Name: Anticuerpo especificidad de unión de Kappa (VK) Humanos (IgM) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (PSA) unido a NCAM como un estudio de caso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a identificar antígenos para anticuerpos IgM con potencial terapéutico mediante inmunoprecipitación y Western blot. Este método permite descubrir biomarcadores novedosos para cáncer y enfermedades del sistema nervioso central.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM092993, R01 NS048357 y R21 NS073684), la Fundación Nacional de Ciencia (concesión de carrera), el Premio de Minnesota Asociación de Biotecnología y Genómica Médica, la Sociedad Nacional de Esclerosis (CA1060A) y el Centro para la Ciencia Clínica Mayo Clínica y traslacional (CCATS). Los autores reconocen el apoyo de las fundaciones Applebaum, Hilton, Peterson y Sanford, la Luna y Marilyn Parque Fondo de Consejero y la familia McNeilus.

Las patentes de anticuerpos que promueven la remielinización y la reparación del SNC son emitidas y propiedad de Mayo Clinic. Los autores tienen un posible conflicto de intereses.

Autoanticuerpos IgM naturales humanos son atractivos candidatos para inmunoterapias y han demostrado potencial terapéutico para el tratamiento de diversas enfermedades incluyendo el cáncer y trastornos del SNC 1-7. Ventajosamente, estos anticuerpos no provocar una respuesta inmune en el que la generación de anticuerpos neutralizantes reduce sustancialmente la dosis terapéutica efectiva y eficacia. Es importante destacar que todos los anticuerpos con potencial terapéutico han sido del isotipo IgM y pertenecen al repertorio NAb 3-5,8,9,37,40,42-45. Un obstáculo importante para el potencial aplicación clínica de los anticuerpos IgM es la identificación de sus antígenos, que todavía no se determinaron en muchos casos. Las técnicas estándar empleadas para anticuerpos IgG a menudo no son aplicables para identificar el antígeno de una IgM. Este protocolo describe la identificación de PSA-NCAM como el antígeno para el anticuerpo IgM humano regenerativa HIgM12, eficaces en modelos animalesde la esclerosis múltiple y ALS 15-18. La metodología utilizada es principalmente aplicable a todos los anticuerpos humanos con cadenas específicas de luz VK VκI, VκIII y VκIV y anticuerpos de ratón con cadenas ligeras VκI, independientemente de isotipo de anticuerpo. El paso más crítico en este protocolo es el uso de anticuerpos IgM en aplicaciones de cromatografía de afinidad. Más específicamente, se requieren anticuerpos exitosas para actuar como agentes desplegables en inmunoprecipitaciones para aislar o enriquecer un antígeno de complejos tejido o células de la cultura lisados. fracciones de antígeno enriquecidos pueden compararse con las inmunoprecipitaciones de anticuerpos de control de isotipo y posteriormente analizados para diferencias por espectrometría de masas. Un requisito esencial o limitación de este paso es la presencia del anticuerpo correcta VK cadena ligera y host (humana, de ratón) para permitir la unión a la proteína L agarosa anticuerpo. El uso de la proteína de unión a manosa unida a agarosa (también called lectina de unión a manosa) en lugar de la proteína L agarosa es una alternativa potencial para inmunoprecipitar las IgM específicas sin cadenas ligeras VK. Sin embargo, como se indica por Arnold et al. 35, los anticuerpos IgM unido al antígeno no se unen a la proteína de unión a manano, como los glicanos objetivo parecen ser inaccesible una vez que el IgM se ha unido a su antígeno. Basándose en estos hallazgos manano-proteína de unión no se puede utilizar como una matriz de unión para inmunoprecipitar el antígeno cargado IgM moléculas 35. Otras alternativas posibles podrían ser el uso de anticuerpos anti-IgM IgG de agarosa unida secundarias 46,47 o el uso de perlas magnéticas activados en superficie 48. anticuerpos IgG dirigidos contra IgM podrían ser químicamente reticulada a agarosa o agarosa A G con el fin de reducir la extensión de anticuerpo eluido junto con el antígeno de interés. Una comparación adecuada entre las diferentes variantes de inmunoprecipitación IgM con respecto a los antígenos identificados con éxito iEs difícil porque la mayoría de las inmunoprecipitaciones se realizaron para aislar o agotar las IgM sin más interés en sus antígenos. Además, inmunoprecipitaciones utilizando las IgM se utilizaron principalmente para confirmar un solo antígeno ya conocido o esperado con la exposición de anticuerpos a los antígenos purificados 49. Una desventaja de las IgG de agarosa acoplada dirigido contra IgM humana es un rendimiento muy bajo (10 a 15%) de moléculas de IgM en suero inmunoprecipitada en comparación con el material de partida 50. Por el contrario, perlas magnéticas activados en superficie se aplicaron con éxito a anticuerpos de diferentes isotipos, incluyendo IgM para inmunoprecipitar fibrillas asociadas a la tembladera 48. Este método no se limita a kappa específico (VK) o cadenas lambda (λ) o un huésped particular y puede ampliar sustancialmente el espectro de anticuerpos IgM utilizados en las inmunoprecipitaciones. Otro paso importante en el protocolo es la capacidad del anticuerpo para funcionar como un deteja anticuerpo (anticuerpo primario) en las transferencias Western u otras plataformas de cribado. anticuerpos exitosos deben dirigirse a su antígeno con afinidad suficientemente alta para permitir la unión del antígeno en presencia de detergentes no iónicos o posiblemente iónicos. anticuerpos de alta afinidad son comunes entre los anticuerpos IgG por afinidad madurada, pero menos común entre anticuerpos del isotipo IgM, que es una de las razones por las que hay relativamente pocos anticuerpos IgM disponibles en el comercio como agentes de detección en la configuración de bioquímicos. unión de los anticuerpos de alta afinidad es un requisito para las inmunoprecipitaciones de antígenos moleculares y de transferencia Western. La reducción de concentraciones de detergente o la ausencia completa de detergentes en buffers IP y tampones de lisis permite antígeno dirigido por anticuerpos de baja afinidad a través de su dominio Fab. Por el contrario, la capacidad del anticuerpo para dirigir la proteína L agarosa a través de su porción Fc no se ve afectada