Name: Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Aprenda a generar células de grasa dediferenciadas (DFAT) con mayor eficiencia mediante este protocolo de cultivo celular mejorado. Este método optimiza la calidad celular para aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos.

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Esta investigación fue financiada en parte por el Programa para la Creación de Start-ups a partir de Investigación y Tecnología Avanzadas (Programa START) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (ST261006IP, TM) y por el Programa para la Fundación de Investigación Estratégica en Universidades Privadas (2014-2019) (S1411018, TM) del Ministerio de Educación, Deportes, Ciencia y Tecnología.

Las muestras de tejido adiposo subcutáneo humano se obtuvieron de pacientes sometidos a cirugía en los Departamentos de Cirugía Plástica, Urología, Cirugía Pediátrica y Cirugía Ortopédica del Hospital de la Universidad de Nihon Itabashi (Tokio, Japón). Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito, y el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nihon aprobó el estudio. 1. Preparación del tejido <ol><li> Llevar la muestra de tejido de la sala de operaciones para el laboratorio. </li><li> Lavar 1-2 g de tejido adiposo con 5 ml de PBS (-) a temperatura ambiente (TA) una vez, en un tubo de 50 ml y luego se coloca la muestra en un plato de plástico de 10 cm. </li></ol> 2. La colagenasa digestión <ol><li> Retirar la muestra de la PBS (-), a continuación, añadir 10 ml de estéril 0,1% (w / v) solución de colagenasa (colagenasa tipo II) para el plato que contiene la muestra de tejido. </li><li> Picar el tejido con tijeras quirúrgicas durante aproximadamente 15 min, hasta que alcanza un puré consisterencia. </li><li> Posteriormente, digerir el tejido picado en el 0,1% (w / v) de solución de colagenasa a 37 ° C durante 30 min (60 rpm) en un tubo de 50 ml con agitación suave en un agitador. </li><li> Se filtra la muestra digerida a través de un filtro de 100 micras en un tubo de 50 ml. A continuación, pasar 10 ml de DCM (véase la Tabla de Materiales) suplementado con 2% de FBS a través del filtro. </li></ol> 3. El aislamiento de la célula <ol><li> Centrifugar las células filtradas a 100 xg durante 1 min a TA. </li><li> En este punto, preparar 5 ml de DCM suplementado con 2% de FBS en un tubo de 50 ml. </li><li> A continuación, la elaboración de las células grasas flotantes utilizando una pipeta 1.000 l y añadir las células a un medio que contiene 50 ml tubo. </li><li> Posteriormente, agitar el tubo de 50 ml suavemente para mezclar el medio DCM con las células. </li><li> A continuación, se centrifuga el tubo a 100 xg durante 1 min a TA. </li><li> Descartar el medio en la parte inferior del tubo con una aguja de 18 G y una jeringa de 20 ml. </li><li> A continuación, añadir 10 ml de DCM supplemented con 2% de FBS a las células recogidas. </li><li> Mezclar el DCM con las células agitando el tubo 50 ml suavemente. </li><li> Centrifugar el tubo a 100 xg durante 1 min a TA. </li></ol> 4. Las células Plating <ol><li> Añadir 41 ml de DCM o DMEM suplementado con 20% de FBS a un matraz de 12,5 cm. </li><li> A continuación, utilizando una pipeta de 200 l Añadir 40 l de células de grasa al matraz. </li><li> A continuación, llenar el matraz con DCM o DMEM suplementado con 20% FBS. Paso crítico: En este punto, asegúrese de que las células se extienden por todo el medio. comprobar visualmente las células desprendidas y después mantener el frasco en la tapa de una caja de Petri redonda para mantenerla plana. </li><li> Por último, colocar el frasco dentro de la incubadora y se deja inalterado en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C durante 7 días. </li><li> Después de una semana de incubación, invierta el frasco y verificar si hay células DFAT. A continuación, evaluar DFAT la generación de células competencia tal como está descrito 10 ya que en este punto fibroblcélulas AST-como (células DFAT) se encuentran en regiones distintas de las células grasas. </li><li> Añadir 5 ml de DCM o DMEM suplementado con 20% FBS al matraz después de la eliminación del medio de cultivo celular anterior. Permitir que las células crezcan DFAT por otra semana después de cambiar el medio. </li><li> El uso de un contador de células, contar el número de células DFAT generados en diversas condiciones de cultivo de células (DCM vs. DMEM). </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Adipocitos maduros que se someten en desdiferenciación vitro, un proceso conocido como la cultura de techo, pueden revertir a un fenotipo más primitivo y obtener capacidades proliferativas. Estas células se denominan células de grasa como dediferenciado (DFAT). Se evaluó el potencial de diferenciación multilinaje de células DFAT. Citometría de flujo análisis y análisis de expresión génica reveló que las células DFAT eran muy homogénea en comparación con ASC 6. De hecho, el perfil del antígen...

