-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

El objetivo general de este procedimiento es crear un ratón humanizado modificado con un receptor de antígeno quimérico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del VIH y la inmunología con respecto a las pruebas de la eficacia de la inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por el VIH y otras infecciones crónicas y neoplasias malignas. Como un mecanismo de insuficiencia inmunitaria y formas de mejorar el sistema inmunitario y desarrollar una terapia para crear una mejor inmunidad antiviral o antitumoral.

La principal ventaja de esta técnica es que es capaz de realizar una gran cantidad de manipulaciones experimentales. El modelo de ratones BLT humanizados imita la inmunidad humana y, en este caso, permite realizar pruebas preclínicas de terapias génicas basadas en células contra la infección por VIH. Las que demuestren el procedimiento serán Valerie Rezek y Brianna Lam, ellas son técnicas de mi laboratorio.

Comience usando bisturíes para cortar el timo en trozos pequeños de aproximadamente un milímetro cubados en un plato que contenga medio RPMI suplementado. Luego usó pinzas romas curvas para colocar cada pieza de timo en un solo pocillo en una placa de 96 pocillos. Agregue de 100 a 200 microlitros de medio a todos los pocillos para que el tejido no se seque.

Visualice el tejido bajo el microscopio para eliminar cualquier tejido que no sea timo o que tenga tejido conectivo adherido. A continuación, retire los trozos confirmados de timo y combínelos en un matraz de cultivo celular T25. Agregue siete mililitros de medios RPMI suplementados con antibióticos al matraz y mezcle suavemente.

A continuación, coloque el matraz en la incubadora de cultivo de tejidos. Este paso evita la contaminación bacteriana del tejido. Comience el aislamiento de las HSC CD34 positivas del hígado fetal mediante el uso de dos bisturíes para cortar el hígado en trozos pequeños de unos tres milímetros cúbicos en una placa que contenga IMDM.

Retire y deseche cualquier tejido conectivo blanco. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja roma de calibre 16 para extraer las piezas de hígado y los medios y transferirlos a un tubo cónico de 50 mililitros. Recoger y expulsar suavemente de cinco a siete veces más para homogeneizar completamente el tejido.

Después de preparar 10 mililitros de medios IMDM, compleméntelo con colagenasa, hialuronidasa, antibióticos, Dnase y antifúngicos. Pase el medio a través de un filtro de 0,22 micras. A continuación, añada el medio filtrado a la suspensión hepática.

Después de tapar el tubo cónico de 50 mililitros que contiene la suspensión hepática, selle herméticamente con una película autosellante como parafilm para evitar fugas. Gire en un rotador de tubo en la incubadora a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la incubación, filtre la suspensión celular digerida a través de un colador de células de 100 micras en un tubo nuevo de 50 mililitros.

Agregue PBS a la suspensión para aumentar el volumen total a 50 mililitros. Divídelo en dos tubos de 50 mililitros, cada uno de los cuales contiene 25 mililitros de suspensión celular. Ralentizar y subyacer suavemente las células de cada tubo con 10 mililitros de un medio de centrifugación de densidad, como Ficoll.

Girar a 1200 veces g durante 20 minutos sin descanso. Después de la centrifugación, retire con cuidado la interfaz de cada tubo y transfiéralo a dos tubos separados de 50 mililitros. Lleve el volumen de cada tubo de interfaz hasta 50 mililitros con PBS.

Y luego centrifugar a 300 veces g durante siete a 10 minutos. Combine y lave los gránulos de celda tres veces con 50 mililitros de PBS que contengan un dos por ciento de FBS, girando a 300 veces g durante siete a 10 minutos cada vez. Después del centrifugado final, vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de medios RPMI más un 10 por ciento de FBS.

Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, clasifique las células CD34 positivas inmediatamente utilizando un kit de clasificación de CD34 de acuerdo con el protocolo del fabricante y guarde tanto la fracción CD34 positiva como la CD34 negativa. Vierta los trozos de timo y el medio del matraz en un plato de 60 milímetros.

Enfríe algunas puntas de pipeta de desplazamiento positivo colocándolas en tubos estériles abiertos de 1,5 mililitros con tapón de rosca sobre hielo. Además, coloque los gránulos de células y un volumen de mezcla de proteínas gelatinosas, como matrigel, en hielo. Anestesiar a los ratones receptores con un anestésico inyectable de acuerdo con un protocolo animal aprobado.

