Name: La medición de la producción de dióxido de carbono a partir de sustratos radiomarcados en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a medir la producción de CO₂ en Drosophila melanogaster usando sustratos radiomarcados. Este método permite cuantificar la oxidación de combustibles metabólicos de forma sensible y reproducible en moscas.

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El autor agradece a los Dres. Mingjian Lu y Morris Birnbaum por sus útiles consejos y apoyo financiero del NIDDK (R21DK089391).

1. Preparación de la mosca de los alimentos que contienen radiomarcados metabólicos Sustratos <ol><li> En un tubo de microcentrífuga, mezclar 1 - 2 Ci sustrato radiomarcado (D- [6- 14 C] -glucosa, D- [1- 14 C] -glucosa o ácido -palmitic [1- 14 C], 40 - 60 mCi / mmol) con 15 l de FD &amp; C No. 1 colorante alimenticio azul y H2O para equivalen a un volumen total de 25 l. PRECAUCIÓN: Carbono-14 es un emisor beta de baja energía y tiene un corto alcance en el aire. Sin embargo, tenga cuidado para evitar que se derrame de moléculas marcadas radiactivamente o ingestión accidental por el experimentador. Volar propina frascos de comida encima fácilmente; asegúrese de alojarlos en un recipiente que pueda evitar que se vuelque, especialmente cuando radiomarcador está en forma líquida (paso 1.2) o en los alimentos no solidificada (paso 1.4). Las moscas que están siendo alimentados o que han sido alimentados con sustratos radiomarcados comenzará a exhalar pequeñas cantidades de CO 2 radiomarcado. Estas moscas deben mantenerse en cajas de acrílico en las vitrinas de gases, y un pequeño plato de KOH can puede establecer en el cuadro para su uso como un depurador de CO 2. </li><li> Pipeta de todo el sustrato radiomarcado y la mezcla azul del colorante en el fondo de un frasco vacío de alimentos mosca (altura: 9,4 cm, ancho: 2,2 cm). </li><li> estándar Heat vuela de alimentos en un horno de microondas hasta que la comida es sólo licuado (15 a 20 segundos a nivel de potencia alto para un vial que contiene 10 ml de la comida). </li><li> Añadir alimentos 975 l fundido a la / mezcla colorante azul sustrato radiomarcado y rápidamente remolino, el seguimiento de la uniformidad del color azul para asegurar una mezcla completa. </li><li> Permita que la comida se enfríe y solidifique por completo a temperatura ambiente durante 20 - 30 min. </li></ol> 2. Alimentar sustratos radiomarcados metabólico para moscas de la fruta para adultos <ol><li> Anestesie moscas adultas usando un aparato de anestesiante CO 2 que consiste en polietileno poroso fusionado a una base de acrílico y conectado a un tanque de CO 2 con un regulador de presión. El flujo de CO 2 en el aparato anestesiante a 5 L / min. <ol><li> anestesiar transferenciad vuela a viales que contienen radiomarcados, comida teñido de azul (n = 15 - 30 moscas por vial). Cap viales con tapón de espuma, y ​​descansar en posición horizontal hasta que las moscas se despiertan. viales de transferencia a un recipiente con tapa acrílica (180 cm x 180 cm x 240 cm de alto). </li></ol></li><li> Para la alimentación a corto plazo, de hambre moscas durante 18 - 24 horas antes de transferir las moscas de la comida radiomarcado para un 2 -. Etapa de alimentación de 3 h L a paso el hambre es importante porque las moscas alimentadas no comen de forma fiable una nueva fuente de alimentos que se les presentan . Para la alimentación a largo plazo en el transcurso de 5 - 7 días, las moscas no tienen por qué tener hambre, pero el experimentador debe controlar el contenido de agua del alimento radiomarcado en los viales moscas se alojan en y utilizar una aguja y una jeringa para añadir agua a viales con la comida seca. </li><li> Transferencia vuela a los alimentos sin etiqueta &quot;pulsando&quot; en un nuevo vial. Un periodo de caza inicial de 2 - 4 de hr permite moscas para limpiar las partículas de alimentos radiomarcados de sus cutículas y permite la digestión de radiomarcadored comida que queda en el intestino. Monitorear el progreso de los alimentos a través del intestino mediante inspección visual de las moscas para buscar abdómenes azules. </li><li> Posteriormente, la transferencia vuela a diferentes tipos de alimentos (12 - 24 h en la comida estándar o agar al 1% para la medición de los efectos de la alimentación frente ayunas en la respiración) o la temperatura ambiente (12 - 96 horas a 18 ° C o 30 ° C durante genética manipulaciones utilizando GAL80 sensible a la temperatura (ts GAL80), por ejemplo). Nota: La longitud de este período de caza variará con el experimento que se realiza. Por ejemplo, puede ser necesario una persecución de 96 horas a 30 ° C en experimentos utilizando GAL80 ts con el fin de activar completamente la expresión del