Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

El objetivo general de este método es generar un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de sangre y líquido cefalorraquídeo humano. Permitiendo el estudio de infecciones bacterianas desde el lado basal-lateral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las enfermedades infecciosas del Sistema Nervioso Central, como qué procesos están involucrados durante las interacciones bacterianas con el epitelio del plexo coroideo.

La principal ventaja de esta técnica es que permite analizar las interacciones de los patógenos con el lado negro lateral basal de las células epiteliales. Este método también se puede aplicar a otros estudios, como la investigación de la transmigración de las células inmunitarias y las células tumorales a través del epitelio del plexo coroideo. La primera vez que tuve la idea de usar el papiloma del plexo cocoide humano, o células HIBCCP para este método, fue cuando leí el manuscrito de 2005 de Shibata et.al.

describiendo la línea celular. Comience usando pinzas estériles para colocar insertos de filtro de cultivo celular de área de crecimiento de 0,33 centímetros cuadrados, con poros de tres micras boca abajo en pocillos individuales de una placa de doce pocillos. A continuación, con una pipeta serológica, inundar el pocillo con unos tres mililitros del medio precalentado, aspirando cualquier solución extra, hasta que el compartimento inferior esté lleno.

A continuación, agregue 100 micrómetros de medio de subcultivo de 37 grados complementado con un diez por ciento de FCS en la parte superior del filtro. A la hora de añadir el medio es muy importante evitar la generación de burbujas de aire, ya que las burbujas impedirán que las células se alimenten lo suficiente. Cuando se haya agregado el medio a todos los insertos, cubra la placa y transfiera los insertos a una incubadora de CO2 al cinco por ciento a 37 grados Celsius.

Ahora, lave un matraz de células HIBCPP con diez mililitros de PVS, dos veces con remolino. Después del segundo lavado, agregue tres mililitros de 0.25 por ciento de tripsyn EDTA a las celdas y agite el matraz. Luego, incuba las células durante unos veinte minutos.

Al final de la incubación, confirme que las células se han levantado del fondo del matraz y muestran una forma redonda. Las células no se separan completamente entre sí y a menudo se encuentran en aglomerados. Vuelva a suspender el cultivo con 17 mililitros de medio para detener la reacción y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros.

Luego, gire las celdas hacia abajo y vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de medio para contar. A continuación, diluya las células a una concentración de uno por diez a la sexta célula por mililitro, e invierta el tubo para distribuir uniformemente las células. Luego, agregue 80 micro litros de celdas en la parte superior de cada inserto de filtro.

Cuando se hayan sembrado todos los insertos, cubra la placa y devuélvala a la incubadora para el cultivo durante la noche. Al día siguiente, agregue un mililitro de medio a cada pocillo de un plato de 24 pocillos. Luego, con pinzas, levante cada inserto y deseche el medio en el interior, colocando los insertos con el lado derecho hacia arriba en pocillos individuales de la placa de 24 pocillos.

Cuando los insertos del filtro se voltean de la placa de 12 pocillos a la placa de 24 pocillos, tenga cuidado de no tocar la membrana del filtro con las células que crecen en la parte superior. Llene los insertos con 0,5 mililitros de medio fresco y devuelva la placa a la incubadora. Transfiera los insertos a una nueva placa de 24 pocillos con medio fresco cada dos días, reemplazando así el medio en el compartimiento superior.

Para medir la resistencia eléctrica transepitelial, o TEER de las celdas, primero sumerja las puntas de los electrodos de un voltímetro-ohmio de tejido epitelial en etanol al 80 por ciento. Después de 15 minutos, retire el electrodo del etanol para permitir que el electrodo se seque. Luego, coloque las puntas en una alícuota de medio de subcultivo durante otros 15 minutos.

Cuando el electrodo se haya equilibrado, coloque el brazo más largo de modo que toque la parte inferior del compartimento inferior de un pocillo de la placa de cultivo celular, y el brazo más corto de modo que llegue al compartimento del inserto del filtro. Mida los valores de resistencia de los insertos de filtro de cultivo celular en medio sin celdas para obtener los valores en blanco. A continuación, mida el TEER de cada uno de los insertos sembrados.

Después de medir, vuelva a colocar el electrodo en etanol al 80 por ciento durante 15 minutos, seguido de almacenamiento en un tubo seco. Cuando los valores de TEER de los insertos sembrados por HIBCPP superen los 70 ohmios por centímetro cuadrado, renueve el medio utilizando un medio de cultivo fresco suplementado con cinco microgramos por mililitro de insulina y uno por ciento de FCS, y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante la noche. Para determinar la permeabilidad paracelular de los cultivos de insertos, agregue 50 microgramos por mililitro de inulina FITC recién preparada en un medio de cultivo bajo de suero fresco al compartimiento superior del filtro de cada inserto y devuelva las células a la incubadora.

Cuando los cultivos hayan alcanzado un TEER de alrededor de 500 ohmios por centímetro cuadrado, infecte las células con una suspensión bacteriana de interés a una multiplicidad de infección de diez, y devuelva las células a la incubadora durante el período de cultivo apropiado. Luego, lave las celdas tres veces transfiriendo el filtro a un nuevo pocillo con un mililitro de medio libre de suero. Cada vez, coloque el medio en el compartimiento del filtro con 500 microlitros del mismo medio, finalmente, determine la concentración de inulina que pasó desde el compartimiento del filtro a través de la capa celular después de la infección bacteriana recolectando muestras de medio del pocillo inferior de cada inserto de filtro de cultivo celular y midiendo todas las muestras en un lector de microplacas contra diez diluciones estándar de inulina FITC y dos.

Las células HIBCCP exhiben funciones de barrera específicas que les permiten restringir sus intercambios moleculares en un grado modesto. Por ejemplo, los análisis inmunofluorescentes de la unión tipo asociada con la proteína, ZO-1, Ocludin y Claudin-1, revelan una señal ininterrumpida en los sitios de contacto de célula a célula. Ilustrando la interconexión de las células mediante hebras continuas de uniones estrechas.

Cuando se cultivan en las condiciones adecuadas, las células HIBCPP muestran un alto potencial de membrana, que alcanza hasta aproximadamente 500 ohmios por centímetro cuadrado sin tratamiento, manteniendo las funciones de barrera típicas de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo, como la formación de un potencial de membrana, así como una baja permeabilidad para las macromoléculas. Sin embargo, a medida que se aplican concentraciones crecientes de DMSO, los valores de TEER disminuyen de manera dependiente de la dosis, con una caída significativa similar en el valor de TEER observado después del tratamiento con citochalasina D. Además, la adición de un dos por ciento de volumen de DMSO, o citocalasina D, da como resultado un aumento significativo de la permeabilidad correspondiente para el flujo de inulina FITC.

Además, la infección bacteriana de las células HIBCCP da lugar a una invasión significativa de la capa celular por dos cepas bacterianas patógenas. MC58, y su mutante deficiente en cápsulas. Mientras que solo se observa una invasión menor para la cepa alfa 14 apatógena.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe tocar la membrana del filtro después de sembrar las células, ya que la capa intacta de HIBCCP se interrumpirá por el contacto. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de transmigración in vitro, para responder preguntas adicionales sobre los mecanismos de migración de las células inmunitarias y tumorales a través de las células epiteliales del plexo coroideo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la farmacología exploraran la transferencia de sustratos a través del epitelio del plexo coroideo in vitro.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un modelo basado en células HIBCCP de la barrera de sangre y líquido cefalorraquídeo para la infección lateral basal con patógenos. No olvide que trabajar con patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar bajo una capucha de seguridad adecuada, al realizar este procedimiento.