Name: Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a generar un modelo de barrera hematoencefálica con células epiteliales del plexo coroideo HIBCPP para estudiar infecciones bacterianas desde el lado basolateral. Este método permite analizar interacciones patógeno-epitelio.

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Los autores desean agradecer al Prof. Hartwig Wolburg por realizar la microscopía electrónica.

1. Preparar los elementos filtrantes de cultivo celular para células Siembra HIBCPP en un sistema invertido Modelo <ol><li> Pre-caliente DMEM / F12 (HAM) suplementado con 5 mg / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 10% de suero de ternera fetal (FCS). </li><li> El uso de fórceps estériles para colocar en la zona de crecimiento de los cartuchos de filtro cultivo de células de 0,33 cm² con un tamaño de poro de 3 micras boca abajo en una placa de 12 pocillos (Figura 1E). </li><li> Llenar medio en el compartimento inferior del filtro de inserción de cultivo de células (alrededor de 3 ml) y 100 l en la parte superior del inserto de filtro. Inundar la placa, así como el compartimiento inferior con el medio. Aspirar el medio excesiva de tal manera que el compartimiento inferior del inserto de filtro permanece lleno (Figura 1E). Nota: Se recomienda utilizar una pipeta serológica para este paso. </li><li> Cubrir la placa de 12 pocillos con la tapa y transferir los insertos de filtro de cultivo celular preparado a la incubadora, 37 ° C,5% de CO 2 hasta la adición de las células. </li></ol> 2. Cultivo y pases de células HIBCPP <ol><li> Preparar DMEM / F12 (HAM) suplementado con 5 g / ml, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 10% FCS. </li><li> Pre-caliente medio y PBS en un baño de agua a 37 °. Aspirar medio del frasco. Añadir 10 ml de PBS al matraz y remolino. Repita este paso una vez. </li><li> Añadir 3 ml 0,25% de tripsina-EDTA al matraz y remolino. Colocar en la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Después de aproximadamente 20 minutos sacar el matraz de la incubadora. Asegúrese de que las células se separan del fondo del matraz y muestran una forma redonda cuando encuestados con el microscopio. Nota: Las células no se separan completamente una de otra y se encuentran a menudo en los aglomerados. Se recomienda el uso de las células hasta el paso 38. </li><li> Para detener la tripsinización añadir 17 ml de medio. Resuspender las células pipeteando arriba y abajo y transferir la suspensiónen un tubo de 50 ml. Centrifugar a 50 xg durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células en un volumen apropiado de medio y contar las células usando un hemocitómetro. Nota: La concentración de las células resuspendidas HIBCPP debe ser de 1 x 10 6 células / ml. Para el mantenimiento de las células HIBCPP se sugiere para transferir una cantidad de 1-6 x 10 6 células en 10 ml de medio a un T75-matraz. Cambio de medio cada segundo día. </li></ol> 3. Siembra de insertos de cultivo celular invertida de filtro con células HIBCPP <ol><li> En la parte superior de cada elemento filtrante invertida (es decir, el lado inferior del filtro) añadir 80 l de suspensión de células (es decir. 8 x 10 4 células) (Figura 1E). Nota: Asegúrese de que las células se distribuyen de manera uniforme en la suspensión invirtiendo el tubo antes de la siembra. </li><li> Cubrir los insertos de filtro de cultivo sembrado de células con la tapa de la placa de 12 pocillos y la transferencia a la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> En el primer día, llenar 1 ml de medio en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Levantar los elementos filtrantes de cultivo de células mediante el uso de fórceps fuera de la placa de 12 pocillos, se elimina el medio en el interior, a su vez los elementos filtrantes y colocarlos en la orientación estándar en la placa de 24 pocillos preparada (Figura 1E). </li><li> Colocar las células en medio fresco cada dos días. Preparar 24 pocillos con medio fresco y transferir los insertos de filtro a la misma. Llenar inserciones con 0,5 ml de medio fresco. Compruebe TEER todos los días como se describe en la sección 4. </li><li> Cuando los valores de TEER de HIBCPP células sembradas en insertos de cultivo celular supera el 70 Ω x cm² (aproximadamente 4 días después de la siembra), y luego continuar