Name: -Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a construir un modelo de ratón humanizado BLT con inmunidad diseñada contra el VIH usando células madre CD34+. Este método permite evaluar terapias génicas en preclínica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a la Sra. Jessica Selander por proporcionar asistencia artística en la confección de nuestras figuras. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIAID/NIH, subvención no. RO1AI078806, el Centro de Investigación sobre el SIDA de la UCLA (CFAR), subvención no. P30AI28697, el Instituto de Medicina Regenerativa de California, subvención no. TR4-06845, Federación Americana para la Investigación del SIDA (amfAR), subvención no. #108929-54-RGRL, y el Programa e Iniciativas de Investigación Multicampus de la UC, Centro de California para el Descubrimiento de Medicamentos Antivirales (CCADD)

<ol><li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
<li>Zhen, A., Kitchen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+gene+therapy+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based gene therapy for HIV infection.</a> Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Antigen-Specific+T+Cells+from+Genetically+Modified+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+in+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice.</a> PloS one. 4 (12), e8208(2009).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+suppression+of+HIV+by+antigen+specific+T+cells+derived+from+engineered+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).</li>
<li>Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+HIV-1-infected+cells+and+inhibition+of+viral+replication+by+universal+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells.</a> PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).</li>
<li>Zhen, A., Kamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+Immunity+Derived+From+Chimeric+Antigen+Receptor-engineered+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells.</a> Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Therapy+for+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).</li>
<li>Pejchal, R., Doores, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+and+Broad+Neutralizing+Antibody+Recognizes+and+Penetrates+the+HIV+Glycan+Shield%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield.</a> Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).</li>
<li>Caskey, M., Klein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viraemia+suppressed+in+HIV-1-infected+humans+by+broadly+neutralizing+antibody+3BNC117%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117.</a> Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).</li>
<li>West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+on+the+role+of+antibodies+in+HIV-1+vaccine+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy.</a> Cell. 156 (4), 633-648 (2014).</li>
<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+BLT+humanized+mouse+as+a+stem+cell+based+gene+therapy+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).</li>
<li>De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+six+colors%3A+a+new+era+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond six colors: a new era in flow cytometry.</a> Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>Denton, P. W., Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+latency+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV latency in humanized BLT mice.</a> Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies+formation+and+differentiation+from+mouse+embryonic+stem+cells+in+collagen%2FMatrigel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds.</a> Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).</li>
<li>Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Exogenous+T-cell+Receptors+Into+Human+Hematopoietic+Progenitors+Results+in+Exclusion+of+Endogenous+T-cell+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).</li>
<li>Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Current advances in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).</li>
<li>Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogammaglobulinemia+in+BLT+humanized+mice--an+animal+model+of+primary+antibody+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency.</a> PloS one. 9 (10), e108663(2014).</li>
<li>McCune, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+the+SCID-hu+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and applications of the SCID-hu mouse model.</a> Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).</li>
<li>Srivastava, S., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR-T+Cells%3A+Design+Concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con CAR y ganando impulso inmunidad ingeniería basada en HSC hacia los estudios clínicos, es importante tener un modelo animal adecuado para examinar de cerca la diferenciación y función de estas células modificadas. En este protocolo se describen los métodos para la construcción y prueba de ratones humanizados con células madre modificadas genéticamente manipulados contra el VIH. Es importante tener la transducción eficiente de células madre antes del trasplante. Sin embargo, debido a la capacidad de las células T para...