sustancialmente entre los controles de isotipo en un rango de diferentes concen detergentestraciones. Sin embargo, baja concentración de detergente en tampón de lisis y el tampón de IP impide disrupción de la membrana celular y el aislamiento de moléculas específicas. Del mismo modo, una baja concentración de detergente en tampones de lavado Western blot (por ejemplo, PBS-T) permite la unión de anticuerpos de baja afinidad de antígeno, pero al mismo tiempo aumenta la unión no específica y por lo tanto no es una opción. La presencia de un núcleo de proteína de antígeno es otro requisito para este método. Las proteínas con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glicoproteínas, lipoproteínas) y las proteínas no modificadas, pero no los lípidos individuales o hidratos de carbono, son detectables en transferencias de Western. No es posible para inmunoprecipitar los lípidos (por ejemplo, esfingolípidos) a partir de tejido o células lisados ​​en presencia o ausencia de detergentes. Las propiedades físico-químicas de los detergentes y los lípidos son demasiado similares como para permitir interacciones selectivas de lípidos-anticuerpo, mientras que al mismo tiempo los detergentes son esenciales para interrumpirmembranas con el fin de permitir el aislamiento selectivo de moléculas específicas. Para nuestro mejor conocimiento, inmunoprecipitaciones exclusivamente compuestos por hidratos de carbono, en ausencia de un núcleo de proteína, no se han informado anteriormente. Esto se vuelve particularmente relevante ya que los anticuerpos IgM con frecuencia se dirigen a los hidratos de carbono y glicolípidos, que no están necesariamente vinculados a una unidad de proteína. Se requieren otros técnicas cromatográficas para la identificación y separación inmunológica de los lípidos y los hidratos de carbono en ausencia de un núcleo de proteína. Por ejemplo, cromatografía en capa fina (TLC) de los lípidos celulares con la detección posterior de anticuerpos sobre la placa de TLC (inmuno-TLC) se puede implementar 51,52. Otros anticuerpos anti-PSA se han descrito en los estudios y resultados previos en comparación con HIgM12 así como la disponible comercialmente anti-PSA IgM (clon 2-2B). El anticuerpo más comúnmente utilizado en el campo de PSA es un anticuerpo IgG (clon 735) disponible como Monoc ratónlonal o anticuerpo policlonal de conejo 53. Este anticuerpo IgG anti-PSA PSA detecta en SynCAM y NCAM en diferentes tipos de células del sistema nervioso central, incluyendo las células microgliales 41. En contraste con el anticuerpo anti-PSA IgG, anticuerpos IgM humanos HIgM12, HIgM42 y el anti-PSA IgM de ratón (clon 2-2B) no son capaces de apuntar a PSA en SynCAM (pero en NCAM) en diversas etapas postnatales embrionarias y temprano en ratones , mientras SynCAM no polisialilada es fácilmente detectable 15. Los anticuerpos IgM se utilizan también no son capaces de detectar PSA en las células microgliales (Figuras 3 + 4). Una posible explicación para las diferencias observadas entre los isotipos de anticuerpos puede ser bajos niveles de PSA-SynCAM comparación con los niveles de PSA-NCAM en combinación con la unión de anticuerpos IgM en comparación con el anti-PSA IgG afinidad potencialmente menor. Para probar esta hipótesis, se realizó inmunoprecipitaciones en animales KO NCAM en estado embrionario E17 con grandes cantidades de SynCAM presente y utilizamos HIgM12 como un &quot;agente de pull-down&quot; &lt;sup&gt; 15. En E17 WT camada controles HIgM12 inmunoprecipitado PSA-NCAM en una medida que mostró intensidades similares de &quot;derribada&quot; PSA-NCAM en comparación con la IgM de cadena pesada como se detectó por densitometría de transferencia de Western usando posterior antígenos eluidas. Este resultado sugiere al menos una afinidad suficiente de HIgM12 a su destino PSA. En contraste con WT camada controla HIgM12 no detectó PSA unido a SynCAM en los animales KO NCAM. Se obtuvieron resultados idénticos en inmunoprecipitaciones usando el anticuerpo anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 y HIgM42, así como el ratón anti-PSA IgM (clon 2-2B) fueron incapaces de dirigirse a PSA en SynCAM en transferencias de Western de los animales WT y NCAM KO en las etapas de desarrollo embrionario y postnatal. Teniendo en cuenta la baja cantidad de HIgM12 requerida (0,1 g / ml) para detectar específicamente PSA unido a NCAM en transferencias de Western utilizando pequeñas cantidades de tejido del SNC (0,1 g CNS tejido por pocillo) 15 que parece ser poco probable que las bajas afinidades solo sonresponsable de la completa falta de detección PSA-SynCAM por HIgM12 en tres métodos diferentes. Llegamos a la conclusión de que existen diferencias significativas entre los anticuerpos anti-PSA IgM y el anticuerpo anti-IgG de PSA publicada frecuencia (clon 735). No está claro por qué los anticuerpos anti-PSA comerciales de IgM no se han utilizado con mayor frecuencia en el pasado para confirmar los resultados obtenidos con el anticuerpo IgG antiPSA 735. Esto es particularmente interesante porque HIgM12 ya ha demostrado su eficacia en diversos modelos de enfermedad. Mientras que otros anticuerpos anti-PSA IgM pueden tener efectos terapéuticos similares no queda claro si el anticuerpo anti-PSA IgG (clon 735) tiene un resultado terapéutico similar en modelos de MS y ALS. En resumen, los métodos descritos aquí se utilizan principalmente para identificar el antígeno de los anticuerpos humanos HIgM12 regenerativas para apoyar posibles ensayos clínicos para MS y posiblemente otras enfermedades neurodegenerativas. La identificación de la hormigaigens de anticuerpos con actividad biológica constituye un paso esencial para entender su mecanismo de acción. Esto se vuelve particularmente relevante en el contexto de numerosos anticuerpos monoclonales que actualmente se prueban para la seguridad y eficacia en ensayos humanos. Mientras que el número de anticuerpos IgM clínicamente probados hasta la fecha es pequeño, los recientes avances en la tecnología de hibridomas, junto con un creciente número de estudios que destacan el potencial terapéutico de esta clase de anticuerpos 1-10,37,40,42-45 insta al desarrollo de nuevos o métodos modificados aplicable para identificar antígenos IgM no proteicos.