el cultivo de células en un medio que contiene 1% de FCS y 5 mg / ml de insulina. Preparar placas de 24 pocillos con 1 ml de medio de cada pocillo. Transferencia de elementos filtrantes a los pocillos preparados y medio de intercambio en el compartimiento superior. Nota: Esta retirada del suero después de la confluencia conduce a la formación deun potencial de membrana superior. </li><li> Aspirar medio del compartimiento del filtro, traslado al bien preparado y rellenar con 500 l de medio. Repita este paso una vez. Poner las células durante la noche en la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 4. La medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) <ol><li> Sumergir las puntas de los electrodos de voltohmmeter tejido epitelial durante 15 min en 80% de etanol. Transferir voltohmmeter bajo el capó y dejar que seque el electrodo por un momento. Coloque electrodo en medio de cultivo respectivo utilizado para las células durante otros 15 min para equilibrar. </li><li> Realizar mediciones colocando el brazo más largo del electrodo de modo que toque la parte inferior del compartimiento inferior cada vez, coloque el brazo más corto en el compartimento de inserción del filtro. Nota: Los valores de resistencia de los cartuchos de filtro de cultivo celular sin células en el medio se debe utilizar como valores en blanco ((valor medido (Ω) - valor en blanco (Ω)) x Filtrosuperficie (es decir, 0,33 cm $ ² $)). </li><li> Después de medir lugar el electrodo de nuevo en 80% de etanol durante 15 min. Almacenar en un tubo seco. </li></ol> 5. Determinación de la permeabilidad paracelular <ol><li> Disolver 1 g FITC-inulina en 200 ml de medio de cultivo suplementado con 5 mg / ml de insulina 1% de FCS. Aplicar 50 mg / ml de la solución en el compartimento superior del filtro antes de la infección de las células. </li><li> Después de la infección recoger muestras de medio desde el pozo inferior para determinar la cantidad de inulina pasa desde el compartimiento del filtro a través de la capa de células. </li><li> Preparar una solución estándar FITC-inulina y llevar a cabo diluciones 1: 2, 10 veces (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% y 0%) . Detectar la fluorescencia mediante la medición de todas las muestras en un lector de microplacas. </li></ol> 6. Preparación de bacterias para la infección de células en cultivo celular HIBCPP Filtrar insertos <ol><li> Un día antes del experimento, rascado tél N. congelada meningitidis cepas de una glicerol-social y consecutivas a cabo en agar chocolate con Vitox. Crecer durante la noche en la incubadora, a 37 ° C, con 5% de CO 2. </li><li> Extraer 20-30 colonias del cultivo durante la noche y transferir a un tubo que contiene 8 ml Proteosa Peptona medio suplementado con 0,042% de NaHCO3, 0,01 M MgCl 2 y 1% Polyvitex. </li><li> Agitar las bacterias durante 1,25 horas a 220 rpm, 37 ° C. Sedimentar las bacterias por centrifugación a 2684 g durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano con medio libre de suero 8 ml. Vórtice para asegurar una suspensión uniforme. </li><li> Para determinar la densidad de cultivo, medir una dilución de 1:10 en una densidad óptica (DO) de 600 nm. Ajustar la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,1. Nota: Esta suspensión contiene aprox. 1 x 10 8 UFC / ml. </li><li> Para confirmar la concentración de células bacterianas, se diluye la suspensión por pasos (01:10) hasta unadilución de 10 -5 y placa sobre placas de agar chocolate. Nota: diluciones seriadas similares necesitan ser realizados para calcular las curvas de crecimiento bacteriano. </li></ol> 7. Infección de células en cultivo celular HIBCPP filtro inserciones y Determinación de la invasión bacteriana por inmunofluorescencia doble <ol><li> Después de continuar el cultivo de células en medio que contiene 1% de FCS y 5 mg / ml de insulina, medir las células cada día usando un voltohmmeter tejido epitelial. Si las células han alcanzado un TEER de alrededor de 500 Ω x cm², llevar a cabo la infección. </li><li> Infectar las células con la suspensión bacteriana preparada a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Tienda de las células infectadas en la incubadora, a 37 ° C, con 5% de CO 2 durante el período de tiempo indicado. Nota: La MOI se puede calcular teniendo en cuenta el número de células por