A pesar del éxito de la terapia anti-retroviral combinada, la infección por VIH sigue siendo una enfermedad de por vida. La respuesta inmune celular contra el VIH juega muy importante papel en el control de la replicación del VIH. Los recientes avances en la manipulación de células madre ha permitido para el rápido desarrollo de la terapia génica enfoques para el tratamiento del VIH 1-3. Como resultado de ello, es importante tener un modelo animal adecuado que permite el estudio in vivo de la eficacia de las terapias basadas en células contra el VIH. Trabajando con el VIH en modelos animales se complica por el hecho de que el virus sólo infecta las células humanas. Para evitar esta limitación, los científicos han recurrido al uso de modelos de enfermedades como el virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV) en macacos Rhesus 4,5. Por desgracia, existen importantes limitaciones en este modelo debido a las diferencias inherentes entre las especies y las diferencias entre SIV y el VIH. Además, sólo las instalaciones altamente especializados son capable de apoyar el trabajo con los primates no humanos y macacos cada uno requiere una gran inversión. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de un modelo que utiliza el sistema inmunitario humano, que es susceptible a la infección por VIH / patogénesis, y es menos económicamente prohibitivo. El diabético no obeso (NOD) -severe inmunodeficiencia combinada (SCID) de la cadena gamma nocaut -común (c γ - / -) (o NSG) Sangre / Hígado / timo (BLT) modelo de ratón humanizado se demuestra cada vez más como una herramienta importante para estudiar la infección por el VIH. Mediante la implantación de células madre hematopoyéticas (HSC) y timo fetal, los ratones son capaces de desarrollar y recapitular un sistema inmunológico humano 1-3. Un tipo de terapia génica basada en células madre implica &#39;redirigir &quot;células T periféricas a diana del VIH mediante la reprogramación de las células madre hematopoyéticas (HSC) para diferenciarse en células T específicas de antígeno. Hemos demostrado previamente que las CMH de ingeniería con un anti-VIH específicos de células T re clonado molecularCeptor (TCR) contra el epítopo SL9 (aminoácido 77 a 85; SLYNTVATL) del VIH-1 Gag puede redirigir células madre en células formadoras de T maduras que suprimen la replicación del VIH en el GSN-BLT modelo de ratón humanizado 6. La advertencia de utilizar un TCR clonado molecular es que se limita a un subtipo específico del antígeno leucocitario humano (HLA) que limitar la aplicación de esta terapia. receptores de antígenos quiméricos (CAR), por el contrario, pueden aplicarse universalmente a todos los subtipos de HLA. Se llevaron a cabo estudios iniciales utilizando un CAR construido con los dominios extracelulares y transmembrana de CD4 humano fusionado al dominio intracelular de señalización CD3 ζ (denominado el CD4ζCAR). CD4ζCAR expresa en las células CD8 T pueden reconocer envoltura del VIH y desencadenar una respuesta de células T citotóxicas que es similar a la mediada por un receptor de células T 7. Recientemente hemos demostrado que HSCs humanas se pueden modificar con CD4ζCAR, que puede diferenciarse en múltiples li hematopoyéticoneages, incluyendo las células T funcionales capaces de suprimir la replicación del VIH en el modelo de ratón humanizado 8. Con el rápido avance en las terapias de los receptores de antígeno quiméricos para el cáncer de 9, y la caracterización en curso de anticuerpos neutralizantes amplias potentes 10-12 contra el VIH que permiten la construcción de las CAR de anticuerpos de cadena única, es perceptible que muchos nuevos constructos candidatos, además de CD4ζCAR , será generado y probado para la terapia génica basada en células madre de enfermedades de VIH y otras enfermedades. Además, el modelo de ratón humanizado GSN-BLT que contiene estos coches específicos de antígeno también puede proporcionar una herramienta útil para examinar de cerca las respuestas de células T humanas in vivo. Es importante destacar que nuestro protocolo difiere de los métodos anteriores descritos para la construcción de humanizada de ratones BLT 13-15 en que el HSCs en mezcla de proteína gelatinosa se ​​utiliza en lugar de los troncos de hígado fetal 16. Este protocolo describe: 1) la construcción de humanilos ratones BLT zed ingeniería con CD4ζCAR; y 2) la caracterización de la diferenciación de las células modificadas genéticamente; y 3) la caracterización de la funcionalidad de las células modificadas genéticamente.

<table><tbody><tr><td>Kit de microperlas CD34</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>Para clasificar células progenitoras CD34+ humanas</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>Para congelar células</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>Para medir la carga viral en el suero</td></tr><tr><td>MACSQuant Citómetro de flujo</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>Para el análisis de flujo</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade;</td><td>BD biosciences</td><td>Para el análisis</td>de <td></td> flujo</tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&nbsp;</td><td>Para la digestión de tejidos</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&nbsp;</td><td>para la digestión de tejidos</td></tr><tr><td>Tecnología de la vida de la colagenasa</td><td></td><td>17104-019&nbsp;</td><td>para la digestión de tejidos</td></tr><tr><td>CFX Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Biorad</td><td></td><td>Para medir la carga viral y la expresión génica</td></tr><tr><td>Ratones, cepa NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>Para la construcción de ratones humanizados</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>Para el cultivo de células</td></tr><tr><td>Piperacilina/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone antimicótico)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>Pinzas para heridas Autoclip, 9 mm - 1.000 unidades</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&nbsp;</td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Batas quirúrgicas estériles Aurora reforzadas con polietileno, 30 por caja&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&nbsp;</td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Suturas, 4-0, vicryl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Owens y Minor</td><td>23000J304H&nbsp; &nbsp;</td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de alcohol&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Owens y Minor</td><td>3583006818</td><td>Para cirugía</td></tr><tr><td>Guantes, quirúrgicos, 6 1/2</td><td>Owens y Minor</td><td>4075711102</td><td>Para cirugía</td></tr><tr><td>Yssel' s Medio de células T sin suero Gemini</td><td>Bio-products</td><td>400-102</td><td>para la transducción de células CD34 +</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>para la transducción de células CD34+</td></tr></tbody></table>

