Anticuerpo especificidad de unión de Kappa (VK) Humanos (IgM) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (PSA) unido a NCAM como un estudio de caso

El objetivo general de este procedimiento es identificar antígenos de anticuerpos con potencial terapéutico centrándose en el isotipo IgM. Este método llena un vacío de conocimiento en el campo biomédico y puede ayudar a identificar nuevos biomarcadores y agentes inmunoterapéuticos para la investigación del cáncer y las enfermedades del sistema nervioso central. La principal ventaja de esta técnica es que abre la puerta a una clase desatendida de anticuerpos con un gran potencial terapéutico.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y tratamiento de todas las enfermedades que pueden ser atacadas por la terapéutica basada en anticuerpos. Lo que esto importa puede proporcionar información sobre los antígenos de los anticuerpos IgM y el crecimiento de tejidos y subcultivos. También puede ser una plaga para otros isotipos de anticuerpos de todas las especies.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando me di cuenta de la unión específica y prominente del anticuerpo IgM en diferentes aplicaciones bioquímicas. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Robert Kahoud y Jens Watzlawik. Para comenzar este procedimiento, haga un corte en el cráneo hacia el frente a la altura de la oreja y retire el cráneo.

Luego, coloque suavemente el cerebro en un tubo de 15 mililitros e inmediatamente guárdelo en hielo seco. Después de cinco minutos, transfiera el cerebro a un papel de pesaje limpio y retire rápidamente el cerebelo y el tronco encefálico con una cuchilla de afeitar limpia. A continuación, pesa el cerebro congelado antes de transferirlo de nuevo al tubo de 15 mililitros con hielo.

Agregue tampón de lisis helado hasta una concentración final de 150 microgramos de tejido cerebral por microlitro de tampón de lisis. A continuación, homogeneizar el cerebro en tampón de lisis mediante trituración a través de una punta de pipeta de un mililitro seguida de trituración a través de una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 27. Después de eso, incube el lisado cerebral durante 30 minutos adicionales en hielo para permitir la lisis completa del tejido.

Después de 30 minutos, retire el detergente, el material insoluble y los lípidos cerebrales para centrifugarlos en serie. Deseche la mielina y los residuos celulares que contengan gránulos, pero conserve el sobrenadante después de cada paso de centrifugación. Alicucuota el cerebro lisado, y almacenar a 80 grados centígrados.

En este paso, prepare 200 mililitros de tampón IP con BSA y otros 200 mililitros de tampón IP sin BSA. Para la reacción de inmunoprecipitación, transfiera 100 microlitros de suspensión de agarosa de proteína L a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue un mililitro de tampón IP con BSA al tubo.

A continuación, mézclalo manualmente por inversión. A continuación, lavar las perlas de Proteína L agarosa cuatro veces por centrifugación. Después de eso, retire el sobrenadante sin alterar el pellet de agarosa y repita el procedimiento de lavado tres veces más.

A continuación, añada un tampón BSA fresco que contenga IP a la proteína L agarosa e incube durante la noche en un rodillo a cuatro grados centígrados. En 800 microlitros de tampón IP que contiene BSA y 30 miligramos de tejido cerebral lisado, agregue 20 microgramos de anticuerpo experimental, anticuerpo de control o PBS. Incubar 30 miligramos de tejido cerebral lisado en un tampón IP helado con anticuerpo IgM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, centrifuga las perlas de agarosa de Protein L en una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante sin alterar la pelletza de agarosa. A continuación, añada la solución fría de lisado cerebral de anticuerpos a la proteína L agarosa.

Incubar el antígeno anticuerpo, proteína L suspensión de agarosa durante dos horas en un rodillo a cuatro grados centígrados. Después de dos horas, lavar el complejo de antígenos de anticuerpos unido a la agarosa L mediante centrifugación. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y agregue un mililitro de tampón IP helado que contenga 0.2% BSA.

Repita el paso de lavado una vez más usando un tampón IP helado que contenga 0.2% BSA y dos veces adicionales usando un tampón IP helado sin BSA. Después de eso, centrifuga el complejo de antígenos de anticuerpos unido a la agarosa L. Use una pipeta de 200 microlitros para desechar el sobrenadante hasta que queden unos 50 microlitros de la solución encima de la gránula de agarosa de proteína L. A continuación, utilice una pipeta de 10 microlitros para eliminarlo por completo.

Mantenga todas las muestras en hielo. A continuación, añada 40 microlitros de tampón de elución IP a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Golpee el tubo con el dedo seis veces y caliéntelo durante cinco minutos a 95 grados centígrados.