filtro de inserto de cultivo celular a confluencia (1,21 x 10 6 células / cm 2). </li><li> Detener el Infection lavando tres veces con 500 l de medio libre de suero (SFM) que contiene albúmina de suero bovino 1% (BSA) aplicada al compartimiento del filtro, 1 ml para el compartimiento inferior. </li><li> Bloquear con 500 l SFM que contenía tampón de BSA 1% en el compartimiento del filtro y 1 ml en el compartimiento inferior para 20 min a temperatura ambiente para evitar la adherencia de los anticuerpos a los sitios de unión no específica. </li><li> Incubar con 100 l de anticuerpo primario contra N. meningitidis α-OMP (1: 200) en el compartimiento del filtro y 500 l en el compartimiento inferior para 20 min a temperatura ambiente. Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada. </li><li> Se lavan las células aspirando el medio desde el compartimiento del filtro, transferir el elemento filtrante a una SFM bien con 1 ml de preparado que contiene 1% de BSA y llenar el compartimiento del filtro de vaciado con SFM 500 l que contiene 1% de BSA. Repita este paso dos veces. </li><li> Fijar las células con 500 l 4% de formaldehído en el filtro de compartamento, 1 ml en el compartimiento inferior durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Se lavan las células aspirando el medio desde el compartimiento del filtro, transferir el elemento filtrante a un bien preparado con 1 ml de PBS y llenar el compartimiento del filtro de vaciado con 500 l de PBS. Repita este paso una vez. Nota: Las muestras pueden ser almacenadas durante la noche en PBS a 4 ° C. </li><li> Cut cultivo celular fijo filtra de los insertos y se lava con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. Se incuban las células durante 15 min a temperatura ambiente con 250 l fluorescente marcada (longitud de onda de excitación 594 nm) de pollo anticuerpo secundario anti conejo (1: 500) para teñir las bacterias extracelulares. Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada. </li><li> Permeabilizar las células con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA y 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. </li><li> Incubar con 250 l de anticuerpo primario contra N. meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) durante 30 minutos para teñir bacterias extra e intracelulares. Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. </li><li> Aplicar 250 l de marcado fluorescente (excitación de longitud de onda 488 nm) anticuerpo secundario (1: 500), marcado fluorescente (excitación de longitud de onda 660 nm) faloidina (1: 250) y 4 &#39;, dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ( 1: 50000) durante 1 hora a temperatura ambiente para teñir bacterias extra e intracelulares, citoesqueleto de actina y núcleos. Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada. </li><li> Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. Incrustar las células en el medio y se almacena a 4 ° C hasta que el examen de montaje a través del microscopio. </li><li> Determinar el número de bacterias invadidas por campo predefinido. Para ello, contando 20 campos por filtro de membrana. Calcular el porcentaje de bacterias invadidas. Nota: Multiplicar el número de bacterias media de los 20 campos microscópicos con un área de Coefficient. El resultado se expresa la cantidad de bacterias totales presentes en un filtro de cultivo de células de inserción 0,33 cm². Divida este valor por la cantidad de bacterias cultivadas en medios durante la duración de la infección. </li></ol>

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<li>Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+T-cells+after+infection+of+human+choroid+plexus+papilloma+cells+with+Echovirus+30+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Virus Res. 170, 66-74 (2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las células epiteliales de la CP forman la BCSFB que separa el CSF desde el 2,3 sangre. Recientemente se estableció la línea celular HIBCPP como un modelo humano funcional de la BCSFB. Las células muestran importantes funciones de barrera de la BCSFB in vitro, incluyendo el desarrollo de un alto potencial de membrana, una baja permeabilidad para las macromoléculas, así como la presencia de hebras continuas de TJs 5. Las proteínas TJ contribuyen a una polaridad apical / basolateral de las c...

La barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB) es uno de los tres sitios de barrera entre la sangre y el cerebro 1. Su correlato morfológico son las células epiteliales del plexo coroideo (CP) 2,3, un convoluta endotelial-epitelial, que es fuertemente vascularizada y situado en los ventrículos del cerebro. El CP sirve para producir el líquido cefalorraquídeo (CSF), así como para separar esta última de la sangre. Con el fin de lograr la función de barrera, las células epiteliales CP muestran una actividad pinocíticas baja, expresan transportadores específicos, y están densamente conectadas por una red continua de las uniones estrechas (TJs) 2,3. Las células humanas del papiloma del plexo coroideo (HIBCPP), derivado de un papiloma del plexo coroideo maligna de una mujer japonesa 4, se utilizaron para construir un modelo funcional en vitro de la BCSFB. HIBCPP células muestran un par de características de un BCSFB funcional como la formación de TJhebras, el desarrollo de un potencial de membrana de alta transepitelial que puede ser determinado como la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), y permeabilidades menores de macromoléculas. Por otra parte, las células expresan transportadores HIBCPP característicos, que pueden servir para regular el microambiente iónica, y mostrar apical / basolateral 5,6,7 polaridad. El BCSFB se ha demostrado que funcionan como un sitio de entrada para los patógenos (bacterias, virus y hongos) en el sistema nervioso central (CNS) 8. La invasión de patógenos, incluyendo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), una bacteria Gram-negativas, puede causar enfermedades graves como la meningitis. La evidencia de que supera la barrera del epitelio de protección de la CP es apoyado por observaciones histopatológicas en pacientes con enfermedad meningocócica que exhibe una mayor cantidad de meningococos en los vasos y células epiteliales CP 9,10. Para poder entrar en las células huésped bacteria menudo secuestrar mecanismos endocytotic, que están mediadas o provocados por los receptores de superficie específicos localizados en las células huésped. Dado que las interacciones de patógenos con estos receptores pueden ser especies modelos 11, específicas de animales sólo pueden ser consultados en un grado limitado. La línea celular HIBCPP ofrece la oportunidad de estudiar el proceso de invasión, así como los mecanismos moleculares subyacentes en un sistema modelo humano. El empleo de insertos de cultivo celular nos permite analizar las interacciones de los agentes patógenos con células huésped desde dos lados distintos. Muchas bacterias, incluyendo N. meningitidis, están firmemente sujeto a los efectos de la gravedad durante ensayos de la infección. Para la interacción óptima de patógenos con las células HIBCPP durante los ensayos, las bacterias se añaden inicialmente en el compartimento superior del sistema de inserción de filtro de cultivo celular. Para permitir la infección de la apical o el lado basolateral de células, respectivamente, dos variaciones del sistema in vitro han sido thiscidos: En el sistema estándar células HIBCPP se siembran en el compartimiento superior del inserto de filtro, imitando la situación cuando los microorganismos se encuentran en el lado del CSF y se meten en contacto con el lado apical de las células (Figura 1A, C). Por el contrario, el uso de las células HIBCPP en un sistema de filtro de inserto de cultivo celular invertida refleja las condiciones cuando las bacterias han entrado en la corriente sanguínea. Los microorganismos difunden en la sangre y las células epiteliales CP encuentro desde el lado basolateral (Figura 1 B, C). Digno de mención, en este sistema modelo se ha demostrado que las bacterias invaden las células HIBCPP de una manera polar específicamente del 5,7 lado celular basolateral. Posteriormente a la infección de la CP, los patógenos invadido pueden ser reconocidos por el sistema inmune innato a través de la ligadura a receptores de reconocimiento de patrones (PRR). los miembros descritos bien de los derechos y responsabilidades parentales pertenecen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR). TLRs puede cubod para estructuras características de los microorganismos infecciosos, que son patrones moleculares asociados a patógenos (denominado PAMPS). La ligación de los receptores conduce a la activación de la célula