Los anticuerpos del isotipo IgM demuestran gran potencial terapéutico para el tratamiento de diversas enfermedades incluyendo el cáncer y trastornos del SNC 1-7. El grupo Vollmers &#39;identificado numerosos anticuerpos en pacientes con cáncer para su uso potencial como biomarcadores específicos de tumores o agentes terapéuticos activos que son capaces de matar a las células malignas mediante la inducción de vías de apoptosis 4,8,9. Curiosamente, todos los anticuerpos identificados con potencial terapéutico son del isotipo IgM y pertenecen al grupo de &quot;autoanticuerpos naturales&quot; (BSA). Del mismo modo, el grupo de los Rodríguez identificó anticuerpos de ratón y humanos que estimulan la remielinización en las lesiones de la médula espinal crónica desmielinizadas en modelos de esclerosis múltiple (MS). Idéntica a anticuerpos con efectos anti-cáncer, todos los anticuerpos de remielinización promotoras son NAbs y del isotipo IgM 1,6,7,10. Los antígenos precisas para IgM más identificados son todavía undetermined incluyendo el anticuerpo remielinización de promoción humana rHIgM22, actualmente en Fase I de ensayos clínicos para pacientes con EM 11. A pesar de los repetidos esfuerzos de los expertos en el campo de la investigación lípidos y carbohidratos, tanto en el ámbito académico y en asociación con la industria 11, los intentos para identificar antígenos de rHIgM22 no han tenido éxito. El fracaso de las técnicas estándar que se utilizan para identificar los antígenos de anticuerpos IgG para trabajar con los anticuerpos IgM identifica una necesidad crítica para refinar los métodos específicos para estos anticuerpos que los antígenos de hidratos de carbono o lípidos objetivo más probable. El enfoque de este manuscrito es el anticuerpo humano regenerativa HIgM12 y los procedimientos experimentales utilizados para identificar a su antígeno. Anticuerpo HIgM12 se identificó a partir de pacientes con macroglobulinemia de Waldenstrom, estimula el crecimiento de neuritas in vitro 12-14 y dianas de ácido polisiálico (PSA) unido a la molécula de adhesión celular neural (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 extiende vida útil en un modelo de ratón de la ELA 17 y mejora el resultado funcional en el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) los ratones infectados. En concreto, HIgM12 estimula la actividad motora horizontal y vertical espontánea en ratones y aumenta crónicamente mielina números de diámetro pequeño y mediano axones de la médula espinal ocho semanas después de una sola dosis baja de intraperitoneal, inyectó el anticuerpo 18. La molécula de adhesión celular neural (NCAM) es una glicoproteína de la inmunoglobulina (Ig) expresado superfamilia en la superficie celular de las neuronas, glia, músculo esquelético, y células asesinas naturales 19-25. Las tres isoformas principales NCAM denominados NCAM180, NCAM140, y NCAM120, son variantes de empalme alternativo de un transcrito primario que varían sólo en su dominio citoplásmico. En el CNS, NCAM es la molécula principal polisialilada (&gt; 95%) con, homopolímeros de ácido siálico con carga negativa de largo. polisiálico unacid con n&gt; 10 se denomina PSA pero existen estructuras oligoméricas más cortos que también son biológicamente relevantes. Otras proteínas polisialiladas expresadas en el CNS son SynCAM1 26, neuropilina 2 (NRP-2) 27,28 y una subunidad del canal de sodio 25 (para revisión ver 29). Los métodos descritos aquí permiten la identificación de antígenos para las inmunoglobulinas humanas y de ratón que contienen (cadenas ligeras VκI, VκIII o VκIV de anticuerpos humanos y las cadenas ligeras VκI para anticuerpos de ratón) específicos kappa (VK) cadenas ligeras independientemente del isotipo del anticuerpo (por ejemplo, IgG, IgM , IgA, IgD o IgE). Esta limitación se basa en el uso de la proteína L agarosa para inmunoprecipitaciones con anticuerpos del isotipo IgM. Estrategias alternativas pueden incluir lectinas de unión a manosa y anticuerpos secundarios IgG anti-IgM unidos covalentemente a perlas de agarosa, que pueden ampliar la aplicabilidad de este método a más anticuerpos IgM incLuding aquellos con cadenas ligeras lambda (λ) (véase el debate). Las proporciones de cadenas ligeras en suero IgM VK en comparación con las cadenas ligeras λ IgM derivadas de individuos sanos son 1,5: 1 30. Sobre la base de la metodología usada aquí cromatográfico para separar, enriquecer y detectar ciertas moléculas inmunológicamente 31, se requiere que todos los antígenos de incluir por lo menos un dominio de proteína pequeña. Epítopo de unión específica del anticuerpo puede estar dentro o fuera del dominio de la proteína (por ejemplo, en glicoproteínas, lipoproteínas). pasos bioquímicos iniciales utilizadas para identificar el antígeno específico para HIgM12, correspondiente a reducir la lista de posibles candidatos, son los pasos más cruciales en este método. tipo de células preparaciones específicas y caracterizaciones basadas en la morfología celular se describen por las células gliales, pero esta metodología se pueden extrapolar para dar cabida a otros tipos de células dentro o fuera del SNC. Existe una urgentenecesidad de desarrollar técnicas nuevas o modificadas aplicables para el creciente número de anticuerpos IgM con potencial terapéutico para diferentes trastornos humanos, en particular en aquellos casos (la mayoría de los antígenos IgM), donde los objetivos de anticuerpos son estructuras de carbohidratos o lípidos.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Alto contenido de glucosa, con glutamina, con piruvato de sodio, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutamina, piruvato de sodio, alto contenido de glucosa</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>sin suero, 10 ml</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Agua estéril para irrigación</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1,000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot; xHBr, peso molecular 30.000-70.000 g/mol, 50 mg</td></tr> fracción de <tr><td>albúmina sérica bovina V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>fracción de choque térmico, sin proteasa, pH 7,&nbsp; pureza 98%, 100 g</td></tr> D<tr><td>-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Peso molecular: 180,16 g/mol, reactivo ACS, 500 g</td></tr><tr><td>de tripsina de páncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>esencialmente sin sal, polvo liofilizado, 9.000 unidades BAEE/mg de proteína</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Tipo IV, polvo liofilizado, 2.000 unidades/mg de proteína</td></tr><tr><td>Rata recombinante FGF proteína básica</td><td>R& Sistemas D</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA como proteína transportadora, 25 &#181; g, liofilizada, > 95%, 16,2 kDa</td></tr><tr><td>Proteína recombinante PDGF-AA de rata</td><td>R& Sistemas D</td><td>1055-AA-50</td><td>sin portador, 50 &#181; g, liofilizado, > 97%, derivado de E. coli, 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, sin glutamina, sin ácido aspártico, sin ácido glutámico</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>cristalino, 1 kg, grado reactivo, Peso molecular 30,03 g/mol (como monómero)</td></tr><tr><td>Tris[hidroximetil]aminometano (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, 99,8% puro, </td></tr><tr><td>polvo Dodecil Sulfato de Dodecilo de Sodio (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, polvo</td></tr><tr><td>Glicina Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, Peso molecular: 75,07 g/mol, Polvo cristalino blanco, 5 kg</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Peso molecular: 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Peso molecular: 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Solución tamponada con fosfato 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>Sin Calcio y Magnesio, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm Plato de cultivo celular tratado con TC</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>Placa de cultivo celular de 60 mm, poliestireno tratado con TC, 20/paquete, estéril</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm x 15 mm Placa de Petri</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>No tratada con TC Placa de Petri Bacteriológica No Tratada con TC, 20/Paquete</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 pocillos, fondo plano (envueltos individualmente), irradiado con rayos gamma, área de crecimiento 9.5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; matraz de cultivo de tejidos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; Matraz de cultivo celular de cuello inclinado en forma de U con tapa de sello de tapón</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Proteína L Plus Agarosa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, agarosa reticulada 6% con perlas (CL-6B), capacidad de unión: 10 a 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Gel Prefabricado</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10 pocillos, 50 y micro; l, para uso con células de electroforesis Mini-PROTEAN</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P</td><td>Millipore IPVH00010</td><td></td><td>PVDF, 0,45 y micro; m, rollo de 26,5 cm x 3,75 m</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ácido polisiálico-NCAM, clon</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 microlitros, Huésped: ratón, IgM monoclonal</td></tr><tr><td>4x Tampón de muestra Laemmli</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x tampón de muestra de proteínas premezcladas</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 98 % de pureza, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidasa-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific ABC0020</td><td></td><td>50 microlitros, 200 y micro; g/ml, 3.500 U/mg</td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Círculos n.º 1; Espesor: 0,13 a 0,17 mm; Tamaño: 25 mm</td></tr><tr><td>Solución tampón HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, sin calcio, magnesio, fenol</td></tr><tr><td>Papaína</td> roja <td>Worthington Biochemical Cooperation</td><td>LS003119</td><td>polvo liofilizado, 100 mg</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>polvo, 500 g</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