-base de células madre inmunidad diseñado frente a la infección por vih en el modelo de ratón humanizado

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

Con el rápido desarrollo de terapias génicas basadas en células madre contra el VIH, no hay presión requisito de un modelo animal para estudiar la diferenciación hematopoyética y la función inmune de las células modificadas genéticamente. El humanizado de médula ósea / del hígado / timo (BLT) modelo de ratón permite la completa reconstitución de un sistema inmunológico humano en la periferia, que incluye las células T, células B, células NK y monocitos. El implante del timo humano también permite la selección tímica de las células T en el tejido tímico autólogo. Además del estudio de la infección por VIH, el modelo se presenta como una herramienta poderosa para estudiar la diferenciación, el desarrollo y la funcionalidad de las células derivadas de células madre hematopoyéticas (HSC). Aquí describimos la construcción de humanizado diabéticos no obesos (NOD) -severe inmunodeficiencia combinada (SCID) de la cadena gamma nocaut -común (c γ - / -) ratones -Bone ósea / hígado / timo (NSG-BLT) con HSC transducidas con receptor de antígeno quimérico CD4 (CD4CAR)vector lentivirus. Se demuestra que la CD4CAR HSC puede diferenciar con éxito en múltiples linajes y tienen actividad anti-VIH. El objetivo del estudio es demostrar el uso de modelo de ratón NSG-BLT como un modelo in vivo para la inmunidad contra el VIH ingeniería. Vale la pena señalar que, dado que se utiliza lentivirus y el tejido humano, los experimentos y las cirugías deben realizarse en una cabina de bioseguridad de clase II en un nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con precauciones especiales instalación (BSL2 +).

La Figura 1 muestra un esquema de la construcción de ratones humanizados BLT con células madre modificada. 10 semanas después de la cirugía de implante, se sacrificaron los ratones para evaluar la diferenciación y el desarrollo de células modificadas de genes. Como se muestra en la Figura 2, múltiples tejidos linfoides (sangre, bazo, timo y médula ósea) se recogieron de un ratón que se ha modificado con CD4ζCAR. El CD4ζCAR utilizado en este protocolo con...