huésped cascadas de señalización que activan la expresión de citocinas y quimiocinas 12, que a su vez estimulan la transmigración de las células inmunes a través de la BCSFB 13,14. Se ha demostrado que las células HIBCPP expresan varios TLRs a nivel de mRNA y que la infección con N. meningitidis resulta en la secreción de varias citocinas y quimiocinas, incluyendo CXCL1-3, IL6, IL8 y TNF 15,16. A continuación, describimos el cultivo y la infección de la línea celular humana HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida que imita la BCSFB. Este sistema modelo permite estudiar las interacciones de patógenos con el lado in vivo relevante celular basolateral, así como la respuesta celular posterior.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&agudo;,6 diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>Este anticuerpo fue un regalo de los Dres. H. Claus y U. Vogel (Universidad de W&uuml; rzburg, Alemania)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (pollo anti conejo)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (pollo anti conejo)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Platos de agar chocolate</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES sin Fenol</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals 1670049</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptona</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Medio sin suero</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular Thincert para placas de 24 pocillos, tamaño de poro 3 y micro; m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos 75 cm&sup2; tapa roja estéril</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Voltímetro-Ohm Millicell-ERS2 con electrodo MERSSTX01</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Las células epiteliales del plexo coroideo (CP), ubicadas en el sistema ventricular del cerebro, forman la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB). El BCSFB funciona separando el líquido cefalorraquídeo (LCR) de la sangre y restringiendo el intercambio molecular en un grado mínimo. Un modelo in vitro del BCSFB se basa en células derivadas de un papiloma del plexo coroideo humano (HIBCPP). Las células HIBCPP muestran funciones de barrera típicas, como la formación de uniones estrechas (TJ), el desarrollo de una resistencia eléctrica transepitelial (TEER), así como permeabilidades menores para las macromoléculas. Hay varios patógenos que pueden ingresar al sistema nervioso central (SNC) a través del BCSFB y, posteriormente, causar una enfermedad grave como la meningitis. Uno de estos patógenos es Neisseria meningitidis (N. meningitidis), una bacteria específica de humanos. El empleo de las células HIBCPP en un sistema de inserto de filtro de cultivo celular invertido permite estudiar las interacciones de los patógenos con las células del BCSFB desde el lado de la célula basolateral, lo cual es relevante in vivo. En este artículo, describimos la siembra y el cultivo de células HIBCPP en insertos de cultivo celular. Además, se demuestra la infección de las células con N. meningitidis junto con el análisis de las bacterias invadidas y adheridas mediante inmunofluorescencia doble. Dado que las células de la PC también están implicadas en otras enfermedades, incluidos los trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple, así como durante la metástasis cerebral de las células tumorales, el sistema modelo también puede aplicarse en otros campos de investigación. Ofrece el potencial de descifrar los mecanismos moleculares e identificar nuevas dianas terapéuticas.

Aquí se describe el cultivo y la infección de las células HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida. Este modelo nos permite estudiar los mecanismos de invasión y las vías de señalización molecular subyacente desde el lado basolateral de células, que reproduce una situación fisiológica de las bacterias que entran y difusión de las células epiteliales a través del torrente sanguíneo (Figura 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Las células epiteliales del plexo coroideo (CP) forman la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB). Un modelo in vitro del BCSFB emplea células de papiloma del plexo coroideo humano (HIBCPP). Este artículo describe el cultivo y la infección basolateral de células HIBCPP utilizando un sistema de inserción de filtro de cultivo celular.

Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

El objetivo general de este método es generar un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera hematoencefálica humano. Lo que permite el estudio de infecciones bacterianas desde el lado basal-lateral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre enfermedades infecciosas del Sistema Nervioso Central, como qué procesos están involucrados durante las interacciones bacterianas con el epitelio del plexo coroideo.La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de las interacciones de los patógenos con el lado basal lateral negro de las células epiteliales. Este método también puede aplicarse a otros estudios, como la investigación de la transmigración de células inmunitarias y células tumorales a través del epitelio del plexo coroideo. Tuve por primera vez la idea de utilizar el papiloma del plexo coroideo humano, o células HIBCCP, para este método cuando leí el manuscrito de Shibata et al. de 2005.que describa la línea celular. Comience utilizando fórceps estériles para colocar insertos de filtro para cultivo celular con un área de crecimiento de 0,33 centímetros cuadrados y con poros de tres micrones hacia abajo en cada pocillo individual de una placa de doce pocillos. Luego, con una pipeta serológica, llene el pocillo con aproximadamente tres mililitros del medio previamente calentado, aspirando cualquier solución sobrante, hasta que el compartimento inferior quede completamente lleno.A continuación, agregue 100 micrómetros de medio de subcultivo a 37 grados suplementado con diez por ciento de FCS sobre el filtro. Al agregar el medio, es muy importante evitar la formación de burbujas de aire, ya que las burbujas impedirán que las células se nutran adecuadamente. Una vez que se haya agregado el medio a todos los insertos, tape la placa y transfiera los insertos a un incubador con cinco por ciento de CO2 a 37 grados Celsius.Ahora, lave un frasco de células HIBCPP con diez mililitros de PVS, dos veces agitando suavemente. Después del segundo lavado, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 por ciento a las células y agite el frasco. Luego, incube las células durante aproximadamente veinte minutos.Al finalizar la incubación, confirme que las células se hayan desprendido del fondo del frasco y presenten una forma redondeada. Las células no se separan completamente entre sí y a menudo se encuentran en agregados. Re-suspenda el cultivo con 17 mililitros de medio para detener la reacción y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros.Luego, centrifugue las células y re-suspenda el precipitado en un volumen adecuado de medio para el recuento. A continuación, diluya las células hasta una concentración de un por diez elevado a seis células por mililitro y invierta el tubo para distribuir uniformemente las células. Luego, agregue 80 micro litros de células en la parte superior de cada inserto de filtro.Una vez sembrados todos los insertos, tape la placa y devuélvala al incubador para un cultivo nocturno. Al día siguiente, añada un mililitro de medio a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Luego, utilizando fórceps, levante cada inserto y deseche el medio interno, colocando los insertos con la cara superior hacia arriba en pocillos individuales de la placa de 24 pocillos.Cuando se transfieran los insertos con filtro de la placa de 12 pocillos a la placa de 24 pocillos, tenga cuidado de no tocar la membrana del filtro con las células que crecen en la parte superior. Llene los insertos con 0,5 mililitros de medio fresco y devuelva la placa al incubador. Transfiera los insertos a una nueva placa de 24 pocillos con medio fresco cada dos días, reemplazando así el medio en el compartimento superior.Para medir la resistencia eléctrica transepitelial, o TEER de las células, primero sumerja las puntas del electrodo de un medidor voltiohmetro de tejido epitelial en etanol al 80 por ciento. Después de 15 minutos, retire el electrodo del etanol para permitir que se seque. Luego, coloque las puntas en una alícuota de medio de subcultivo durante otros 15 minutos.Una vez que el electrodo haya alcanzado el equilibrio, coloque el brazo más largo de modo que toque el fondo del compartimento inferior de un pocillo de la placa de cultivo celular, y el brazo más corto de forma que alcance el compartimento del inserto de filtro. Mida los valores de resistencia de los insertos de filtro para cultivo celular en medio sin células para