anticuerpo especificidad de unión de kappa (vk) humanos (igm) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (psa) unido a ncam como un estudio de caso

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Los anticuerpos del isotipo IgM a menudo se descuidan como posibles terapias en ensayos humanos, modelos animales de enfermedades humanas, así como agentes de detección en técnicas de laboratorio estándar. Por el contrario, varias IgM humanas demostraron su eficacia en modelos de cáncer y modelos de trastornos del SNC, como la esclerosis múltiple (EM) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Las razones de su falta de consideración incluyen dificultades para expresar, purificar y estabilizar anticuerpos IgM, dificultades para identificar antígenos (no proteicos), baja unión de afinidad y lagunas de conocimiento fundamentales en la investigación de carbohidratos y lípidos. 
Este manuscrito utiliza HIgM12 como ejemplo para proporcionar un protocolo detallado para detectar antígenos por Western blot, inmunoprecipitaciones e inmunocitoquímica. HIgM12 se dirige al ácido polisiálico (PSA) unido a la molécula de adhesión de la célula neural (NCAM). Se utilizó tejido cerebral de ratón postnatal temprano de ratones de tipo salvaje (WT) y ratones knockout (KO) que carecían de las tres principales variantes de empalme del sistema nervioso central (SNC) NCAM180, 140 y 120 para evaluar la importancia de NCAM para unirse a HIgM12. La digestión enzimática adicional del tejido del SNC y las células cultivadas del SNC utilizando endoneuraminidasas nos llevó a identificar el PSA como el epítopo de unión específico para HIgM12.

