La medición de la producción de dióxido de carbono a partir de sustratos radiomarcados en Drosophila melanogaster

El objetivo general de este protocolo es medir el dióxido de carbono producido por moscas de la fruta intactas, fijadas en sustratos radiomarcados como el ácido palmítico o la glucosa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para los investigadores de Drosophila, como si una mutación determinada puede afectar al metabolismo energético. La principal ventaja de esta técnica es que permite mediciones cuantitativas, sensibles y reproducibles de la oxidación del combustible en un pequeño número de moscas de la fruta.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de ensamblaje de la cápsula de mosca requieren una manipulación rápida de piezas pequeñas para garantizar la construcción adecuada del aparato experimental antes de que las moscas se recuperen de la anestesia. El carbono-14 es un emisor beta de baja energía y tiene un alcance corto en el aire, pero aún así se debe tener cuidado para evitar el derrame de moléculas radiomarcadas o la ingestión accidental por parte del experimentador. Mezcle uno o dos sustratos radiomarcados microcurie con 15 microlitros de colorante alimentario azul FD&C Number One y agua para obtener un volumen total de 25 microlitros.

Coloque todo el sustrato radiomarcado y la mezcla de tinte azul en el fondo de un frasco vacío de alimento para moscas. Dado que los frascos de comida para moscas se vuelcan fácilmente, asegúrese de guardarlos en un recipiente que evite que se vuelquen. Caliente la comida estándar para moscas en un horno de microondas hasta que la comida esté licuada.

De 15 a 20 segundos a un nivel de alta potencia suele ser suficiente para un vial que contiene 10 mililitros de alimento. Agregue 975 microlitros de alimento fundido al sustrato radiomarcado y a la mezcla de tinte azul, y agite rápidamente mientras monitorea la uniformidad del color azul para garantizar una mezcla completa. Es posible que sea necesario cortar las puntas de la cabeza de la tubería con las tijeras para ensanchar el extremo estrecho, lo que permite un encabezado preciso de la tubería del alimento fundido con visco.

Deje que los alimentos se enfríen y solidifiquen completamente a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Un aparato anestésico de dióxido de carbono que consiste en polietileno poroso fusionado a una base acrílica y conectado a un tanque de dióxido de carbono con un regulador de presión se utiliza para anestesiar moscas adultas. Fluya dióxido de carbono en el aparato de anestesia a cinco litros por minuto.

Transfiera las moscas anestesiadas a viales que contengan alimentos teñidos de azul radiomarcados. Tape cada vial con un tapón de espuma y déjelo reposar horizontalmente hasta que las moscas se despierten. Transfiera los viales a un recipiente acrílico con tapa.

Para la alimentación a corto plazo, las moscas hambrientas durante 18 a 24 horas antes de su transferencia a alimentos radiomarcados para asegurarse de que comerán durante el paso de alimentación de dos a tres horas. Para la alimentación a largo plazo en el transcurso de cinco a siete días, no es necesario matar de hambre a las moscas, pero el experimentador debe controlar el contenido de agua de los alimentos marcados radiológicamente en los viales, y usar una aguja y una jeringa para agregar agua a los viales con alimentos secos. Cuando termine el período de alimentación con sustrato radiomarcado, transfiera las moscas a alimentos no etiquetados golpeándolos en un nuevo vial.

Un período de persecución inicial de dos a cuatro horas permite a las moscas limpiar las partículas de comida radiomarcadas de sus cutículas, y permite la digestión de los alimentos radiomarcados que permanecen en el intestino. Controle el progreso de los alimentos a través del intestino mediante la inspección visual de las moscas para buscar abdómenes azules. Posteriormente, transfiera las moscas a diferentes tipos de alimentos o temperaturas ambiente.

La duración de este período de persecución variará según el experimento que se realice. Antes de fabricar el aparato de recolección de dióxido de carbono, reúna los materiales para construir cápsulas de moscas, que son tubos con cubierta de malla que contendrán moscas marcadas con glucosa C-14 o ácido palmítico C-14, y permanecerán abiertas a la atmósfera. Sujete una hoja de afeitar con un hemostático, caliéntela en la llama de un mechero Bunsen hasta que esté al rojo vivo y use la hoja calentada para cortar los 50 milímetros superiores de los tubos de polipropileno de 12 milímetros por 75 milímetros, dejando tubos de fondo redondo de 25 milímetros de largo.