transgen GAL4-dependiente. </li></ol> 3. Preparación del Aparato CO 2 -Recogida <ol><li> Montar materiales para la construcción de &quot;volar&quot; vainas, tubos cubiertas de malla que van a contener las moscas marcadas con ácido palmítico C-14, C-14 y la glucosa o that permanecerá abierto a la atmósfera. Cortar las 50 mm de 12 mm de tubos de polipropileno x 75 mm, dejando 25, tubos de fondo redondo mm de largo. Preparar 35 mm x 35 mm cuadrados de malla de nylon de 130 micras. También, obtener la cinta transparente en un dispensador de cinta. </li><li> Montar materiales para los aparatos de CO 2 de -collection. Para cada mosca vaina, montar un vial 20 ml de centelleo de vidrio, un tapón de la parte superior de goma con un agujero fuera del centro, un centro bien para ser insertado a través del agujero en el tapón superior, GF grado / papel de filtro de microfibra de vidrio B (2,1 cm de diámetro círculo, 1 micras de poro). papel de filtro GF / B se utiliza debido a su alta resistencia en húmedo y alta capacidad de carga. </li><li> Preparar 5% fresco KOH en el día de uso. Justo antes de la etapa 3.4, doblar y colocar el papel de filtro circular GF / B en el centro, así que se rosca a través del agujero del tapón superior de goma y saturarlo con 100 l de KOH al 5%. Consulte la Figura 1. </li><li> Después de la incubación (s) en medios sin etiqueta, unanesthetize moscas con CO 2. Cepillo vuela en el tubo de corte de polipropileno, con tapa de malla de nylon, y el uso de cinta adhesiva transparente para adherirse a la malla tubo. Trabajar con rapidez para evitar que las moscas de despertar y escapar antes de que la malla se ha fijado de forma segura al tubo. Un número igual de moscas se debe utilizar en cada vaina de la mosca para un experimento particular; 10 - 20 moscas por vaina mosca producen suficiente radiomarcado-CO 2 para la medida por recuento de centelleo (paso 4.1 a continuación). </li><li> La transferencia de la vaina de la mosca a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Se tapa el vial de vidrio con el tapón de goma que sostiene la parte superior de un centro bien que contiene un papel de filtro GF / B-saturada de KOH. Doble la parte superior de ancho de la parte superior del tapón de caucho sobre el borde del vial de centelleo de vidrio. Consulte la Figura 1. </li><li> viales de vidrio conjunto que contiene las moscas en una tapa, envase de acrílico, y se incuba durante períodos variables de tiempo (de 2 a 12 horas funciona bien). </li></ol> 4. Análisis de los resultados <ol><li> Ael final de la incubación, viales de vidrio Destape, y papel de filtro GF / B KOH saturada transferencia a un vial de centelleo de plástico de 6 ml que contenía 4 ml de cóctel de centelleo. </li><li> Si es necesario, congelar las moscas en las vainas mosca en hielo seco y almacenar a -80 ° C para la determinación posterior de los sustratos almacenados. Tenga en cuenta que estas muestras son radiactivos y deben ser almacenados en consecuencia. </li><li> Preparar viales de centelleo adicionales: uno que contiene un papel de filtro GF / B no utilizada para servir como fondo y una a dos otros que contiene 0,1 - 0,5 Ci sustrato radiomarcado para determinar cpm / Ci. </li><li> Medir cpm para cada muestra utilizando un contador de centelleo de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Calcula 14 pmol de CO 2 / cpm y 14 pmol de CO 2 por mosca por hora. Restar las cpm de fondo del valor de CPM para cada muestra. A partir de los datos de sustrato marcados radiactivamente ordenados, calcular la cpm / Ci de la muestra del fondo con corrección de contado. <ol><li> Utilizar elfabricante proporcionado por actividad específica y la concentración radioquímica del sustrato radiomarcado (por ejemplo, 50 Ci / mmol y 0,1 Ci / l, respectivamente) para calcular pmol / cpm. Utilizar este factor para convertir los datos de la mosca de la vaina antecedentes corregido de 14 cpm CO 2 / muestra a 14 pmol de CO 2 / muestra. Y se divide por el número de moscas y el número de horas en la vaina de la mosca. </li></ol></li></ol>