Esta sección ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el estudio de PSA-antígenos IgM específicos de humanos en el SNC. Se muestra el uso de anticuerpos IgM humanos que contienen cadenas específicas de luz VK en la configuración bioquímicos y por inmunocitoquímica fluorescente. HIgM12 inmunoprecipita su antígeno a partir de lisados ​​de cerebro cerebrales y actúa como un agente (anticuerpo primario) detectar en transferencias de Western. Ni el anticuerpo de control de isotipo ni L perlas de agarosa inmunoprecipitan un antígeno similar, lo que demuestra la especificidad de la tira hacia abajo (Figura 1). Transferencias de Western utilizando lisados ​​de SNC de ratones WT y NCAM KO demuestran la especificidad de unión a HIgM12-NCAM que contiene PSA-(Figura 2A). La digestión enzimática del tejido del SNC de ratones WT utilizando ENDO-NF identifica PSA unido a NCAM como el epítopo de unión específica para HIgM12 (Figura 2B). Utilizando el método descrito en el presente documento, se obtienen ratas IBA-1-positivo microglial culturas de alta pureza (Figura 3). anticuerpo anti-PSA comercialmente disponible (clon 2-2B) no etiqueta de la superficie celular o en las piscinas interiores, en el PSA fija y permeabiliza las células microgliales IBA-1-positivas por microscopía fluorescente. En consonancia con la literatura publicada con anterioridad, que informa ninguna expresión en la superficie celular de PSA-NCAM en la microglía 16,41 HIgM12 no etiqueta antígenos de superficie celular de rata microglia purificados. Curiosamente, el etiquetado de los resultados HIgM12 microglia fijos y permeabilized en una intracelular, patrón perinuclear que no se limita a orgánulos específicos (Figura 3). Los resultados están en contraste con los obtenidos utilizando un anticuerpo anti-PSA IgG (clon 735) 26, que se dirige PSA-SynCAM en microglia en el nivel de la Golgi 41. En contraste con microglia, HIgM12y antígenos de superficie de células diana A2B5 en cultivos de OPC rata altamente enriquecido en condiciones de células vivas (Figura 4). Culturas OPC contienen ~ 5% contaminación de las células microgliales. La figura 5 ilustra un patrón casi idéntico de la superficie celular tinción entre HIgM12 y anti-PSA mAb (clon 2-2B) en GFAP-positivas astrocitos (Figura 5A). Inmunofluorescencia etiquetado de los astrocitos WT digeridos-ENDO-NF en comparación con el tampón astrocitos WT tratados con control usando HIgM12 demuestra la presencia de PSA astrocitos (Figura 5B). La presencia de astrocitos de PSA-positivo in vivo todavía tiene que ser confirmado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Figura 1: HIgM12 actúa como un &quot;pull-down&quot; Agente de inmunoprecipitaciones inmunoprecipitaciones del lisado total del cerebro de los ratones de tres meses de edad, utilizando HIgM12, control de isotipo humano HIGM.126 o L agarosa cuentas solamente como agentes de &quot;pull down&quot;. Las proteínas eluidas se llevaron a cabo en las transferencias Western sondadas con las membranas contra HIgM12. Los pesos moleculares de las proteínas eluidas de perlas recubiertas con HIgM12 estaban en el rango de 160 a 200 kDa, además de la cadena pesada de IgM (~ 65-73 kDa). Esta cifra ha sido modificado a partir de J. . Neurochem 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Figura 2: HIgM12 Objetivos del ácido polisiálico (PSA) Resto de NCAM. A. homogeneizados de cerebro de P7, P13, P16 y P27 NCAM total de ratones KO y los controles de la misma camada heterocigóticos se llevaron a cabo en las transferencias Western sondadas con las membranas contra HIgM12, PSA y β-actina como control de carga. <strong&gt; B. 10 g de adulto WT lisado de cerebro de ratón en 1% de NP40 en PBS, pH 6,5 se trató con endoneuraminidase N (endo-N) (exo) neuraminidasa con α2-3 especificidad polímero de ácido polisiálico (sialidasa) o PBS durante la noche a 37 ºC, se ejecutan como dobletes en transferencias de Western y se sondearon contra HIgM12, PSA y β-actina como control de carga. Esta cifra ha sido modificado a partir de J. . Neurochem 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Figura 3: La ausencia de PSA en la rata La microglía se refleja en la falta de HIgM12 Etiquetado microglia rata se cultivaron durante 48 h en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina y bien marcada en vivo en el hielo con HIgM12 o después de la fijación con HIgM12 o anti. -Sal mAB (clon 2-2B). Las células fueron tRiple marcada con marcador de microglia IBA-1 (verde), HIgM12 / PSA (rojo) y DAPI (azul). Las imágenes muestran la falta de superficie de la célula microglial unión usando HIgM12 (fila superior) y la falta de anti-PSA de unión (clon 2-2B) a la superficie celular y los almacenes internos en microglia rata primaria (fila inferior). Sobre la base de la morfología bipolar y la ausencia de IBA-1 tinción, se sugirió la pequeña celda de PSA-positivos (fila inferior) para ser un OPC. En las células fijas, HIgM12 tinción dio lugar a un patrón punteado, perinuclear que no se limita a orgánulos específicos y se consideró la unión no específica (fila central). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Figura 4: HIgM12 dianas celulares de superficie PSA-NCAM de rata OPC OPC rata y microglia fueron cultu.rojo durante 4 días en medio de proliferación sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina y triples marcados en vivo en el hielo con HIgM12 o A2B5 (verde), macrófagos interna / monocitos marcador CD68 (clon ED-1) (rojo) y DAPI (azul) . Las imágenes muestran las poblaciones de células mayormente positivo para A2B5 marcador de OPC (fila superior) y HIgM12 (fila inferior) con pocas microglia CD68-positivo (~ 5%). Se añadieron imágenes de contraste de fase y DAPI para revelar la integridad celular y el número de células de cada población. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Figura 5: HIgM12 y mAb anti-PSA co-etiquetar una subpoblación astrocíticos ratón Mixta glía. A. mouse células gliales mixtos de WT y KO NCAM total de animales que contienen los astrocitos, oligodendrocitos células de linaje y microglia se cultivaron durante 3 días y se marcó en vivo en el hielo con HIgM12 (verde), anti-PSA MAB (clon 2-2B) (rojo) y posteriormente para astrocıtico marcador GFAP (púrpura) y DAPI (azul). HIgM12 y anti-PSA revelan un patrón de tinción idéntico virtual en astrocitos GFAP WT-positivas, pero la falta de unión de astrocitos en cultivo de ratones NCAM KO. Esta cifra ha sido modificado a partir de J. Neurochem. 15. B. glía mixtos se cultivaron de forma idéntica como se describe en A. y tratados durante la noche con endoneuraminidase-NF (amablemente proporcionado por el Dr. Martina Muehlenhoff) o control PBS. Las células se marcaron en vivo en hielo con HIgM12 (verde) y posteriormente se tiñeron para los marcadores de GFAP interna (rojo) y DAPI (azul). HIgM12 se dirige a los antígenos de la superficie celular en PBS-control tratados mezcla de culturas gliales pero no endoneuraminidase-NF tratados glía mixta. Esta cifra ha sido modificado a partir de 16 JNSCI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>aliviar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Todas las imágenes fueron tomadas en la ampliación 60X utilizando los mismos ajustes del instrumento y se procesan de forma idéntica. <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tabla 1:. Buffer y solución Recetas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Por favor, haga clic aquí para descargar la tabla.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> tejido del SNC </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> tampón de lisis </td><td> Volumen total </td></tr><tr><td> 1. ratón WT </td><td> 67 g (0,45 l) </td><td> 2 l (12 mg) ENDO-NF </td><td> 7,55 l </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 2. ratón WT </td><td> 67 g (0,45 l) </td><td> 2 l de PBS </td><td> 7,55 l </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 3. ratón WT </td><td> 67 g (0,45 l) </td><td> no PBS o ENDO-NF </td><td> 9,55 l </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 4. NCAM ratón KO </td><td> 67 g (0,45 l) </td><td> 2 l (12 mg) ENDO-NF </td><td> 7,55 l </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 5. NCAM ratón KO </td><td> 67 g (0,45 l) </td><td> 2 l de PBS </td><td> 7,55 l </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 6. NCAM ratón KO </td><td> 67 g (0,45 l) </td><td> no PBS o ENDO-NF </td><td> 9,55 l </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2: digestión ENDO-NF de tejido del SNC de ratones WT y P7 NCAM KO.

Presentamos un protocolo para identificar fracciones de proteínas que contienen antígenos para anticuerpos IgM humanos y de ratón con cadenas ligeras kappa (Vκ) específicas. Este protocolo no se limita a los anticuerpos de la clase IgM, sino que se aplica a todos los isotipos de inmunoglobulinas que se dirigen a su antígeno con una afinidad suficientemente alta durante las inmunoprecipitaciones.