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un ratón humanizado modificado con un receptor de antígeno quimérico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del VIH y la inmunología, relacionadas con la evaluación de la eficacia de la inmunidad modificada basada en células madre frente a la infección por VIH y otras infecciones crónicas y enfermedades malignas, así como con los mecanismos de fracaso inmunitario y las formas de potenciar el sistema inmunitario y desarrollar una terapia para lograr una inmunidad antiviral o antitumoral más eficaz.La principal ventaja de esta técnica es que permite un gran número de manipulaciones experimentales. El modelo de ratones BLT humanizados imita la inmunidad humana y, en este caso, posibilita pruebas preclínicas de terapias génicas basadas en células contra la infección por VIH. Realizarán el procedimiento Valerie Rezek y Brianna Lam, quienes son técnicas de mi laboratorio.Comience utilizando escalpelos para cortar el timo en pequeños trozos de aproximadamente un milímetro cúbico en un recipiente que contenga medio RPMI suplementado. Luego, utilice pinzas curvas romas para colocar cada trozo individual de timo en un pozo individual de una placa de 96 pozos. Añada 100-200 microlitros de medio a todos los pozos para que el tejido no se seque.Visualice el tejido bajo el microscopio para eliminar cualquier tejido que no sea timo o que tenga tejido conectivo adherido. A continuación, retire los fragmentos confirmados de timo y combínelos en un frasco de cultivo celular T25. Añada siete mililitros de medio RPMI suplementado con antibiótico al frasco y agite suavemente para mezclar.Luego, coloque el frasco en la incubadora de cultivo de tejidos. Este paso evita la contaminación bacteriana del tejido. Comience el aislamiento de las CTH positivas para CD34 a partir del hígado fetal utilizando dos escalpelos para cortar el hígado en pequeños trozos de aproximadamente tres milímetros cúbicos en un recipiente que contenga IMDM.Retire y deseche cualquier tejido conectivo blanco. Luego, use una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja romo de calibre 16 para extraer los trozos de hígado y el medio, y transfiera a un tubo cónico de 50 mililitros. Aspire y expulse suavemente cinco a siete veces más para homogeneizar completamente el tejido.Después de preparar 10 mililitros de medio IMDM, suplementarlo con colagenasa, hialuronidasa, antibióticos, ADNasa y agente antifúngico. Pase el medio a través de un filtro de 0,22 micrones. Luego, agregue el medio filtrado a la suspensión de hígado.Después de colocar la tapa en el tubo cónico de 50 mililitros que contiene la suspensión de hígado, séllelo firmemente con una película autoadhesiva como parafilm para evitar fugas. Incube durante 90 minutos en un rotador de tubos a 37 grados celsius. Tras la incubación, filtre la suspensión celular digerida a través de un filtro celular de 100 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros nuevo.Añada PBS a la suspensión para llevar el volumen total hasta 50 mililitros. Divida esta mezcla en dos tubos de 50 mililitros, cada uno conteniendo 25 mililitros de suspensión celular. Lentamente y con cuidado, subyaga las células en cada tubo con 10 mililitros de un medio de centrifugación por densidad, como Ficoll.Centrifugar a 1200 veces g durante 20 minutos sin interrupción. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente la interfase de cada tubo y transfiera a dos tubos separados de 50 mililitros. Ajuste el volumen de cada tubo de interfase a 50 mililitros con PBS.Luego, centrifugar a 300 veces g durante siete a 10 minutos. Combinar y lavar los pellets celulares tres veces con 50 mililitros de PBS que contenga 2% de FBS, centrifugando a 300 veces g durante siete a 10 minutos cada vez. Tras la última centrifugación, re-suspender el pellet en 50 mililitros de medio RPMI más 10% de FBS.Cuente las células utilizando un hemocitómetro. A continuación, separe inmediatamente las células positivas para CD34 utilizando un kit de separación para CD34 según el protocolo del fabricante, y guarde tanto la fracción positiva como la negativa para CD34. Vierta los fragmentos de timo y el medio del matraz a una placa de 60 milímetros.Enfríe algunas puntas de pipeta de desplazamiento positivo colocándolas en tubos estériles de 1,5 mililitros con tapón roscado abiertos sobre hielo. Además, coloque los pellet celulares y un volumen de mezcla proteica gelatinosa, como matrigel, sobre hielo. Anestesie los ratones receptores con un anestésico inyectable según un protocolo para animales aprobado.Verifique el nivel de anestesia del ratón apretando una pata. La ausencia de reacción al apretón indica un plano quirúrgico de anestesia. Afeite el lado izquierdo de cada ratón desde la cadera hasta el hombro, entre el centro de la espalda y el estómago.Administre subcutáneamente seis miligramos por kilogramo de Carprofeno diluido en el triángulo escapular o inguinal del animal. Lave la cánula del trócar con PBS en una placa de 60 milímetros. Utilizando un par de fórceps curvos romos, coloque un fragmento de timo procedente de la placa de 60 milímetros justo en la entrada de la cánula, luego retire el trócar para aspirar el tejido hacia el interior de la cánula.A continuación, utilice una pipeta de desplazamiento positivo y una punta fría para agregar cinco microlitros de mezcla proteica gelatinosa fría al tubo con el sedimento celular. Y agite suavemente para generar la suspensión celular. Pipetee la suspensión celular dentro de la abertura de la cánula y retire lentamente el trocar para cargar la aguja.Frote el área afeitada del ratón con yodo-povidona seguido de isopropenol tres veces. Determine el punto más oscuro bajo la piel, que indica la ubicación del bazo. El riñón se encuentra aproximadamente cinco milímetros dorsal al bazo.Después de asegurar un nivel adecuado de anestesia mediante la ausencia de reacción al pellizco de la pata, use fórceps curvos para levantar la piel y use tijeras quirúrgicas para realizar una incisión de 15 milímetros en la piel paralela al bazo. Luego realice un corte similar en la capa peritoneal debajo. En los machos, el riñón es fácilmente visible, por lo que se extruye simplemente al presionar el abdomen.Sostenga el riñón con una pinza hemostática o un par de fórceps curvos romos. En las hembras, los ovarios suelen dificultar la extracción del riñón. Utilizando una pinza hemostática, tome el ovario y exponga cuidadosamente el riñón.Utilice pinzas con punta de aguja para hacer un pequeño orificio en el extremo posterior de la cápsula renal. Introduzca el trocar en este orificio y deslícelo a lo largo del riñón hasta que la abertura de la cánula quede completamente cubierta por la cápsula renal. Extruya suavemente el tejido debajo de la cápsula renal y retire el trocar. Utilice la pinza curva para asegurarse de que el fragmento de timo no salga nuevamente con la aguja. A continuación, levante el peritoneo con la pinza y use suavemente el hemostato para empujar el riñón de vuelta a su lugar. Coloque una puntada anudada doble con sutura quirúrgica en el peritoneo.También coloque dos clips quirúrgicos Autoclips para cerrar la piel. Ahora mezcle las células positivas para CD34 transducidas y aspire 0,5 veces 10 a la seis células en un volumen de 100 microlitros en una jeringa de insulina. Inyecte estas células en el ratón mediante inyección por vía retroorbital.Después de la inyección, aplique con un hisopo una pequeña gota de lubricante ocular en cada ojo y coloque al ratón de lado nuevamente en una jaula. Después de implantar a todos los ratones, confirme que los animales hayan recuperado la conciencia y puedan desplazarse antes de devolverlos a la sala de alojamiento. Los ratones fueron sacrificados 10 semanas después de la cirugía y se recolectaron sangre, bazo, timo y médula ósea.Las células resultantes se tiñeron con anticuerpos anti-CD45 humana y anti-CD4 humana y se analizaron mediante citometría de flujo. Como se observa aquí, las células modificadas con el receptor de antígeno quimérico CD4 pueden detectarse en múltiples tejidos linfoides mediante citometría de flujo. Las células modificadas con el receptor de antígeno quimérico CD4 pueden diferenciarse en múltiples linajes.Aquí, se obtuvieron esplenocitos de ratones modificados con receptor de antígeno quimérico CD4 y se marcaron con marcadores de linfocitos T y B. Las células negativas para los marcadores de linfocitos T y B fueron positivas para marcadores de monocitos y macrófagos y para células asesinas naturales. Los esplenocitos de ratones infectados con VIH que expresan el receptor de antígeno quimérico CD4 se estimularon con linfocitos T infectados o no infectados con VIH, y se muestra su producción intracelular de citocinas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir ratones BLT humanizados modificados con receptores de antígenos quiméricos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 48 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar a un ritmo constante y prestar mucha atención al estado del ratón que se está operando.Para principiantes, es importante practicar cirugía e inyecciones oculares antes de trabajar con tejidos y células madre que son más valiosos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH y otras enfermedades infecciosas exploraran la patogénesis de las enfermedades y terapias basadas en el sistema inmunitario en el modelo de ratón humanizado.