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El autor declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo describe un método para la medición de la oxidación de sustratos radiomarcados específicos en adultos Drosophila melanogaster. Esta técnica es sencilla, cuantitativo, reproducible y sensible, y complementa los métodos existentes que miden la producción total de CO 2 y el consumo de O 2, ya que puede ser utilizado para identificar el nutriente (s) que se oxida para la producción de ATP. Medición de CO 2 liberado de la oxidación de sustratos radiomarcados específicos utilizando el método descrito aquí es complementaria a las técnicas que miden la producción total de CO 2. Total de producción de CO 2 (V CO2) permite la estimación de la tasa metabólica y, cuando se conoce total del consumo de O 2 (V O2), la tasa metabólica puede ser calculada y la fuente de combustible para la oxidación puede ser calculada de acuerdo a la relación de intercambio respiratorio (V CO2 / O2 = V RER). Cuandohidratos de carbono son el sustrato exclusivo, RER = 1, pero cuando los ácidos grasos son la fuente exclusiva, RER = 0,7, debido a la estequiometría de las reacciones de la glucosa y la oxidación de los lípidos. A falta de equipo para medir el consumo de oxígeno en Drosophila 14, no se puede identificar la fuente de combustible oxidativo. Sin embargo, por medio del etiquetado vuela con trazas de un sustrato radiactivo u otro y las tasas de medición de radiomarcado producción de CO 2, se pueden sacar conclusiones acerca de la capacidad de las moscas para oxidar un sustrato dado en diferentes momentos a lo largo de un estímulo o sobre los efectos de una dado mutación en la oxidación de combustible. Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, se debe tener cuidado cuando se utilizan materiales radiactivos para evitar derrames y contaminación de las áreas de investigación. En segundo lugar, cuando anestesiar las moscas durante los pasos 2.1 y 3.4, el experimentador debe trabajar con rapidez para evitar los efectos de CO 2 prolongadala exposición sobre el metabolismo y el comportamiento. Un grupo de 20 moscas puede ser anestesiado y se transfiere a un nuevo vial o en una vaina de mosca en 20 seg o menos. Cuando se transfieren desde un aparato de anestesia a un vial de alimentos, el vial debe descansar en su lado para evitar que las moscas anestesiadas de conseguir pegado en la superficie del alimento. Cuando las moscas son alimentos radiomarcado alimentado a lo largo de varios días como en el paso 2.2, el experimentador debe asegurar que la comida no se seque como las moscas son sensibles a la deshidratación. El estado alimentado o en ayunas antes del marcaje, la elección de la etiqueta, la longitud de tiempo etiquetado, la longitud de tiempo en la vaina de la mosca, y el método de la anestesia son parámetros que pueden ser sometidos a la solución de problemas y la modificación utilizando esta técnica. En primer lugar, las moscas se somete a períodos cortos de etiquetado (2 - 3 h) no es probable que consumen cantidades importantes de alimentos radiomarcado a menos sometido a un periodo de ayuno de antemano. En segundo lugar, la elección del marcador cun afectar las conclusiones uno es capaz de dibujar sobre fenotipos metabólicos. Por ejemplo, radiomarcado producción de CO 2 a partir de D- [1- 14 C] -glucosa puede reflejar la oxidación a través del ciclo del ácido cítrico o la derivación de las pentosas fosfato, mientras radiomarcado producción de CO 2 de D- [6- 14 C] -glucosa refleja la oxidación a través del ciclo del ácido cítrico única 12,15,16. La alimentación de las moscas con un trazador radiomarcado para un aminoácido esencial 17,18 sería una buena estrategia para la evaluación de la oxidación de los aminoácidos derivados de proteínas. Finalmente, largos períodos de etiquetado con la glucosa radiomarcada también plantean la posibilidad de incorporación de este precursor en otras clases de moléculas, tales como los triglicéridos 19 y aminoácidos tales como alanina, que fácilmente interconvierte con piruvato. Esto se puede evaluar mediante la medición de radiactividad incorporada en estas diferentes clases de moléculas de 6. rad De hecho, las cohortes separadas de moscas pueden ser alimentadosiolabeled sustratos de la misma manera y luego se usa para los experimentos de la mosca de la vaina o la medición de radiomarcador que se almacena y se mantiene en glucógeno y triglicéridos en alimentación y de ayuno 6, por ejemplo. Otra estrategia es utilizar períodos de etiquetado corto que pueden revelar la oxidación de los nutrientes de la dieta radiomarcados sí mismos y no formas de almacenamiento de estos nutrientes. En tercer lugar, también es posible que dos grupos de moscas podrían tener tasas idénticas de 14 CO 2 producción de más de una determinada cantidad de tiempo, pero muy diferentes tasas inicialmente. Por lo tanto, la variación de la cantidad de tiempo que vuela pasar en la vaina de la mosca puede ser un parámetro importante para alterar la hora de evaluar la variación fenotípica. Por último, este protocolo exige el uso de un corto período de CO 2 anestesia cuando se ponen las moscas en el aparato mosca vaina. Es posible que los CO 2 anestesia pueden afectar la función metabólica en el transcurso del experimento mosca vaina. Una alternativa unaENFOQUE es utilizar anestesia nitrógeno que no afecta a la tasa metabólica 20. Como con cualquier técnica