Anticuerpo especificidad de unión de Kappa (VK) Humanos (IgM) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (PSA) unido a NCAM como un estudio de caso

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar antígenos para anticuerpos con potencial terapéutico, centrándose en el isotipo IgM. Este método cubre un vacío de conocimiento en el campo biomédico y podría ayudar a identificar nuevos biomarcadores y agentes inmunoterapéuticos para la investigación del cáncer y enfermedades del sistema nervioso central. La principal ventaja de esta técnica es que abre la puerta a una clase de anticuerpos que ha sido poco explorada, pero que posee un gran potencial terapéutico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y tratamiento de todas las enfermedades que pueden ser objeto de terapias basadas en anticuerpos. Este enfoque puede proporcionar información sobre los antígenos de los anticuerpos IgM y el crecimiento de tejidos y subcultivos. Asimismo, puede ser útil para otros isotipos de anticuerpos de todas las especies.La idea de este método surgió cuando me di cuenta del enlace específico y destacado del anticuerpo IgM en diferentes aplicaciones bioquímicas. El procedimiento será demostrado por Robert Kahoud y Jens Watzlawik. Para comenzar este procedimiento, realice un corte en el cráneo hacia la parte frontal a la altura de la oreja y retire el cráneo.Luego, coloque suavemente el cerebro en un tubo de 15 mililitros e inmediatamente almacénelo sobre hielo seco. Después de cinco minutos, transfiera el cerebro a un papel de pesaje limpio y retire rápidamente el cerebelo y el bulbo raquídeo utilizando una cuchilla de afeitar limpia. A continuación, pese el cerebro congelado antes de transferirlo nuevamente al tubo de 15 mililitros sobre hielo.Añada tampón de lisis frío con hielo hasta alcanzar una concentración final de 150 microgramos de tejido cerebral por microlitro de tampón de lisis. Luego, homogenice el cerebro en el tampón de lisis mediante trituration a través de una punta de pipeta de un mililitro, seguido de trituration a través de una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 27. A continuación, incube el lisado cerebral durante 30 minutos adicionales en hielo para permitir la lisis completa del tejido.Después de 30 minutos, elimine el detergente, el material insoluble y los lípidos cerebrales mediante centrifugaciones seriadas. Deseche el precipitado que contiene mielina y restos celulares, pero conserve el sobrenadante tras cada paso de centrifugación. Aliquote el lisado cerebral y almacénelo a 80 grados Celsius.En este paso, prepare 200 mililitros de tampón IP con BSA y otros 200 mililitros de tampón IP sin BSA. Para la reacción de inmunoprecipitación, transfiera 100 microlitros de suspensión de agarosa con proteína L a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada un mililitro de tampón IP con BSA al tubo.Luego, mezcle manualmente mediante inversión. A continuación, lave las perlas de agarosa con proteína L cuatro veces mediante centrifugación. Después, retire el sobrenadante sin perturbar el botón de agarosa y repita el procedimiento de lavado tres veces más.Luego, agregue tampón IP fresco que contenga BSA al agarosa Protein L e incube toda la noche en un rodillo a cuatro grados Celsius. En 800 microlitros de tampón IP que contenga BSA y 30 miligramos de tejido cerebral lisado, agregue 20 microgramos de anticuerpo experimental, anticuerpo control o PBS. Incube 30 miligramos de tejido cerebral lisado en tampón IP frío con anticuerpo IgM en un tubo microcentrífugo de 1,5 milímetros toda la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, centrifugar las perlas de agarosa con proteína L en una centrífuga de banco. Desechar el sobrenadante sin perturbar el precipitado de agarosa. Luego, añadir la solución fría de lisado cerebral de anticuerpo a la agarosa con proteína L.Incube la suspensión de anticuerpo-antígeno con agarosa proteína L durante dos horas en un agitador rotatorio a cuatro grados Celsius. Después de dos horas, lave el complejo de anticuerpo-antígeno unido a la agarosa L mediante centrifugación. Descarte cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado y añádale un mililitro de tampón IP frío con hielo que contenga 0,2 % de BSA.Repita el paso de lavado una vez más utilizando tampón IP frío con hielo que contenga BSA al 0,2 % y dos veces adicionales utilizando tampón IP frío con hielo sin BSA. A continuación, centrifugue para sedimentar el complejo anticuerpo-antígeno unido al agarosa L. Utilice una pipeta de 200 microlitros para desechar el sobrenadante hasta que queden aproximadamente 50 microlitros de la solución encima del botón de agarosa de proteína L. Luego, utilice una pipeta de 10 microlitros para eliminarlo completamente.Mantenga todas las muestras en hielo. A continuación, agregue 40 microlitros de tampón de elución para