Name: -Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a construir un modelo de ratón humanizado BLT con inmunidad diseñada contra el VIH usando células madre CD34+. Este método permite evaluar terapias génicas en preclínica.

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Nos gustaría agradecer a la Sra. Jessica Selander por proporcionar asistencia artística en la confección de nuestras figuras. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIAID/NIH, subvención no. RO1AI078806, el Centro de Investigación sobre el SIDA de la UCLA (CFAR), subvención no. P30AI28697, el Instituto de Medicina Regenerativa de California, subvención no. TR4-06845, Federación Americana para la Investigación del SIDA (amfAR), subvención no. #108929-54-RGRL, y el Programa e Iniciativas de Investigación Multicampus de la UC, Centro de California para el Descubrimiento de Medicamentos Antivirales (CCADD)

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con CAR y ganando impulso inmunidad ingeniería basada en HSC hacia los estudios clínicos, es importante tener un modelo animal adecuado para examinar de cerca la diferenciación y función de estas células modificadas. En este protocolo se describen los métodos para la construcción y prueba de ratones humanizados con células madre modificadas genéticamente manipulados contra el VIH. Es importante tener la transducción eficiente de células madre antes del trasplante. Sin embargo, debido a la capacidad de las células T para...

A pesar del éxito de la terapia anti-retroviral combinada, la infección por VIH sigue siendo una enfermedad de por vida. La respuesta inmune celular contra el VIH juega muy importante papel en el control de la replicación del VIH. Los recientes avances en la manipulación de células madre ha permitido para el rápido desarrollo de la terapia génica enfoques para el tratamiento del VIH 1-3. Como resultado de ello, es importante tener un modelo animal adecuado que permite el estudio in vivo de la eficacia de las terapias basadas en células contra el VIH. Trabajando con el VIH en modelos animales se complica por el hecho de que el virus sólo infecta las células humanas. Para evitar esta limitación, los científicos han recurrido al uso de modelos de enfermedades como el virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV) en macacos Rhesus 4,5. Por desgracia, existen importantes limitaciones en este modelo debido a las diferencias inherentes entre las especies y las diferencias entre SIV y el VIH. Además, sólo las instalaciones altamente especializados son capable de apoyar el trabajo con los primates no humanos y macacos cada uno requiere una gran inversión. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de un modelo que utiliza el sistema inmunitario humano, que es susceptible a la infección por VIH / patogénesis, y es menos económicamente prohibitivo. El diabético no obeso (NOD) -severe inmunodeficiencia combinada (SCID) de la cadena gamma nocaut -común (c γ - / -) (o NSG) Sangre / Hígado / timo (BLT) modelo de ratón humanizado se demuestra cada vez más como una herramienta importante para estudiar la infección por el VIH. Mediante la implantación de células madre hematopoyéticas (HSC) y timo fetal, los ratones son capaces de desarrollar y recapitular un sistema inmunológico humano 1-3. Un tipo de terapia génica basada en células madre implica &#39;redirigir &quot;células T periféricas a diana del VIH mediante la reprogramación de las células madre hematopoyéticas (HSC) para diferenciarse en células T específicas de antígeno. Hemos demostrado previamente que las CMH de ingeniería con un anti-VIH específicos de células T re clonado molecularCeptor (TCR) contra el epítopo SL9 (aminoácido 77 a 85; SLYNTVATL) del VIH-1 Gag puede redirigir células madre en células formadoras de T maduras que suprimen la replicación del VIH en el GSN-BLT modelo de ratón humanizado 6. La advertencia de utilizar un TCR clonado molecular es que se limita a un subtipo específico del antígeno leucocitario humano (HLA) que limitar la aplicación de esta terapia. receptores de antígenos quiméricos (CAR), por el contrario, pueden aplicarse universalmente a todos los subtipos de HLA. Se llevaron a cabo estudios iniciales utilizando un CAR construido con los dominios extracelulares y transmembrana de CD4 humano fusionado al dominio intracelular de señalización CD3 ζ (denominado el CD4ζCAR). CD4ζCAR expresa en las células CD8 T pueden reconocer envoltura del VIH y desencadenar una respuesta de células T citotóxicas que es similar a la mediada por un receptor de células T 7. Recientemente hemos demostrado que HSCs humanas se pueden modificar con CD4ζCAR, que puede diferenciarse en múltiples li hematopoyéticoneages, incluyendo las células T funcionales capaces de suprimir la replicación del VIH en el modelo de ratón humanizado 8. Con el rápido avance en las terapias de los receptores de antígeno quiméricos para el cáncer de 9, y la caracterización en curso de anticuerpos neutralizantes amplias potentes 10-12 contra el VIH que permiten la construcción de las CAR de anticuerpos de cadena única, es perceptible que muchos nuevos constructos candidatos, además de CD4ζCAR , será generado y probado para la terapia génica basada en células madre de enfermedades de VIH y otras enfermedades. Además, el modelo de ratón humanizado GSN-BLT que contiene estos coches específicos de antígeno también puede proporcionar una herramienta útil para examinar de cerca las respuestas de células T humanas in vivo. Es importante destacar que nuestro protocolo difiere de los métodos anteriores descritos para la construcción de humanizada de ratones BLT 13-15 en que el HSCs en mezcla de proteína gelatinosa se ​​utiliza en lugar de los troncos de hígado fetal 16. Este protocolo describe: 1) la construcción de humanilos ratones BLT zed ingeniería con CD4ζCAR; y 2) la caracterización de la diferenciación de las células modificadas genéticamente; y 3) la caracterización de la funcionalidad de las células modificadas genéticamente.