Prepare cuadrados de 35 milímetros por 35 milímetros de malla de nailon de 130 micras. Corta varios pedazos de cinta transparente de una pulgada y media a dos pulgadas de largo. A continuación, ensamble los materiales para el aparato de recolección de dióxido de carbono.

Para cada cápsula de mosca, ensamble un frasco de centelleo de vidrio de 20 mililitros, un tapón con tapa de goma con un orificio descentrado, un pozo central y papel de filtro de microfibra de vidrio GFB de grado. Inserte el pozo central a través del orificio en el tapón superior. Prepare hidróxido de potasio al 5% fresco el día de su uso.

Justo antes de anestesiar las moscas para transferirlas a la cápsula de moscas, doble y coloque el papel de filtro GFB circular en el pozo central que se enrosca a través del orificio del tapón superior de goma y sature con 100 microlitros de hidróxido de potasio al 5%. La transferencia de moscas anestesiadas a las cápsulas de mosca es el paso más difícil de este protocolo. Para asegurar el éxito, tenga a mano todos los materiales necesarios y trabaje rápidamente para limitar la exposición de las moscas al dióxido de carbono y evitar que las moscas se despierten y escapen antes de que la malla se haya fijado firmemente al tubo.

Después de las incubaciones en medios no marcados, anestesiar las moscas con dióxido de carbono. Cepille las moscas anestesiadas en el tubo de polipropileno cortado, cúbralo con la malla de nailon y use cinta transparente para adherir la malla al tubo. Se debe usar un número igual de moscas en cada cápsula de moscas para un experimento en particular.

De 10 a 20 moscas por cápsula producen suficiente dióxido de carbono radiomarcado para la medición mediante conteo de centelleo. Transfiera la cápsula de mosca al vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros. Tape el frasco de vidrio con el tapón con tapa de goma, sosteniendo un pozo central que contiene papel de filtro GFB saturado con hidróxido de potasio.

Doble la parte superior ancha del tapón con cubierta de goma sobre el borde del frasco de centelleo de vidrio. Coloque los frascos de vidrio que contienen las moscas en un recipiente acrílico con tapa e incube durante períodos de tiempo variables. Al final de la incubación, destape el frasco de vidrio y transfiera el papel de filtro GFB saturado de hidróxido de potasio a un vial de centelleo de plástico de seis mililitros que contiene 4 mililitros de cóctel de centelleo.

Prepare viales de centelleo adicionales, uno que contenga papel de filtro GFB sin usar para que sirva de fondo, y uno o dos viales más que contengan sustrato radiomarcado de 0,1 a 0,5 microcurie para determinar los recuentos por minuto por microcurie. Usando un contador de centelleo, mida los recuentos por minuto para cada muestra de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, calcule la producción total de dióxido de carbono como se describe en el texto del protocolo.

Las moscas se ayunaron durante 18 horas, se alimentaron con ácido palmítico radiomarcado durante dos horas y luego se realizó una prueba de producción de dióxido de carbono radiomarcado en grupos de 12 o 25 animales durante incubaciones de tres o seis horas. Como se muestra en este gráfico, la cantidad de dióxido de carbono producida por 25 moscas fue casi el doble de la cantidad producida por 12 moscas, y la cantidad de cada grupo se duplicó cuando el tiempo de incubación se incrementó de tres a seis horas. El dióxido de carbono radiomarcado picomolar por mosca por hora fue casi equivalente en cada grupo.

Dado que el ayuno estimula la descomposición de los ácidos grasos por oxidación beta, la producción de dióxido de carbono a partir de la oxidación de ácidos grasos debe ser elevada en los animales en ayunas en comparación con los animales alimentados. Para probar esto, las moscas en ayunas de 18 horas fueron alimentadas con ácido palmítico radiomarcado durante dos horas, divididas en dos grupos, y transferidas a alimento para moscas no etiquetado, o agar al 1%. En dos experimentos separados, las moscas perseguidas en agar produjeron significativamente más dióxido de carbono radiomarcado que las moscas perseguidas en la comida, lo que indica que la oxidación beta aumentó en los animales en ayunas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos complementarios como la medición de la producción total de dióxido de carbono y el consumo total de oxígeno, y el cálculo de la relación de intercambio respiratorio para responder preguntas adicionales, como cuál es la fuente de combustible preferida. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este protocolo para determinar el efecto de una mutación determinada o manipulación experimental en la capacidad de usar un combustible específico como fuente de energía. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, batas de laboratorio y gafas, y el uso de un blindaje adecuado, mientras se realiza este procedimiento.