inmunoprecipitación a cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Agite el tubo con los dedos seis veces y caliéntelo durante cinco minutos a 95 grados Celsius.Después de eso, coloque la muestra en hielo durante dos minutos y centrifúguela durante 30 segundos. Luego, transfiera 35 microlitros del sobrenadante a un tubo microcentrífugo fresco de 1,5 milímetros sin perturbar el precipitado. A continuación, confirme la ausencia de perlas de agarosa de proteína L enjuagando una pequeña cantidad de la muestra diluida en la pared interna del tubo.Si están presentes perlas de agarosa con proteína L, centrifugar la muestra durante otros 30 segundos a 13.000 veces g y transferir el sobrenadante a un tubo limpio. Repetir este paso hasta que no se detecten perlas de agarosa. Luego, cargar 10-20 microlitros de las muestras diluidas por pocillo en un gel de poliacrilamida SDS y un sistema de tampón tris-glicina SDS, y correr el gel durante aproximadamente una hora a 100 voltios en la bancada sin enfriamiento adicional.Posteriormente, transfiera las proteínas a una membrana de PVDF. Las proteínas se transfieren durante dos horas y media en cámara fría a 100 voltios utilizando tampón de transferencia frío. Bloquee la membrana con polvo de leche descremada al 10% peso por volumen en PBS-T durante una hora a 25 grados Celsius en un agitador orbital sobre la bancada.Lávese dos veces durante 10 minutos cada vez con PBS-T. Incube la membrana con el anticuerpo primario en PBS-T con 5 % de BSA. Incube en agitador orbital en cámara fría durante la noche.A la mañana siguiente, lave la membrana una vez con PBS-T en exceso a 25 grados Celsius, seguido de tres lavados con PBS-T durante 10 minutos cada uno en un agitador orbital. A continuación, añada anticuerpo secundario y 5% de leche en polvo descremada en PBS-T a la membrana e incube durante una hora a 25 grados Celsius en un agitador orbital. Después de eso, lave la membrana una vez con PBS-T en exceso a 25 grados Celsius, seguido de tres lavados con PBS-T durante 10 minutos cada uno en un agitador orbital.Mezcle un mililitro del componente A del sustrato HRP para quimioluminiscencia mejorada enfriado con un mililitro del componente B a 25 grados Celsius. Transfiera la membrana sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Luego, seque el recipiente con toallas de papel antes de transferir la membrana de nuevo a él.Inmediatamente, agregue dos mililitros del sustrato de quimioluminiscencia mejorado para HRP previamente mezclado a la membrana e incube durante dos minutos a 25 grados Celsius. Incline el recipiente manualmente cada 20 segundos para humedecer uniformemente la membrana. Posteriormente, transfiera la membrana a una funda plástica transparente y elimine el exceso de líquido y las burbujas de aire con toallas de papel.Coloque la funda de plástico en la cubeta y ciérrela. Esta figura muestra que HigM12 inmunoprecipita su antígeno a partir de lisados cerebrales cerebrales y actúa como un agente de detección en las transferencias Western. Ni el anticuerpo control de isotipo ni las perlas de agarosa L inmunoprecipitan un antígeno similar, lo que demuestra la especificidad del aislamiento.Aquí, los inmunotransferencias de Western utilizando lisados del SNC de ratones de tipo salvaje y ratones knockout para NCAM demuestran la especificidad de la unión de HIgM a NCAM que contiene PSA. La digestión enzimática del tejido del SNC de ratones de tipo salvaje utilizando ENDO-NF identifica a PSA unido a NCAM como el epítopo de unión específico para HIgM12. Mediante el método descrito en el presente documento, se obtienen cultivos de microglía de rata positivos para IBA-1 con alta pureza. En contraste con la microglía, los antígenos de superficie celular objetivo de HIgM12 y A2B5 estuvieron altamente enriquecidos en cultivos de OPC de rata bajo condiciones de células vivas.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 13 horas laborables. Tras seguir este procedimiento, se pueden emplear otros métodos, como Biacore o la tecnología de resonancia de plasmón de superficie, para identificar las afinidades de unión de los anticuerpos y sus constantes de asociación y disociación. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer, las inmunoterapias y los autoanticuerpos naturales identificaran epítopos de carbohidratos en proteínas como antígenos para anticuerpos IgM terapéuticos en humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar antígenos glucoproteicos para trabajos de investigación que contengan anticuerpos IgM humanos. Los datos proporcionan un nuevo objetivo para la terapia de la EM. PSA ENCAP, el tratamiento con anticuerpos que hemos desarrollado, es uno de los primeros en mostrar una mejora funcional en una caja de actividad utilizando el modelo riguroso presente en la enfermedad y una enfermedad semejante a la esclerosis múltiple.

