Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los eventos dinámicos dentro del microambiente tumoral mediante microscopía multiphotón intravital de alta resolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el microambiente tumoral, como qué eventos dinámicos están involucrados en la permeabilidad vascular y en las interacciones multicelulares. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar y medir las cinéticas de los eventos en el microambiente tumoral.

Antes de comenzar el procedimiento, encienda todos los componentes del microscopio y del láser, incluidos los láseres de dos fotones y los detectores. Y configure la caja de calentamiento a 30 grados Celsius para precalentar la platina. Limpie la platina del microscopio y el inserto de la platina con etanol al 70 %.

Cuando la platina esté seca, coloque una gota grande de agua sobre el objetivo microscópico 25 x 1.05 NA para mantener el contacto óptico con el cubreobjetos y coloque un cubreobjetos de grosor número 1.5 sobre el puerto de imagen del inserto. A continuación, corte un trozo de tubo de polietileno de 30 centímetros de longitud. Coloque la almohadilla de goma encima del cubreobjetos.

Con pinzas, rompa una aguja de calibre 31 separándola de su adaptador de plástico e inserte el extremo romo del casquillo de la aguja en el tubo. Inserte y fije una aguja de calibre 31 en el otro extremo del tubo de polietileno. A continuación, llene una jeringa de un cc con PBS estéril y conecte la jeringa a la aguja de calibre 31.

Utilice el PBS para eliminar todo el aire de los tubos y la aguja. Luego, cargue una jeringa de un cc con 200 microlitros de la etiqueta vascular adecuada y otra con la proteína inyectable adecuada. Antes de comenzar la cirugía, confirme la anestesia adecuada mediante la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie y aplique pomada oftálmica al ratón anestesiado.

A continuación, coloque el animal sobre una plataforma quirúrgica bajo una lámpara de calor para aumentar la circulación en la cola. Después de dos minutos, esterilice la cola con etanol al 70 % e inserte la punta del catéter de calibre 31, de dos a tres milímetros dentro de la vena lateral de la cola. Luego, coloque un trozo de cinta de laboratorio de un centímetro de longitud sobre el catéter para mantener la aguja paralela a la vena a lo largo de la cola.

Una vez asegurado el catéter, limpie las superficies ventral y del tumor con etanol al 70%. A continuación, levante la piel sobre el abdomen y use tijeras estériles para realizar una incisión subcutánea de aproximadamente un centímetro a lo largo de la línea media ventral del abdomen, teniendo cuidado de evitar perforar el peritoneo. Corte suavemente el tejido conectivo que une la glándula mamaria y el tumor con el peritoneo para exponer el tumor.

Luego, utilizando las tijeras y la pinza, retire suavemente la fascia y la grasa de la superficie expuesta del tumor. Una vez que el tumor esté expuesto, transfiera el ratón a la platina de imagen precalentada. Use cinta adhesiva de laboratorio para asegurar el cubreobjetos, luego coloque el tumor en el orificio de una almohadilla de goma que cubre el cubreobjetos sobre el objetivo del microscopio.

Cuando el animal esté en posición, llene la cámara del cojín de goma con PBS para mantener el tejido hidratado y para conservar el contacto óptico con la cubeta. Coloque un sensor de collar del pulsóximetro alrededor del cuello para monitorear los signos vitales del animal y coloque la caja de calentamiento sobre el animal. Luego, utilice las IPs del microscopio para enfocar las células tumorales fluorescentes en la superficie del tumor y localizar la zona con vasos sanguíneos en flujo.

Una vez que se haya seleccionado una región de interés, cambie el microscopio al modo de imagen multiphotón y utilice el ajustador de enfoque para mover el objetivo a la ubicación inicial deseada. A continuación, haga clic en el botón superior de posición Z para establecer el límite superior de la serie z y visualice la red de fibras de colágeno en la superficie del tumor en el canal de generación de segundo armónico. Luego, mueva el objetivo a la profundidad de imagen deseada y haga clic en el botón inferior de posición z para establecer el límite inferior de la serie z.

A continuación, introduzca el valor deseado en los campos de tamaño de paso. Luego, cambie al panel de lapso de tiempo e introduzca el tiempo de retardo adecuado. Una vez que se hayan determinado los parámetros de imagen, reemplace la jeringa conectada al catéter por una jeringa con tinte para etiquetado vascular y administre lentamente un máximo de 200 microlitros de la solución de tinte, teniendo cuidado de que la solución entre en la vena.

Después de la inyección, devuelva la jeringa de PBS al catéter e inicie la adquisición de imágenes lapse temporal en el eje z. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, sustituya la jeringa de PBS por la jeringa que contiene la proteína inyectable, teniendo cuidado de no introducir burbujas en la línea. A continuación, inyecte lentamente la suspensión de proteína en el ratón y sustituya la jeringa por otra que contenga PBS.

Los macrófagos pueden rastrearse con dextrano marcado con fluorescencia de 70 kilodalton, que se acumula en los micrófagos fagocíticos. La doble marcación de las células tumorales y los micrófagos permite visualizar en tiempo real la interacción directa entre estos dos tipos celulares. Para visualizar los cambios en la permeabilidad vascular del tumor, también pueden utilizarse puntos cuánticos para marcar el espacio vascular.

Dado que son lo suficientemente grandes como para no difundirse fácilmente a través de los espacios interarteriales. La obtención continua de imágenes de alta resolución facilita la captura de eventos de permeabilidad vascular y la cuantificación de la cinética de la extravasación y eliminación del dextrano. En este ejemplo de campo de visión, se observa el pico de la doble extravasación vascular entre los 29 y 34 minutos, evidenciado por la señal de TMR extravascular.

La inyección de colorantes vasculares o proteínas adicionales para inducir permeabilidad vascular puede proporcionar información sobre los eventos de señalización que regulan la permeabilidad vascular. De hecho, en los primeros segundos tras la inyección, se puede observar que el dextrano de 10 kilodaltons marcado con FITC extravasa desde la vasculatura, mientras que el dextrano marcado con TMR de 155 kilodaltonos permanece confinado al espacio vascular. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una hora si se realiza adecuadamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar eliminar el tejido conectivo suavemente sin dañar la superficie del tumor y mantener la superficie del tumor hidratada. Tras seguir este procedimiento de dinámica celular, se puede visualizar la migración de células tumorales para responder preguntas adicionales sobre la direccionalidad de la migración celular tumoral y la intravasación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar eventos celulares dinámicos en un microambiente tumoral mediante microscopía multipotón intravital.