obtener los valores en blanco. Luego, mida la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de cada uno de los insertos sembrados.Después de la medición, coloque el electrodo nuevamente en etanol al 80 por ciento durante 15 minutos, seguido de almacenamiento en un tubo seco. Cuando los valores de TEER de los insertos sembrados con HIBCPP superen los 70 ohmios por centímetro cuadrado, renueve el medio utilizando medio de cultivo fresco suplementado con cinco microgramos por mililitro de insulina y un por ciento de suero bovino fetal (FCS), y devuelva la placa al incubador de cultivo celular durante la noche. Para determinar la permeabilidad paracelular de los cultivos en insertos, añada 50 microgramos por mililitro de inulina marcada con FITC recién preparada en medio de cultivo con bajo contenido de suero al compartimento superior del filtro de cada inserto, y devuelva las células al incubador.Cuando los cultivos hayan alcanzado una resistencia transepitelial (TEER) de aproximadamente 500 ohmios por centímetro cuadrado, infecte las células con una suspensión bacteriana de interés a una multiplicidad de infección de diez, y devuelva las células al incubador durante el período de cultivo adecuado. A continuación, lave las células tres veces transfiriendo el filtro a un nuevo pocillo con un mililitro de medio sin suero. Cada vez, coloque el medio en el compartimento del filtro con 500 microlitros del mismo medio. Finalmente, determine la concentración de inulina que pasó desde el compartimento del filtro a través de la capa celular después de la infección bacteriana, recolectando muestras de medio del pocillo inferior de cada inserto de filtro para cultivo celular y midiendo todas las muestras en un lector de microplacas frente a diez diluciones patrón de FITC-inulina uno y dos.Las células HIBCCP exhiben funciones de barrera específicas que les permiten restringir en cierta medida sus intercambios moleculares. Por ejemplo, los análisis por inmunofluorescencia de las uniones de tipo asociadas con las proteínas ZO-1, Occludina y Claudina-1 revelan una señal continua en los sitios de contacto entre célula y célula, lo que ilustra la interconexión de las células mediante estructuras continuas de uniones estrechas.Cuando se cultivan bajo condiciones adecuadas, las células HIBCPP presentan un alto potencial de membrana, que alcanza hasta aproximadamente 500 ohmios por centímetro cuadrado sin tratamiento, manteniendo las funciones típicas de barrera de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo, como la formación de un potencial de membrana, así como una baja permeabilidad para macromoléculas. Sin embargo, cuando se aplican concentraciones crecientes de DMSO, los valores de REPT disminuyen de forma dependiente de la dosis, con una caída significativa similar en el valor de REPT observada tras el tratamiento con citocalasina D. Además, la adición de dos por ciento en volumen de DMSO, o citocalasina D, provoca un aumento significativo correspondiente en la permeabilidad al flujo de FITC-inulina.Además, la infección bacteriana de las células HIBCCP provoca una invasión significativa de la capa celular por parte de dos cepas bacterianas patógenas: MC58 y su mutante deficiente en cápsula. En cambio, solo se observa una invasión menor para la cepa apatogénica alfa 14.Al realizar este procedimiento, es importante recordar no tocar la membrana de filtro después de sembrar las células, ya que el contacto alteraría la capa intacta de HIBCCP. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de transmigración in vitro, para responder preguntas adicionales sobre los mecanismos de migración de células inmunitarias y tumorales a través de las células epiteliales del plexo coroideo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la farmacología exploraran la transferencia de sustratos a través del epitelio del plexo coroideo in vitro.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un modelo celular HIBCCP basado en células de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo para infección basal lateral con patógenos. No olvide que trabajar con patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar bajo una campana de seguridad adecuada, al realizar este procedimiento.

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Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral (Video) | JoVE Journal

Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

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