Name: Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a desarrollar y mantener modelos de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes para evaluar terapias antitumorales novedosas. Este método permite estudiar la eficacia de fármacos y descubrir biomarcadores predictivos en oncología.

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Este trabajo fue financiado por la subvención 1R01CA152303-01.

Declaración de Ética: las muestras de tumor de adenocarcinoma colorrectal derivados de los pacientes se obtuvieron de pacientes que consienten en la Universidad de Colorado Hospital, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional múltiple Colorado (08 a 0439). Todo el trabajo de los animales se realizó en animales protocolos aprobados por la Universidad de Colorado en Denver Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, Protocolo # 51412 (06) 1E y 96813 (04) 1E). 1. Recepción y Preparación de la sangre del paciente <ol><li> Recoger 1 - 2 ml de sangre en un tubo de separación de sangre / célula que contiene citrato de sodio (fases tubo incluidos son plasma, linfocitos y monocitos banda, líquido de gradiente de densidad, la barrera de gel, y los eritrocitos y neutrófilos). Precaución, siga las pautas transmitidos por la sangre con el patógeno de la sangre o tejido. Nota: Las PBMC y plasma podrían ser utilizados para estudios futuros que pueden incluir: la comparación de la variación genética de la línea germinal con mutaciones tumorales, aislando Circulalas células tumorales Ting, que evaluaron el ADN celular gratis (cfDNA), que examinan las proteínas y los microARNs, etc. </li><li> Centrifugar el tubo de separación / glóbulos en 2500 xg durante 15 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Recoger las células mononucleares de sangre periférica (CMSP en linfocitos y la banda de los monocitos del tubo) y puesto en un tubo de 1.5 ml (claro, autoclave, DNasa, RNasa y libre de pirógenos), y llene hasta la parte superior del tubo con tamponada con fosfato estéril Saline (PBS). <ol><li> Centrifugar a 2300 xg durante 3 min a temperatura ambiente para formar un sedimento de PBMC en la parte inferior del tubo. A continuación, eliminar el sobrenadante con cuidado. Añadir 1 ml de PBS estéril para lavar el sedimento y se centrifuga a 3.000 g durante 30 segundos y luego eliminar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Utilizar una pipeta para recoger el plasma del tubo de separación de sangre / célula (en fase de plasma del tubo) en un vial criogénico de 1,5 ml estéril (DNasa y RNasa libre, ningún ADN humano, libre de endotoxinas) y poner el plasma y el sedimento de PBMC de en una -80 ° C freezer para el almacenamiento. </li></ol> 2. Recepción y Preparación del Paciente muestra de tumor <ol><li> Preparar ya sea RPMI o medio DMEM con 1: 100 (10%) de penicilina-estreptomicina y no esenciales aminoácidos, 1: 1000 (1%) Plasmocin, y 10% inactivado suero bovino fetal (medio completo) y añadir 20 a 25 ml a un recipiente de recolección estéril para el espécimen. </li><li> Recuperar muestra de tumor en un recipiente estéril que contiene un medio completo sobre hielo o mantener a 4 ° C. Nota: La muestra de tumor es una pieza de un exceso de tejido tumoral del paciente que se elimina por un cirujano, procesada por un patólogo, y se coloca en un recipiente de recolección estéril con medio completo. Precaución, siga las pautas transmitidos por la sangre con el patógeno de la sangre o tejido. Además, idealmente para inyectar cinco ratones, el tumor debe ser de aproximadamente 1 cm $ ³ $. </li><li> Llevar la muestra tumoral para la instalación de animales para inyectar en ratones inmunodeprimidos. Nota: Es mejor para procesar la muestra de tumor tan pronto como sea posible. <ol><li> En una campana de flujo laminar, colocar la muestra de tumor en un plato de corte de plástico estéril de la copa del tumor. Con unas tijeras en autoclave-pequeñas y pinzas para cortar en 10 - 12 piezas de aproximadamente 3 x 3 x 3 mm y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en autoclave llena con 300 l de solución de mezcla de proteína gelatinosa. Mantener el tubo en hielo. </li><li> Como prioridad inyectar tumoral en ratones, pero si hay cualquier tumor que queda, recoger los viales se congelaron rápidamente (FF) tazas, fijados con formol y embebidos en parafina (FFPE), y un vial de tumor viable. </li><li> Para FF, recoger pequeños trozos de tejidos tumorales de un vial criogénico estéril para su posterior análisis como la proteína, el ARN, o el aislamiento de ADN. Coloque FF inmediatamente en un termo de nitrógeno líquido