que mide un sistema tan complejo como la oxidación de combustible y la tasa metabólica, el método descrito aquí tiene limitaciones. En primer lugar, es posible que vuela en diferentes grupos podrían consumir diferentes cantidades de comida radiomarcado y por lo tanto se introduzca la fase de recogida de CO 2 del ensayo con diferentes cantidades de partida de sustrato. Esto puede ser controlado para, en cierta medida llevando a cabo el experimento con muestras de gran tamaño y por la alimentación de las moscas en masa. Para períodos cortos de etiquetado, moscas con agallas de color azul similares se han consumido el marcador radiactivo y se puede llevar adelante a la porción de la persecución del experimento. La cantidad de radiomarcador que queda en un grupo de moscas también puede medirse al final del experimento y en cohortes independientes de moscas después del final de la alimentación y período de caza inicial. En segundo lugar, los niveles de actividad entregrupos de moscas en las vainas de moscas pueden ser diferentes. Esto tendrá que ser determinado experimentalmente y tenido en cuenta en la interpretación de los datos. En tercer lugar, esta técnica no mide la producción total de CO 2, sólo la producción de un alimento dietético específico o la forma (s) de almacenamiento de ese nutriente. Este protocolo no es un sustituto para, sino que es complementaria a las mediciones de VCO 2, ya que proporciona información diferente y adicional. El método descrito aquí exhalado mide, CO radiomarcado 2 que es un producto de la oxidación de cantidades traza de sustratos metabólicos específicos. Mediante la variación de la etiqueta utilizada - glucosa, ácido graso, o ácido amino - uno puede diseñar experimentos cada vez más sofisticadas para evaluar las contribuciones de los diferentes sustratos a metabolismo en diferentes condiciones fisiológicas, tales como el hambre y en diferentes fondos genéticos. Las futuras aplicaciones de esta técnica incluyen la medición de metabolism en las etapas de larva y pupa de desarrollo, dos etapas del ciclo de vida de Drosophila que se caracterizan por condiciones extremas de almacenamiento de nutrientes y la descomposición, respectivamente.

El trabajo en el organismo modelo Drosophila melanogaster ha contribuido en gran medida a la comprensión de los principios genéticos, los procesos de desarrollo, el crecimiento, el envejecimiento, el comportamiento, la inmunidad y la enfermedad humana 1,2. Un sinnúmero de planteamientos biológicos genéticos y celulares en Drosophila ha impulsado el progreso en estas áreas. Sin embargo, el estudio del metabolismo en la mosca de la fruta ha desarrollado más lentamente, debido en gran parte a las dificultades en la medición de parámetros metabólicos en un animal tan pequeño. El interés en el uso de Drosophila como modelo para el estudio de enfermedades humanas tales como la diabetes y para la comprensión de la contribución del metabolismo y crecimiento a diversas patologías ha empujado el campo para desarrollar y adaptar las técnicas metabólicas para este organismo 3,4. Los métodos fiables están ahora disponibles para la medición de una serie de parámetros metabólicos en la mosca de la fruta. Por ejemplo, es sencillo para evaluar la ingesta de alimentos <shasta&gt; 5, los niveles de triglicéridos almacenados y glucógeno, así como los niveles circulantes de la hemolinfa de la glucosa y el principal azúcar que circula en la mosca, trehalosa, que es un disacárido compuesto por dos moléculas de glucosa 4. El uso de trazadores metabólicos ha permitido el estudio de la absorción de nutrientes de la dieta y la conversión de los nutrientes absorbidos tales como glucosa al glucógeno formas de almacenamiento y los triglicéridos 6. Las tasas metabólicas pueden ser evaluadas a la mosca de la fruta a través de la medición del consumo de oxígeno y dióxido de carbono 7,8 (CO 2) de producción. El ciclo del ácido cítrico oxida unidades de dos carbonos que pueden entrar en el ciclo, como acetil coenzima A (CoA), que se deriva a partir del metabolismo de carbohidratos de la dieta y almacenados y ácidos grasos. Cada vuelta del ciclo genera una molécula de cada uno de GTP (o ATP) y el donador de electrones FADH 2, tres moléculas de NADH, y dos moléculas del producto de desecho CO 2. Producción de CO 2 puedeser utilizado para estimar la tasa metabólica basal. La producción total de CO 2 se puede cuantificar en Drosophila mediante el uso de respirómetros disponibles comercialmente o hechas a mano 9-10,11. La medición del total de la producción de CO 2, especialmente cuando se combina con la medición del consumo de O2, proporciona información valiosa sobre el metabolismo de la energía en todo el cuerpo. Sin embargo, esta medida no se