Después de eso, coloque la muestra en hielo durante dos minutos y gírela hacia abajo durante 30 segundos. A continuación, transfiera 35 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 milímetros sin alterar el pellet. A continuación, confirme la ausencia de perlas de agarosa de proteína L enjuagando una pequeña cantidad de muestra diluida en la pared del tubo interior.

Si hay perlas de proteína L agarosa, centrifugar la muestra durante otros 30 segundos a 13.000 veces g y transferir el sobrenadante a un tubo limpio. Repita este paso hasta que no se detecten perlas de agarosa. A continuación, cargue de 10 a 20 microlitros de muestras diluidas por pocillo en un gel de poliacrilamida SDS y un sistema tampón SDS de tris-glicina y haga funcionar el gel durante aproximadamente una hora a 100 voltios en la mesa de trabajo sin refrigeración adicional.

Posteriormente, transfiere las proteínas a una membrana de PVDF. Las proteínas se transfieren durante dos horas y media en la cámara frigorífica a 100 voltios utilizando tampón de transferencia fría. Bloquee la membrana con 10% de peso por volumen de leche en polvo en polvo en PBS-T durante una hora a 25 grados centígrados en un agitador orbital de sobremesa.

Lávelo dos veces durante 10 minutos cada vez con PBS-T. Sondeo de la membrana con anticuerpo primario en 5%BSA en PBS-T. Incubar en un agitador orbital en la cámara frigorífica durante la noche.

A la mañana siguiente, lave la membrana una vez con exceso de PBS-T a 25 grados centígrados, seguido de tres lavados con PBS-T durante 10 minutos cada uno en un agitador orbital. A continuación, agregue el anticuerpo secundario y la leche en polvo en polvo al 5% en PBS-T a la membrana e incube durante una hora a 25 grados centígrados en un agitador orbital. Después de eso, lave la membrana una vez con exceso de PBS-T a 25 grados centígrados, seguido de tres lavados con PBS-T durante 10 minutos cada uno en un agitador orbital.

Mezcle un mililitro de sustrato HRP de quimioluminiscencia mejorada enfriada componente A con un mililitro de componente B a 25 grados centígrados. Transfiera la membrana sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Luego, seque el recipiente con toallas de papel antes de volver a transferir la membrana a él.

Inmediatamente, agregue dos mililitros del sustrato HRP de quimioluminiscencia mejorada premezclado a la membrana e incube durante dos minutos a 25 grados centígrados. Incline el recipiente con la mano cada 20 segundos para humedecer la membrana de manera uniforme. Después de eso, transfiera la membrana a una funda de plástico transparente y elimine el exceso de líquido y burbujas de aire con toallas de papel.

Pega la funda de plástico en el casete y ciérralo. Esta figura muestra que HigM12 inmunoprecipita su antígeno desde los lisados cerebrales y actúa como agente detector en las manchas occidentales. Ni el anticuerpo de control del isotipo ni las perlas de agarosa L inmunoprecipitan un antígeno similar que demuestre la especificidad de la distracción.

Aquí, las transferencias de Western que utilizan lisados del SNC de ratones de tipo salvaje y ratones knockout de NCAM demuestran la especificidad de la unión de HIgM al PSA que contiene NCAM'La digestión enzimática del tejido del SNC de ratones de tipo salvaje que utilizan ENDO-NF identifica el PSA unido a NCAM como el apítopo de unión específico para HIgM12. Utilizando el método descrito en este documento, se obtienen cultivos microgliales de rata IBA-1 positivos de alta pureza. A diferencia de la microglía, los antígenos de superficie de las células diana HIgM12 y A2B5 estaban altamente enriquecidos en cultivos de OPC de rata en condiciones de células vivas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 13 horas hábiles. Siguiendo este procedimiento, se pueden emplear otros métodos como Biacore o la tecnología de resonancia de plasmones de superficie para identificar las afinidades de unión de los anticuerpos a las constantes de asociación y asociación. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer, las inmunoterapias y los autoanticuerpos naturales identificaran apitopos de carbohidratos en proteínas similares como antígenos para anticuerpos IgM terapéuticos en humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar antígenos de glicoproteínas para trabajos de investigación que contengan anticuerpos IgM humanos. Los datos proporcionan un nuevo objetivo para el tratamiento de la EM. PSA ENCAP, el tratamiento con anticuerpos que hemos desarrollado, es uno de los primeros en mostrar una mejoría funcional en una caja de actividad utilizando el modelo riguroso que se encuentra en la enfermedad y devaluando una enfermedad similar a la Esclerosis Múltiple.