y almacenar a largo plazo en un congelador a -80ºC. </li><li> Para FFPE, si hay suficiente tumor, el lugar 3 pequeños trozos en una taza de formalina 10 ml 10% y el proceso en bloques incrustados de parafina una vez tumor ha sido en formalina durante al menos 24 h. Nota: 24 h se basafuera de nuestras sugerencias Histología 11 de núcleo. </li><li> Por último, colocar el tumor restante en un tubo criogénico. Hacer medios viables mediante la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO) para completar los medios de comunicación. A continuación, añadir 1 ml a un tubo criogénico y almacenar en hielo. Nota: No mantener en hielo durante largos períodos de tiempo. <ol><li> Cortar cualquier tumor en pequeños trozos sobrantes que idealmente será suficiente para 10 tumores que se inyecta en 5 ratones en el futuro. A continuación, colocar el tubo de tumor viable en hielo hasta que se puede colocar en un recipiente de congelación alcohol isopropílico (lentamente congela el tumor 1 ° C a la vez) y se pone en -80 ° C congelador para asegurarse de que los tumores no mueren durante el proceso de congelación. Nota: Para el almacenamiento a largo plazo los tumores se extirpan (después de 2 - 3 días) y se colocaron en un gran vaso Dewar de nitrógeno líquido. Tenga en cuenta que los tubos viables no se debe permitir que se descongele a no ser que se está tomando a cabo para inyectar en ratones. </li></ol></li></ol></li></ol> 3.La inyección de derivados de los pacientes xenoinjertos de tumores <ol><li> Utilice cinco 6 - 8 semanas de edad macho y / o ratones desnudos atímicos hembra (de células T deficientes) para cada tumor derivado del paciente por separado. Inyectar un total de 10 tumores (2 inyecciones por ratón) por vía subcutánea (SQ). Nota: El tumor humano original es designado como F0 y luego una vez inyectado en ratones la próxima generación es F1. Además, el uso de fórceps, tijeras, tratado al autoclave y trócares para cada explante única. </li><li> piezas de carga de tumor de la solución de la mezcla de proteína gelatinosa en tratados en autoclave 12 trócares G y asegurar que el tumor está completamente introducido en el trocar. <ol><li> En una campana de flujo laminar estéril, coloque 5 ratones en una caja de la anestesia que está conectado a una máquina de isoflurano anestesia (iniciado en la velocidad inicial de 5% de isoflurano, 3-4% de oxígeno, y 2-3% de isoflurano para el mantenimiento de la anestesia) y el filtro de carbón (absorbe el exceso de gas). Nota: Un técnico experimentado debe ser capaz de realizar todo el procedimiento deuna jaula de 5 ratones dentro de aproximadamente 5 min (aproximadamente 30 segundos por ratón). Por lo tanto el apoyo térmica adicional y la lubricación del ojo no se utilizan generalmente. Para las personas con menos experiencia o durante el entrenamiento, es muy recomendable que los individuos, ya sea realizar el procedimiento en menos de animales al mismo tiempo y / o utilizan una almohadilla de lubricación / ojo calentamiento durante el procedimiento si los animales se anestesiaron más de 5 minutos. Procedimiento se basa en las normas del IACUC en nuestra universidad. </li></ol></li><li> Pinch un dedo del pie ratón para garantizar el ratón ya no responde, a continuación, tomar el ratón fuera de la caja isoflurano. Coloca el ratón sobre un campo limpio para inyectar tumores en la región dorsal del cuello media y arrastrando hacia abajo el trocar por vía subcutánea hasta la región del flanco se alcanza con 12 tratados en autoclave trócares G. <ol><li> Entregar subcutáneamente un tumor a cada lado de flanco del ratón. Pellizcar el tumor cuando el trocar se extrae, asegurando que el tumor permanece en la región de flanco deseado. el gemezcla de proteínas latinous se endurece con la temperatura corporal del ratón y encapsula el tumor durante aproximadamente 1 semana para ayudar al crecimiento del tumor y fijarlo al tejido conectivo SQ. La lesión hecha por el trocar no es mayor que 4 mm y no hay necesidad de cerrar la piel con grapas. Nota: Nuestros veterinarios determinaron ningún cierre se necesita basa en muy pequeño tamaño de la lesión, el tiempo de curación rápida (región dorsal del cuello media reduce cualquier tensión de la piel o el aseo de la lesión), no hay infecciones observadas, y un estrecho seguimiento de los animales durante este período de tiempo . </li></ol></li><li> Antes de que el ratón está totalmente despierto inject Meloxicam 2 mg / kg SQ (medicamentos para el dolor) de distancia del sitio de la inyección del tumor. A continuación, colocar el puntero del ratón en la jaula y monitorear