identifica el nutriente que se oxida para la producción de trifosfato de adenosina (ATP). Tres clases principales de nutrientes pueden entrar en el ciclo del ácido cítrico después de la conversión a acetil CoA: hidratos de carbono, ácidos grasos y proteínas. La glucosa-6-fosfato, derivado de la glucosa en la dieta o glucógeno almacenado, se puede convertir en piruvato que se descarboxila por piruvato deshidrogenasa para formar acetil CoA. Degradación de los ácidos grasos derivados de la dieta o de los triglicéridos almacenados por los rendimientos de oxidación ß-acetil CoA que entra entonces en el ciclo del ácido cítrico. Finalmente, Una mayoría de los aminoácidos puede entrar en el ciclo del ácido cítrico después de la conversión a piruvato, acetil CoA reductasa o ácido cítrico intermediarios del ciclo tales como alfa-cetoglutarato. contribución-nutriente específico para el metabolismo energético durante basal y condiciones estimuladas se puede controlar mediante el uso de trazadores radiactivos. El protocolo que aquí se presenta está adaptado para su uso en Drosophila de un protocolo utilizado para evaluar la oxidación en las células cultivadas en cultivo de 12,13. En este enfoque, moscas de la fruta son alimentados con 14 sustratos C-radiomarcado metabólicos (hidratos de carbono, ácidos grasos o aminoácidos) en la dieta durante un corto (horas) o largos (días) de pulso, perseguido en alimentos sin etiqueta, y luego expuestos a una cámara que contiene hidróxido de potasio saturada con papel de filtro (KOH) para la captura de CO exhalado 2 como bicarbonato. bicarbonato radiomarcado se puede cuantificar mediante recuento de centelleo. Las diferencias en radiomarcado-producción de CO 2 entre el experimentoAL grupos de moscas pueden reflejar el uso de diferentes combustibles para la producción de ATP en el transcurso de una prolongada diferencias rápidos o intrínsecas en el metabolismo de combustible entre los genotipos, por ejemplo.

<table><tbody><tr><td>ÁCIDO PALMÍTICO, [1-14C]-, 50 y micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSA, D-[6-14C]-, 50 y micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>glucosa, D-[1-14C]-, 50&micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Estrechos, Poliestireno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Polipropileno de Fondo Redondo, 12 x 75 mm</td><td>Malla Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr>, <tr><td>nylon nitex, 120 &; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml viales de centelleo de vidrio de borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Tope superior del matraz con orificio descentrado</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Pocillo central de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro de microfibra de vidrio Whatman GF/B, círculo, 2,1 cm de diámetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo de 6 ml con tapones de empuje/giro</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

la medición de la producción de dióxido de carbono a partir de sustratos radiomarcados en<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

El poder de la genética de Drosophila cada vez más se está aplicando a las preguntas de la señalización de la hormona y el metabolismo y para el desarrollo de modelos de enfermedades humanas en este organismo. Se necesitan métodos sensibles para mediciones de los parámetros tales como las tasas metabólicas para conducir la comprensión de la fisiología y la enfermedad en los animales pequeños, tales como la mosca de la fruta. El método descrito aquí se evalúa la oxidación de combustible en un pequeño número de moscas adultas alimentadas alimentos que contienen cantidades traza de 14 sustratos de C marcado tales como glucosa o ácidos grasos. Después de que el período de alimentación y cualquier manipulaciones experimentales adicionales, las moscas se transfieren a tubos cortos cubiertos con malla, que luego se colocan en viales de vidrio que contienen papel de filtro saturado con KOH que las trampas exhalados, radiomarcado CO 2 genera a partir de la oxidación de sustratos radiomarcados como bicarbonato de potasio, KHCO3. Esta bicarbonato radiomarcado se mide por recuento de centelleo. Esto es aqenfoque CUANTITATIVA, reproducible y sencilla para el estudio de oxidación del combustible. La utilización de la glucosa marcada radiactivamente, ácidos grasos o aminoácidos permite la determinación de la contribución de estas diferentes fuentes de combustible para el metabolismo energético en diferentes condiciones, como la alimentación y el ayuno y en diferentes fondos genéticos. Esto complementa otros enfoques utilizados para medir en el metabolismo energético vivo y debe favorecer la comprensión de la regulación metabólica.

