Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

El objetivo general de este novedoso método de cultivo celular es generar células grasas desdiferenciadas con mayor eficiencia. Nuestro método puede ayudar a los investigadores que trabajan en el campo de la medicina regenerativa a responder preguntas clave sobre los diversos procesos involucrados en la producción de células adipogénicas, osteogénicas y condrogénicas. Dado que la principal ventaja de nuestro protocolo de cultivo celular es que mejora la calidad de las células DEFAT, es posible que se aplique en un futuro próximo para mejorar las aplicaciones actuales en terapia celular e ingeniería de tejidos.

Después de llevar la muestra de grasa subcutánea del paciente al laboratorio desde el quirófano, pese el tejido y coloque una muestra de uno a dos gramos de tejido adiposo en un tubo de 15 mililitros. A continuación, lavar la muestra con cinco mililitros de PBS y luego transferir la muestra a un plato de plástico de 10 centímetros. Retire el PBS.

A continuación, añada 10 mililitros de colagenasa estéril al 0,1% en peso por volumen a la placa que contiene la muestra. A continuación, use unas tijeras quirúrgicas para picar el tejido hasta que alcance una consistencia de puré. Transfiera el tejido picado y la solución de colagenasa a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y digiera a 37 grados centígrados durante 30 minutos, agitando a 60 RPM.

Después de la digestión, filtre la muestra digerida a través de un filtro de 100 micras en un tubo nuevo de 15 mililitros. A continuación, pase 10 mililitros de medio de cultivo DEFAT suplementado con 2%FBS a través del filtro. Para aislar las células grasas de la suspensión celular, primero centrifugar las células filtradas a 100 veces g durante un minuto a temperatura ambiente.

Durante la centrifugación, prepare cinco mililitros de DCM suplementado con 2% de FBS en un tubo de 15 mililitros. A continuación, utilice una pipeta de 1000 microlitros para extraer las células grasas flotantes del tubo centrífugo y añada las células a un tubo de 15 mililitros que contenga medio. Agite el tubo suavemente para mezclar el medio DCM con las células.

A continuación, centrifugar el tubo a 100 veces g durante un minuto a temperatura ambiente. Después de centrifugar, use una aguja de calibre 18 y una jeringa de 20 mililitros para eliminar el medio en la parte inferior del tubo. A continuación, añada 10 mililitros de DCM suplementado con 2%FBS a las células y mezcle agitando suavemente el tubo.

Vuelva a centrifugar las células a 100 veces g durante un minuto a temperatura ambiente. Para comenzar el enchapado, agregue 41 mililitros de DCM o DMEM suplementado con 20% de FBS en un matraz de 12,5 centímetros. A continuación, utilice una pipeta de 200 microlitros para extraer 40 microlitros de células grasas y añadirlas al matraz.

A continuación, llene el matraz con DCM o DMEM complementado con 20%FBS. Es fundamental que las células estén distribuidas por todo el medio. Coloque el matraz en la tapa de una placa de Petri redonda para mantenerlo plano.

Finalmente, coloque el matraz dentro de una incubadora configurada a 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados y déjelo sin tocar durante siete días. Después de una semana de incubación, invierta el matraz y compruebe si hay células grasas desdiferenciadas. A continuación, aspire el medio y, a continuación, añada cinco mililitros de DCM o DMEM suplementado con 20% de FBS al matraz.

Deje que las células DEFAT crezcan durante otra semana después de cambiar el medio. Después de una semana, use un contador de células para contar el número de células DEFAT generadas en diversas condiciones de cultivo celular. Esta imagen muestra colonias de células DEFAT después de 14 días de cultivo en DMEM.

Aquí se muestran las células DEFAT después de 14 días de cultivo en DCM. En cada caso, la barra de escala representa 200 micras. La proliferación de células DEFAT se cuantificó utilizando un contador de células, y se comparó la eficiencia de DCM y DMEM en la generación de células DEFAT.

Como se ha visto aquí, se observa una mayor proliferación celular con el uso de DCM. Aquí, las células DEFAT humanas, generadas mediante DCM, se cultivaron durante tres semanas en los medios de inducción apropiados para evaluar las capacidades de rediferenciación y diferenciación de las células DEFAT. Las células fueron positivas para capacidad osteogénica por tinción con fosfatasa alcalina y por tinción con Alizarina Roja S. Finalmente, se demostró capacidad adipogénica con una tinción de Rojo O de aceite.

Es muy importante asegurarse de que la colagenasa con rudimento y el aislamiento de células grasas se realicen con el máximo cuidado para generar con éxito células DEFAT de alta calidad. A través de estos esfuerzos, nuestro método de cultivo celular validado tiene como objetivo facilitar los esfuerzos de investigación actuales y futuros en los campos de la biología del desarrollo y la medicina regenerativa.