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Este protocolo describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales (mAb) de clase IgG fuertemente reactivos a la mioglobina de los cetáceos. Estos mAbs se aplican en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich para diferenciar el Mb de los cetáceos de la foca y otros animales.

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

Aquí, presentamos un protocolo para producir un anticuerpo tienen GPC3-S-Fab en Escherichia coli. GPC3-S-Fab purificado tiene potente citotoxicidad contra las células de cáncer de hígado positivo GPC3.

Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad

Presentamos los enfoques para la caracterización Biofísica y estructural de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por interferometría de biocapa, calorimetría isotérmica de titulación y Cristalografía de rayos x.

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

La expansión del código genético se aplica para la introducción de un aminoácido antinatural que lleva un grupo funcional biorthogonal en una proteína portadora en un sitio definido. La función biorthogonal se utiliza además para el acoplamiento selectivo del sitio de un antígeno de carbohidratos para proporcionar una vacuna de glucoconjugado homogénea.

Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas

Aquí, se describe un método para determinar la afinidad de unión (KD) de los anticuerpos radiomarcados a los antígenos inmovilizados. KD es la constante de disociación de equilibrio que se puede determinar a partir de un experimento de unión a la saturación midiendo la unión total, específica e inespecífica de un anticuerpo radiomarcado a varias concentraciones de su antígeno.

Determinación de la afinidad de unión (KD) de anticuerpos radiomarcados a antígenos inmovilizados

Este protocolo describe el marcaje de anticuerpo único (SAL) para resolver la organización espacial a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática. Al aprovechar las interacciones acumulativas anticuerpo-epítopo a nivel de molécula única, el SAL de membrana (mSAL) mapea las distribuciones locales de epítopos mientras captura simultáneamente el comportamiento de unión de anticuerpos en el entorno celular nativo.

Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

Aprenda a identificar antígenos para anticuerpos IgM con potencial terapéutico mediante inmunoprecipitación y Western blot. Este método permite descubrir biomarcadores novedosos para cáncer y enfermedades del sistema nervioso central.

Anticuerpo especificidad de unión de Kappa (VK) Humanos (IgM) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (PSA) unido a NCAM como un estudio de caso (Video) | JoVE Journal

Anticuerpo especificidad de unión de Kappa (VK) Humanos (IgM) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (PSA) unido a NCAM como un estudio de caso

Explorar más videos