La cantidad de exhalado y atrapado CO radiomarcado 2 que se produce a partir del metabolismo de un sustrato radiactivo debe correlacionarse con el número de moscas en una vaina de la mosca, así como la cantidad de tiempo que los animales pasan en el aparato de recogida de CO 2. Para probar esto, las moscas que estuvieron en ayunas durante 18 horas fueron alimentados con ácido palmítico marcado radiactivamente (0,02 Ci / alimentación l) durante 2 horas y después se ensayaron para la producción radiomarcado CO 2 en grupos de 12 o 25 animales por 3 o 6 incubaciones hr. La cantidad de CO2 producido por 25 moscas era casi el doble de la cantidad producida por 12 moscas, y la cantidad de cada grupo se duplicó cuando el tiempo de incubación se aumentó de 3 horas a 6 horas (Figura 2A). El 14 pmol de CO 2 / mosca / h era casi equivalentes en cada grupo. El ayuno estimula la descomposición de los ácidos grasos por ß oxidation; Por lo tanto, la producción de CO2 a partir de la oxidación de ácidos grasos debe estar elevada en animales en ayunas en comparación con los animales alimentados. Para determinar si este era el caso, 18 horas en ayunas moscas fueron alimentados con ácido palmítico marcado radiactivamente durante 2 horas. Después de este pulso de alimentación corto, las moscas se dividieron en dos grupos y se transfieren a la alimentación de la mosca no marcado o 1% de agar durante 3 horas y después se transfirieron a volar vainas de 2 hr. En dos experimentos separados, moscas persiguió en agar producido CO significativamente más radiomarcado 2 en comparación con las moscas perseguidos en la comida (Figura 2B), lo que indica que la oxidación ß se incrementó en los animales en ayunas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Figura 1. El aparato para recoger exhalado, radiomarcados CO2. Las moscas que han consumido sustratos metabólicos son radiomarcadoscolocado en un &quot;pod volar&quot; (FP), un tubo de centrífuga de corte cubiertas con una malla (M). La vaina de la mosca se coloca en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml y se tapó con un tapón superior de caucho (S) que contiene un agujero fuera del centro, a través del cual se coloca un centro bien (CW) que contiene papel de filtro GF / B saturado con 100 l 5% de KOH. Exhalado CO 2 reacciona con el KOH y está atrapada en el papel de filtro como bicarbonato. Atrapado, CO 2 radiomarcado puede ser cuantificada mediante recuento de centelleo del papel de filtro saturado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Figura 2. 14 CO 2 Correlaciones de producción con el tiempo y el número de moscas en unaMosca de la vaina y responde a alimentación y de ayuno. (A) La cantidad de 14 CO 2 producido en las moscas alimentadas palmitato radiomarcado se correlaciona con el número de moscas analizadas (n = 12 (barras blancas) o 25 (barras cerradas)) y el tiempo en una vaina de la mosca (3 o 6 horas ). Sobre una base per-mosca, moscas produjeron 0,99, 1,13, 1,10 y 1,01 pmol 14 CO 2 / hr (datos que figuran en el mismo orden de izquierda a derecha como los datos del gráfico). (B) Las moscas que fueron perseguidos en agar oxidado más radiomarcado palmitato de que las moscas que fueron perseguidos en la comida. Los datos son de dos experimentos y se presentan como medios de desviación estándar, n = 16 - 17 moscas / grupo (experimento 1); n = 10 moscas / grupo (experimento 2). * P = 0,017, prueba t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo describe un método para la medición de la oxidación del combustible en Drosophila melanogaster en el que se alimentan a moscas con trazas de sustratos metabólicos radiomarcados específicos. Se recoge y mide elCO2 radiomarcado exhalado que se produce a partir de la oxidación del combustible.