<table><tbody><tr><td>Kit de microperlas CD34</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>Para clasificar células progenitoras CD34+ humanas</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>Para congelar células</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>Para medir la carga viral en el suero</td></tr><tr><td>MACSQuant Citómetro de flujo</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>Para el análisis de flujo</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade;</td><td>BD biosciences</td><td>Para el análisis</td>de <td></td> flujo</tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&nbsp;</td><td>Para la digestión de tejidos</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&nbsp;</td><td>para la digestión de tejidos</td></tr><tr><td>Tecnología de la vida de la colagenasa</td><td></td><td>17104-019&nbsp;</td><td>para la digestión de tejidos</td></tr><tr><td>CFX Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Biorad</td><td></td><td>Para medir la carga viral y la expresión génica</td></tr><tr><td>Ratones, cepa NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>Para la construcción de ratones humanizados</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>Para el cultivo de células</td></tr><tr><td>Piperacilina/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone antimicótico)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>Pinzas para heridas Autoclip, 9 mm - 1.000 unidades</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&nbsp;</td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Batas quirúrgicas estériles Aurora reforzadas con polietileno, 30 por caja&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&nbsp;</td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Suturas, 4-0, vicryl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Owens y Minor</td><td>23000J304H&nbsp; &nbsp;</td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de alcohol&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Owens y Minor</td><td>3583006818</td><td>Para cirugía</td></tr><tr><td>Guantes, quirúrgicos, 6 1/2</td><td>Owens y Minor</td><td>4075711102</td><td>Para cirugía</td></tr><tr><td>Yssel' s Medio de células T sin suero Gemini</td><td>Bio-products</td><td>400-102</td><td>para la transducción de células CD34 +</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>para la transducción de células CD34+</td></tr></tbody></table>

-base de células madre inmunidad diseñado frente a la infección por vih en el modelo de ratón humanizado

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

Con el rápido desarrollo de terapias génicas basadas en células madre contra el VIH, no hay presión requisito de un modelo animal para estudiar la diferenciación hematopoyética y la función inmune de las células modificadas genéticamente. El humanizado de médula ósea / del hígado / timo (BLT) modelo de ratón permite la completa reconstitución de un sistema inmunológico humano en la periferia, que incluye las células T, células B, células NK y monocitos. El implante del timo humano también permite la selección tímica de las células T en el tejido tímico autólogo. Además del estudio de la infección por VIH, el modelo se presenta como una herramienta poderosa para estudiar la diferenciación, el desarrollo y la funcionalidad de las células derivadas de células madre hematopoyéticas (HSC). Aquí describimos la construcción de humanizado diabéticos no obesos (NOD) -severe inmunodeficiencia combinada (SCID) de la cadena gamma nocaut -común (c γ - / -) ratones -Bone ósea / hígado / timo (NSG-BLT) con HSC transducidas con receptor de antígeno quimérico CD4 (CD4CAR)vector lentivirus. Se demuestra que la CD4CAR HSC puede diferenciar con éxito en múltiples linajes y tienen actividad anti-VIH. El objetivo del estudio es demostrar el uso de modelo de ratón NSG-BLT como un modelo in vivo para la inmunidad contra el VIH ingeniería. Vale la pena señalar que, dado que se utiliza lentivirus y el tejido humano, los experimentos y las cirugías deben realizarse en una cabina de bioseguridad de clase II en un nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con precauciones especiales instalación (BSL2 +).