stem-cell-based-engineered-immunity-against-hiv-infection-humanized

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La generación y caracterización de células T específicas de tumor en ratones humanizados se describe aquí. Tejido del timo humano y genéticamente modificados células madre hematopoyéticas son trasplantados en ratones inmunodeficientes. Esto da como resultado la reconstitución de una ingeniería del sistema inmune humano permitiendo examen in vivo de anti-tumor de la respuesta inmune.

Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical para generar ratones del sistema inmunitario humano

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

El video muestra una técnica para generar un modelo de ratón humanizado con inmunidad de ingeniería basada en células madre contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). El tejido del timo fetal humano y las células madre hematopoyéticas (HSC) modificadas genéticamente se implantan en la cápsula renal de un ratón gravemente inmunodeprimido. Las HSC, que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra el VIH, se mezclan en una mezcla de proteínas gelatinosas que promueve su...

Construcción de un modelo de ratón humanizado con inmunidad modificada contra el VIH

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

Hemos desarrollado un protocolo para la generación y evaluación de un modelo de ratón NOG infectado por el virus de inmunodeficiencia humana y humanizado basado en el trasplante de células madre, la exposición al virus de inmunodeficiencia humana intravaginal y el ARN PCR digital de gotas Cuantificación.

Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal

Este protocolo describe un método novedoso para administrar medicamentos antirretrovirales combinados orales que suprimen con éxito la replicación del ARN del VIH-1 en ratones humanizados.

Tratamiento antirretroviral combinado oral en ratones humanizados infectados con VIH-1

Este protocolo describe la generación de ratones del sistema inmune humano (HIS) para estudios de inmunooncología. Las instrucciones y consideraciones en el uso de este modelo para probar inmunoterapias humanas en tumores humanos implantados en este modelo se presentan con énfasis en la caracterización de la respuesta del sistema inmune humano al tumor.

Prueba de inmunoterapia contra el cáncer en un modelo de ratón humanizado con tumores humanos

Aprende a construir un modelo de ratón humanizado BLT con inmunidad diseñada contra el VIH usando células madre CD34+. Este método permite evaluar terapias génicas en preclínica.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

Explorar más videos