Compruebe el nivel de anestesia del ratón apretando una pata. La ausencia de una reacción al pellizco indica un plano quirúrgico de anestesia. Afeita el lado izquierdo de cada ratón desde la cadera hasta el hombro entre el centro de la espalda y el estómago.

Por vía subcutánea, inyecte seis miligramos por kilogramo de carprofeno diluido en el hombro o triángulo inguinal del animal. Enjuague la cánula del trócar con PBS en un plato de 60 milímetros. Con un par de pinzas curvas romas, coloque un trozo de timo del plato de 60 milímetros justo dentro de la abertura de la cánula, luego tire hacia atrás del trócar para aspirar el tejido en la cánula.

A continuación, utilice una pipeta de desplazamiento positivo y una punta refrigerada para añadir cinco microlitros de mezcla de proteínas gelatinosas frías en el tubo con el pellet de células. Y remover suavemente para generar la suspensión celular. Pipetee la suspensión de la celda en la abertura de la cánula y tire lentamente hacia atrás del trócar para cargar la aguja.

Frote tres veces la zona afeitada del ratón con povidona yodada seguida de isopropenilo. Determine el punto más oscuro debajo de la piel que indica la ubicación del bazo. El riñón mide aproximadamente cinco milímetros dorsal al bazo.

Después de asegurar un nivel adecuado de anestesia por la ausencia de una reacción del pellizco de la pata, use pinzas curvas para levantar la piel y use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 15 milímetros en la piel paralela al bazo. A continuación, haz un corte similar en la capa del peritoneo que se encuentra debajo. En los hombres, el riñón es fácilmente visible, por lo que se extruye simplemente presionando el abdomen.

Sostenga el riñón con un hemostático o un par de pinzas romas curvas. En las mujeres, los ovarios tienden a bloquear el riñón para que no sea fácil de extraer. Con un hemostático, levante el ovario y exponga cuidadosamente el riñón.

Use pinzas con punta de aguja para hacer un pequeño orificio en el extremo posterior de la cápsula renal. Deslice el trócar en este orificio y a lo largo del riñón hasta que la abertura de la cánula esté completamente cubierta por la cápsula renal. Extruya suavemente el tejido debajo de la cápsula renal y tire del trócar hacia afuera.

Use las pinzas curvas para asegurarse de que la pieza del timo no se salga con la aguja. A continuación, levante el peritoneo con las pinzas y utilice suavemente el hemostático para empujar el riñón de nuevo a su lugar. Ate un punto de doble nudo con sutura quirúrgica en el peritoneo.

Coloque también dos pinzas Autoclips para heridas para cerrar la piel. Ahora mezcle las células CD34 positivas transducidas y aspire 0,5 veces 10 a las seis células en un volumen de 100 microlitros en una jeringa de insulina. Inyecte estas células en el ratón a través de una inyección de vena retroorbitaria.

Después de la inyección, frote una pequeña gota de lubricante ocular en cada ojo y coloque al ratón boca arriba en una jaula. Después de implantar a todos los ratones, confirme que los animales han recuperado la conciencia y son ambulatorios antes de devolverlos a la sala de alojamiento. Los ratones fueron sacrificados 10 semanas después de la cirugía y se extrajeron sangre, bazo, timo y médula ósea.

Las células resultantes se tiñeron con anticuerpos anti-CD45 humano y anti-CD4 humano y se analizaron mediante citometría de flujo. Como se ve aquí, las células modificadas con el receptor de antígeno quimérico CD4 se pueden detectar en múltiples tejidos linfoides mediante citometría de flujo. Las células modificadas con el receptor de antígeno quimérico CD4 pueden diferenciarse en múltiples linajes.

Aquí, se recolectaron esplenocitos de ratones modificados con receptor de antígeno quimérico CD4 y se tiñeron para marcadores de células T y B. Las células negativas para los marcadores de células T y B fueron positivas para los marcadores de monocitos y macrófagos y para las células asesinas naturales. Los esplenocitos de ratones con receptor de antígeno quimérico CD4 infectados por el VIH fueron estimulados con células T one infectadas o no infectadas por el VIH y se muestra su producción intracelular de citocinas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir ratones BLT humanizados modificados con receptores de antígenos quiméricos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar a un ritmo constante y prestar mucha atención al estado del mouse que se está operando.

Para los principiantes, es importante practicar la cirugía y las inyecciones oculares antes de trabajar con tejidos y células madre que son más valiosos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH y otras enfermedades infecciosas exploraran la patogénesis de la enfermedad y las terapias basadas en el sistema inmunológico en el modelo de ratón humanizado.