto óptico con el cubreobjetos y coloque un cubreobjetos de 1,5 de grosor sobre el puerto de imagen del inserto. Luego, corta un trozo de tubo de polietileno de 30 centímetros. Coloque la almohadilla de goma encima del cubreobjetos.

Con pinzas, rompa una aguja de calibre 31 de su accesorio de plástico e inserte el extremo romo del cubo de la aguja en el tubo. Inserte y conecte una aguja de calibre 31 en el otro extremo del tubo de PE. Luego, llene una jeringa de un cc con PBS estéril y conecte la jeringa a la aguja de calibre 31.

Use el PBS para eliminar todo el aire del tubo y la aguja. Luego, una jeringa de un cc con 200 microlitros de la etiqueta vascular adecuada y otra con la proteína inyectable adecuada. Antes de comenzar la cirugía, confirme la anestesia adecuada con falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y aplique ungüentos para los ojos al ratón anestesiado.

A continuación, coloque al animal en una plataforma quirúrgica bajo una lámpara de calor para aumentar la circulación de la cola. Después de dos minutos, esterilice la cola con etanol al 70% e inserte la punta del catéter de calibre 31, de dos a tres milímetros en la vena lateral de la cola. Luego, coloque un centímetro de cinta de laboratorio en el catéter para sostener la aguja paralela a la vena a lo largo de la cola.

Una vez asegurado el catéter, frote las superficies ventral y tumoral con etanol al 70%. A continuación, levante la piel sobre el abdomen y utilice unas tijeras estériles para realizar una incisión subcutánea de aproximadamente un centímetro a lo largo de la línea media ventral del abdomen, teniendo cuidado de no perforar el peritoneo. Cortar suavemente el tejido conectivo que une la glándula mamaria y el tumor lejos del peritoneo para exponer el tumor.

Luego, con las tijeras y las pinzas, retire suavemente la fascia y la grasa de la superficie expuesta del tumor. Cuando el tumor haya sido expuesto, transfiera el ratón a la etapa de imágenes precalentadas. Use cintas de laboratorio para asegurar el cubreobjetos, luego coloque el tumor en el orificio de una almohadilla de goma que cubre el cubreobjetos sobre el objetivo del microscopio.

Cuando el animal esté en posición, llene la cámara de la almohadilla de goma con PBS para mantener el tejido hidratado y mantener el contacto óptico con el cubreobjetos. Coloque un sensor de collar de sonda de oxímetro de pulso alrededor del cuello para monitorear los signos vitales del animal y coloque la caja de calentamiento sobre el animal. Luego, use los IP del microscopio para enfocarse en las células tumorales fluorescentes en la superficie del tumor y el área localizada con vasos sanguíneos que fluyen.

Una vez que se haya seleccionado una región de interés, cambie el microscopio al modo de imagen multifotónica y use el ajustador de enfoque para mover el objetivo a la ubicación de inicio deseada. Luego, haga clic en el botón superior de la posición Z para establecer el límite superior de la serie z y visualizar la red de fibras de colágeno en la superficie del tumor en el segundo canal de generación de armónicos. A continuación, mueva el objetivo a la profundidad de imagen deseada y haga clic en el botón inferior de la posición z para establecer el límite inferior de la serie z.

A continuación, introduzca el valor deseado en los campos de tamaño de paso. A continuación, cambie al panel de lapso de tiempo e introduzca el tiempo de lapso adecuado. Una vez determinados los parámetros de imagen, se sustituyó la jeringa conectada al catéter por una jeringa de colorante de marcaje vascular y se administró lentamente un máximo de 200 microlitros de la solución de colorante, cuidando de que la solución entrara en la vena.

Después de la inyección, regrese la jeringa PBS al catéter y comience la toma de imágenes de lapso de tiempo de paso z. Una vez obtenidas todas las imágenes, sustituya la jeringa de PBS por la jeringa que contiene la proteína inyectable, teniendo cuidado de no introducir burbujas en la vía. A continuación, inyecte lentamente la suspensión de proteínas en el ratón y sustituya la jeringa por una jeringa que contenga PBS.

Los macrófagos pueden ser rastreados con 70 kilodalton y dextrano marcados con fluorescencia que se acummulan en los micrófagos fagocíticos. El doble marcaje de las células tumorales y los micrófagos permite visualizar en tiempo real la interacción directa con estos dos tipos de células. Para visualizar los cambios en la permeabilidad vascular del tumor, también se pueden usar puntos cuánticos para etiquetar el espacio vascular.

Ya que son lo suficientemente grandes como para que no se difundan fácilmente a través de los espacios interarteriales. Las imágenes continuas de alta resolución facilitan la captura de los eventos de permeabilidad vascular y la cuantificación de la cinética de la extravasación y el aclaramiento del dextrano. En este campo de visión de ejemplo, el pico de la diextravasación vacscular se observa entre los 29 y los 34 minutos, como lo demuestra la señal de TMR extra vascular.

La inyección de colorantes o proteínas vasculares adicionales para inducir la permeabilidad vascular puede proporcionar información sobre los eventos de señalización que regulan la permeabilidad vascular. De hecho, en los primeros segundos de la inyección, se pueden observar 10 kilodaltons de dextrano FITC extravasándose de la vasculatura, mientras que los 155 kilodaltons de dextrano TMR permanecen confinados al espacio vascular. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar extirpar el tejido conectivo con cuidado sin dañar la superficie del tumor y mantener la superficie del tumor hidratada. Siguiendo este procedimiento de dinámica celular, se puede visualizar dicha migración de células tumorales para responder preguntas adicionales sobre la direccionalidad de la migración de células tumorales y la intravasación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar eventos celulares dinámicos en un microambiente tumoral mediante microscopía multifotónica intervital.