La medición de la producción de dióxido de carbono a partir de sustratos radiomarcados en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

El objetivo general de este protocolo es medir el dióxido de carbono producido por moscas de la fruta intactas, utilizando sustratos radiomarcados como ácido palmítico o glucosa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para los investigadores de Drosophila, como si una mutación determinada podría afectar el metabolismo energético. La principal ventaja de esta técnica es que permite mediciones cuantitativas, sensibles y reproducibles de la oxidación de combustibles en un pequeño número de moscas de la fruta.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de ensamblaje del dispositivo con moscas requieren manipulación rápida de piezas pequeñas para garantizar la construcción adecuada del aparato experimental antes de que las moscas se recuperen de la anestesia. El carbono-14 es un emisor beta de baja energía y tiene un alcance corto en el aire, pero aún así se debe tener cuidado para evitar derrames de moléculas radiomarcadas o ingestión accidental por parte del experimentador. Mezcle uno a dos microcurios de sustrato radiomarcado con 15 microlitros de colorante alimentario azul número uno FD&C y agua para obtener un volumen total de 25 microlitros.Introduzca completamente la mezcla de sustrato radiomarcado y colorante azul en la parte inferior de un vial vacío de alimento para moscas. Dado que los viales de alimento para moscas se vuelcan fácilmente, asegúrese de colocarlos en un recipiente que evite que se caigan. Caliente el alimento estándar para moscas en un horno de microondas hasta que el alimento se haya licuado ligeramente.De 15 a 20 segundos a un nivel alto de potencia suele ser suficiente para un vial que contiene 10 mililitros de alimento. Añada 975 microlitros del alimento fundido a la mezcla del sustrato radiomarcado y el colorante azul, y agite suavemente mientras observa la uniformidad del color azul para asegurar una mezcla completa. Puede ser necesario cortar las puntas de las pipetas con tijeras para ensanchar el extremo estrecho, permitiendo así una pipetación precisa del alimento fundido viscoso.Deje que la comida se enfríe y solidifique completamente a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se utiliza un aparato anestesiante de dióxido de carbono compuesto por polietileno poroso fusionado a una base de acrílico y conectado a un tanque de dióxido de carbono con un regulador de presión para anestesiar moscas adultas. Pase dióxido de carbono al aparato anestesiante a cinco litros por minuto.Transfiera las moscas anestesiadas a viales que contengan alimento teñido de azul con radiomarcado. Tape cada vial con un tapón de espuma y colóquelo en posición horizontal hasta que las moscas despierten. Transfiera los viales a un recipiente de acrílico con tapa.Para la alimentación a corto plazo, prive de alimento a las moscas durante 18 a 24 horas antes de transferirlas al alimento radiomarcado para asegurar que coman durante el paso de alimentación de dos a tres horas. Para la alimentación a largo plazo durante un período de cinco a siete días, no es necesario privar de alimento a las moscas, pero el experimentador debe monitorear el contenido de agua del alimento radiomarcado en los viales, y usar una aguja y una jeringa para agregar agua a los viales con alimento seco. Cuando finalice el período de alimentación con sustrato radiomarcado, transfiera las moscas a alimento no marcado golpeando suavemente el vial para hacerlas caer en un vial nuevo.Un período inicial de seguimiento de dos a cuatro horas permite que las moscas eliminen partículas de alimento radiomarcadas de sus cutículas y que digieran el alimento radiomarcado que permanece en el intestino. Supervise el avance del alimento a través del intestino mediante inspección visual de las moscas para detectar abdomens de color azul. Posteriormente, transfiera las moscas a diferentes tipos de alimento o a distintas temperaturas ambientales.La duración de este período de seguimiento variará según el experimento que se realice. Antes de preparar el aparato de recolección de dióxido de carbono, reúna los materiales para construir cápsulas para moscas, que son tubos con tapa de malla que contendrán moscas marcadas con glucosa C-14 o ácido palmítico C-14, y permanecerán abiertos a la atmósfera. Sujete una cuchilla de afeitar con una pinza hemostática, caliéntela en la llama de un mechero Bunsen hasta que esté al rojo vivo, y use la cuchilla caliente para cortar los 50 milímetros superiores de tubos de polipropileno de 12 milímetros por 75 milímetros, dejando tubos redondos de fondo con una longitud de 25 milímetros.Prepare cuadrados de 35 milímetros por 35 milímetros de malla de nailon de 130 micrones. Corte varios trozos de cinta transparente de una pulgada y media a dos pulgadas de largo. A