La Figura 1 muestra un esquema de la construcción de ratones humanizados BLT con células madre modificada. 10 semanas después de la cirugía de implante, se sacrificaron los ratones para evaluar la diferenciación y el desarrollo de células modificadas de genes. Como se muestra en la Figura 2, múltiples tejidos linfoides (sangre, bazo, timo y médula ósea) se recogieron de un ratón que se ha modificado con CD4ζCAR. El CD4ζCAR utilizado en este protocolo con...

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un ratón humanizado modificado con un receptor de antígeno quimérico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del VIH y la inmunología, relacionadas con la evaluación de la eficacia de la inmunidad modificada basada en células madre frente a la infección por VIH y otras infecciones crónicas y enfermedades malignas, así como con los mecanismos de fracaso inmunitario y las formas de potenciar el sistema inmunitario y desarrollar una terapia para lograr una inmunidad antiviral o antitumoral más eficaz.La principal ventaja de esta técnica es que permite un gran número de manipulaciones experimentales. El modelo de ratones BLT humanizados imita la inmunidad humana y, en este caso, posibilita pruebas preclínicas de terapias génicas basadas en células contra la infección por VIH. Realizarán el procedimiento Valerie Rezek y Brianna Lam, quienes son técnicas de mi laboratorio.Comience utilizando escalpelos para cortar el timo en pequeños trozos de aproximadamente un milímetro cúbico en un recipiente que contenga medio RPMI suplementado. Luego, utilice pinzas curvas romas para colocar cada trozo individual de timo

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La generación y caracterización de células T específicas de tumor en ratones humanizados se describe aquí. Tejido del timo humano y genéticamente modificados células madre hematopoyéticas son trasplantados en ratones inmunodeficientes. Esto da como resultado la reconstitución de una ingeniería del sistema inmune humano permitiendo examen in vivo de anti-tumor de la respuesta inmune.

Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical para generar ratones del sistema inmunitario humano

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

El video muestra una técnica para generar un modelo de ratón humanizado con inmunidad de ingeniería basada en células madre contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). El tejido del timo fetal humano y las células madre hematopoyéticas (HSC) modificadas genéticamente se implantan en la cápsula renal de un ratón gravemente inmunodeprimido. Las HSC, que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra el VIH, se mezclan en una mezcla de proteínas gelatinosas que promueve su...

Construcción de un modelo de ratón humanizado con inmunidad modificada contra el VIH

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

Hemos desarrollado un protocolo para la generación y evaluación de un modelo de ratón NOG infectado por el virus de inmunodeficiencia humana y humanizado basado en el trasplante de células madre, la exposición al virus de inmunodeficiencia humana intravaginal y el ARN PCR digital de gotas Cuantificación.

Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal

Este protocolo describe un método novedoso para administrar medicamentos antirretrovirales combinados orales que suprimen con éxito la replicación del ARN del VIH-1 en ratones humanizados.

Tratamiento antirretroviral combinado oral en ratones humanizados infectados con VIH-1

Este protocolo describe la generación de ratones del sistema inmune humano (HIS) para estudios de inmunooncología. Las instrucciones y consideraciones en el uso de este modelo para probar inmunoterapias humanas en tumores humanos implantados en este modelo se presentan con énfasis en la caracterización de la respuesta del sistema inmune humano al tumor.

Prueba de inmunoterapia contra el cáncer en un modelo de ratón humanizado con tumores humanos

Aprende a construir un modelo de ratón humanizado BLT con inmunidad diseñada contra el VIH usando células madre CD34+. Este método permite evaluar terapias génicas en preclínica.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

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