La terapia celular e ingeniería de tejidos son temas de actualidad en el campo de la medicina regenerativa 1-5. Si bien estas modalidades terapéuticas son muy prometedores, varias cuestiones técnicas actualmente obstaculizan su uso clínico. En este sentido, como en la generación de células iPS, todas las terapias de ingeniería de tejidos deben producir células libres de transducción de genes externos con el fin de mantener la seguridad del paciente. De acuerdo con ello, fuimos el primer grupo para producir con éxito células humanas DFAT 6. Ya que varios otros grupos de investigación han adoptado este método para generar células de origen mamífero DFAT 7-9, destacando aún más la utilidad de nuestro modelo. En el transcurso de varios estudios, se ha encontrado que la calidad del medio ambiente de cultivo de células se puede modificar ajustando el contenido del medio celular. Este hallazgo ha llevado a un aumento en la tasa de éxito de la producción de células DFAT y una mejor calidad de células; ambos factores críticos engenerar de manera eficiente las células para ensayos clínicos futuros. A este respecto, un medio de cultivo DFAT mejorada (DCM, un medio similar a mesenquimales medio celular, que contiene insulina recombinante humana, albúmina de suero, el ácido L-glutámico, varios ácidos grasos y colesterol madre) y un método para la generación de células DFAT y la proliferación fue desarrollado (más información sobre el contenido de DCM está disponible bajo petición). El uso de células de alta calidad DFAT este método se han generado con la capacidad de diferenciarse en varios tipos de células incluyendo adipogénica, osteogénica, y las células condrogénicas. En total, este protocolo de cultivo de células validado mejora la calidad de las células DFAT y puede ser muy útil para mejorar las aplicaciones clínicas de la terapia celular y la ingeniería de tejidos.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC medio&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Este medio se define como DCM en el texto</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>No contiene Mg2+ y Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 100 &mu; m Amarillo</td><td>CORNING CIENCIAS DE LA VIDA&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Halcón 12,5 cm&sup2; Matraz de cultivo celular de cuello inclinado rectangular con tapón de rosca ventilado azul</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>aguja de 18 g</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 20 ml&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Z SERIES CONTADORA</td> DE <td>REJAS BECKMAN COULTER</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

un método eficaz para obtener células de grasa dediferenciado

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

La ingeniería de tejidos y terapia celular son muy prometedores clínicamente. En este sentido, las células multipotentes, tales como las células madre mesenquimales (MSC), se pueden utilizar terapéuticamente, en un futuro próximo, para restaurar la función de órganos dañados. Sin embargo, varios problemas técnicos, incluido el procedimiento altamente invasiva de aislar las MSC y la ineficiencia que rodea su amplificación, actualmente obstaculizan el potencial uso clínico de estas modalidades terapéuticas. En este documento, presentamos un método altamente eficiente para la generación de las células de grasa indiferenciadas (DFAT), células MSC-como. Curiosamente, las células DFAT pueden diferenciarse en varios tipos de células incluyendo adipogénica, osteogénica, y las células condrogénicas. Aunque otros grupos previamente han presentado varios métodos para generar células DFAT de tejido adiposo maduro, nuestro método nos permite producir células DFAT de manera más eficiente. En este sentido, se demuestra que el medio de cultivo DFAT (DCM), suplementado con 20% de SFB,es más eficaz en la generación de células que DFAT DMEM, suplementado con 20% FBS. Además, las células DFAT producidas por nuestro método de cultivo celular se pueden re-diferenciada en varios tipos de tejidos. Como tal, se presenta un modelo muy interesante y útil para el estudio de la desdiferenciación tisular.

<html> En este estudio, el método y el kit de herramientas para la generación de células DFAT se mejoró (Figura 1). Nuestro método nos permite generar células DFAT utilizando tanto DCM y medio DMEM que contenía FBS al 20% (Figura 2). Como tal, se comparó la eficacia de DCM y DMEM en la generación de células DFAT. En este sentido, DCM mejora la proliferación de células DFAT por tres veces en comparación con DMEM, sin importar el número de adipocitos <stron...

Hemos modificado las condiciones para la generación de células DFAT y proporcionamos aquí información sobre el uso de un medio de crecimiento mejorado para la producción de estas células.

Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

El objetivo general de este novedoso método de cultivo celular es generar células adiposas dediferenciadas con mayor eficiencia. Nuestro método podría ayudar a los investigadores que trabajan en el campo de la medicina regenerativa a responder preguntas clave sobre los diversos procesos implicados en la producción de células adipogénicas, osteogénicas y condrogénicas. Dado que la ventaja principal de nuestro protocolo de cultivo celular es que mejora la calidad de las células DEFAT, podría aplicarse en un futuro próximo para mejorar las aplicaciones actuales en terapia celular e ingeniería de tejidos.Después de llevar la muestra de grasa subcutánea del paciente desde el quirófano al laboratorio, pese el tejido y coloque una muestra de uno a dos gramos de tejido adiposo en un tubo de 15 mililitros. Luego, lave la muestra con cinco mililitros de PBS y transfiera la muestra a una placa plástica de 10 centímetros. Retire el PBS.Luego, agregue 10 mililitros de colagenasa estéril al 0,1% peso por volumen al recipiente que contiene la muestra. A continuación, use tijeras quirúrgicas para picar el tejido hasta que alcance una consistencia homogénea. Transfiera el tejido picado y la solució

an-efficient-method-to-obtain-dedifferentiated-fat-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los adipocitos maduros pueden representar una fuente abundante de células madre a través de la desdiferenciación, lo que conduce a una población homogénea de células similares a los fibroblastos. La digestión de la colagenasa se utiliza para aislar los adipocitos maduros de la grasa humana. El objetivo de nuestro protocolo es obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.

La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco a partir de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia. Los FAPs obtenidos de este protocolo pueden expandirse y diferenciarse eficazmente a miofibroblastos y adipocitos.

Aislamiento, expansión y diferenciación de progenitores fibro-adipogénicos a partir del modelo de ratón espinoso

Aquí, presentamos un protocolo que puede transformar el tejido adiposo autólogo en varias sustancias componentes adiposas con diferentes propiedades y funciones fisicoquímicas.

Innovador fraccionamiento de tejido adiposo para transformar la grasa en componentes especializados

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprenda a generar células de grasa dediferenciadas (DFAT) con mayor eficiencia mediante este protocolo de cultivo celular mejorado. Este método optimiza la calidad celular para aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos.

Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

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