continuación, reúna los materiales para el aparato de recolección de dióxido de carbono.Para cada cámara de moscas, ensamble un vial de vidrio de 20 mililitros para centelleo, un tapón con cubierta de caucho que tenga un orificio descentrado, un pocillo central y papel de filtro de microfibra de vidrio grado GFB. Inserte el pocillo central a través del orificio en el tapón superior. Prepare hidróxido de potasio al 5% fresco el día de su uso.Inmediatamente antes de anestesiar las moscas para su traslado al recipiente para moscas, doble y coloque el papel de filtro GFB circular en el pocillo central, pasándolo a través del orificio del tapón superior de goma, y sature con 100 microlitros de hidróxido de potasio al 5%. El traslado de las moscas anestesiadas a los recipientes para moscas es la etapa más difícil de este protocolo. Para asegurar el éxito, mantenga todos los materiales necesarios al alcance de la mano y trabaje rápidamente para limitar la exposición de las moscas al dióxido de carbono, y para evitar que las moscas despierten y escapen antes de que la malla haya sido fijada firmemente al tubo.Después de las incubaciones en medios no marcados, anestesie las moscas con dióxido de carbono. Cepille las moscas anestesiadas dentro del tubo de polipropileno cortado, tápelo con la malla de nailon y use cinta transparente para adherir la malla al tubo. Se debe usar un número igual de moscas en cada cápsula de moscas para un experimento determinado.De 10 a 20 moscas por cápsula de mosca producen dióxido de carbono radiomarcado suficiente para su medición mediante conteo por centelleo. Transfiera la cápsula de mosca al vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros. Tape el vial de vidrio con el tapón de hule que contiene un pozo central con papel filtro GFB saturado con hidróxido de potasio.Doble la parte superior ancha del tapón con revestimiento de goma sobre el borde del vial de vidrio para centelleo. Coloque los viales de vidrio que contienen las moscas en un recipiente acrílico con tapa y incube durante períodos de tiempo variables. Al final de la incubación, retire la tapa del vial de vidrio y transfiera el papel de filtro GFB saturado con hidróxido de potasio a un vial de plástico para centelleo de seis mililitros que contenga cuatro mililitros de cóctel de centelleo.Prepare viales de centelleo adicionales, uno que contenga papel de filtro GFB sin usar para servir como fondo, y uno o dos viales más que contengan sustrato radiomarcado de 0,1 a 0,5 microcurios para determinar las cuentas por minuto por microcurio. Mediante un contador de centelleo, mida las cuentas por minuto de cada muestra según el protocolo del fabricante. Posteriormente, calcule la producción total de dióxido de carbono como se describe en el texto del protocolo.Las moscas fueron sometidas a ayuno durante 18 horas, alimentadas con ácido palmítico radiomarcado durante dos horas y luego analizadas para medir la producción de dióxido de carbono radiomarcado en grupos de 12 o 25 animales durante incubaciones de tres o seis horas. Como se muestra en este gráfico, la cantidad de dióxido de carbono producida por 25 moscas fue casi el doble de la producida por 12 moscas, y la cantidad en cada grupo se duplicó cuando el tiempo de incubación aumentó de tres a seis horas. La cantidad de dióxido de carbono radiomarcado en picomoles por mosca por hora fue casi equivalente en cada grupo.Dado que el ayuno estimula la degradación de ácidos grasos mediante la beta oxidación, la producción de dióxido de carbono a partir de la oxidación de ácidos grasos debería estar elevada en animales en ayunas en comparación con animales alimentados. Para comprobar esto, moscas en ayunas durante 18 horas se alimentaron con ácido palmítico radiomarcado durante dos horas, se dividieron en dos grupos y se transfirieron a alimento para moscas sin marcaje o a agar al 1%. En dos experimentos independientes, las moscas mantenidas en agar produjeron significativamente más dióxido de carbono radiomarcado que las moscas mantenidas en alimento, lo que indica que la beta oxidación aumentó en los animales en ayunas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos complementarios, como la medición de la producción total de dióxido de carbono y el consumo total de oxígeno, así como el cálculo de la relación de intercambio respiratorio, con el fin de responder preguntas adicionales, como cuál es la fuente de combustible preferida. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar este protocolo para determinar el efecto de una mutación determinada o de una manipulación experimental sobre la capacidad de utilizar un combustible específico como fuente de energía. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, batas de laboratorio y gafas protectoras, así como utilizar blindajes adecuados durante la realización de este procedimiento.

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