hasta que el ratón está despierto y en movimiento. Nota: No deje desatendida la recuperación de los animales hasta que esté completamente despierto. la dosis de meloxicam se basa en las normas del IACUC en nuestra universidad. <ol><li> A continuación, repita el mismo procedimiento con el 4restante ratones y controlar su respiración. Nota: Tenga en cuenta que este es un procedimiento muy rápido y los ratones se despierta muy pronto después de la inyección Meloxicam, pero isoflurano ajustar según sea necesario. Cada vez que un ratón se saca, baje el isoflurano. El meloxicam tendrá una duración de 24 horas y las lesiones de los trócares se cura totalmente en 1 semana. </li></ol></li></ol> 4. Mantenimiento de los derivados de los pacientes xenoinjertos de tumores Banco <ol><li> Controlar el crecimiento y la salud de los ratones al menos una vez por semana. Use una hoja de cálculo (u otro sistema de seguimiento) para realizar un seguimiento del tamaño del tumor, la generación del cáncer, la fecha de la inyección del tumor, y la salud de los ratones. Nota: Si los ratones han perdido 15% de su peso corporal original, condición corporal baja (≥ 2), han ulceraciones tumorales, tumores alcanzando 2,000 mm 3 o tumores total de 3.000 mm3, o están enfermos (encorvada, frío, letargo, etc. .) de cualquier forma, los ratones son sacrificados a través de CO₂ o anestesiados seguido por dislocación cervical como comoecondary método. La eutanasia a través de la anestesia y la dislocación cervical si la recogida del tumor, de lo contrario los ratones son sacrificados a través de CO₂ y dislocación cervical. </li><li> Cuando un tumor es de aproximadamente 1,500-2,000 mm 3 anestesiar a los ratones como se describe arriba y luego realizar la dislocación cervical para la eutanasia. <ol><li> Compruebe que el ratón sin latido. Extirpar el tumor SQ con tijeras y pinzas tratadas en autoclave. NOTA: Permitir que los tumores crezcan hasta por 1 año y si no se observa tumor continuación, la eutanasia a los ratones a través de CO 2, seguido por dislocación cervical como método secundario. </li><li> Pasaje el mejor tumor que está creciendo en la próxima generación (también conocido como un nuevo conjunto de 5 ratones). Use las instrucciones de arriba para recoger 10 - 12 para el paso de los tumores y luego recoger el tumor de sobra como también se ha descrito anteriormente. Nota: El cobro de numerosos tubos viables es muy importante en las primeras generaciones (F1 - F8); Por lo tanto, recoger varios tubos, tubos viables FF, y 1 FFPE por geion. </li><li> Mantener a los ratones restantes hasta que una nueva generación de ratones tiene el crecimiento del tumor de aproximadamente 300 mm3. Cuando los ratones restantes tienen tumores que son grandes, continuar para recoger como se describe anteriormente. </li></ol></li><li> Continuar con los tumores de paso y recoger en cada etapa hasta F15. En este punto, tome un tubo viable de la primera generación posible de nitrógeno líquido y dejar descongelar en hielo y siga los procedimientos de inyección de tumores descritos anteriormente. Nota: Los tumores que crecen a partir de tubos viables toman más tiempo para crecer en comparación con los ratones que pasa de generación en generación, así que tenlo en cuenta al planificar. Si un modelo PDTX particular, ya no es necesario en cualquier pasaje, la eutanasia y recoger el tumor, para garantizar numerosos tubos viables se recogen para su uso futuro. </li></ol> 5. Desarrollo Terapéutica con derivados de los pacientes xenoinjertos de tumores Nota: La mayoría de los tumores en la generación F3 tienen una buena cinética de crecimiento (crecen más rápido y más consistent), por lo tanto, proceder a PDTX estudios de eficacia de los medicamentos. <ol><li> Cuando el tumor deseado es muy grande (1500 - 2000 mm 3), siga los procedimientos de arriba para recoger tumor para expandirse en cantidad deseada de ratones. <ol><li> Dependiendo de la hipótesis que está siendo probado determinar el número de tumores por grupo de tratamiento necesarios. Nota: 1 ml de solución mezcla de proteína gelatinosa puede aproximadamente ajuste 30 piezas tumorales pequeñas (en función de la morfología del tumor) para inyectar en ratones. </li></ol></li><li> Verificar los ratones con tumores semanales y cuando la mayoría de los tumores son visiblemente pequeña (aproximadamente entre 50 a 300 mm $ ³ $) medir los tumores con calibradores para determinar el volumen del tumor. El volumen del tumor = [width² (medición más pequeño) x longitud (medida más grande)] x 0,52. Nota: La solución de la mezcla de proteína gelatinosa rodea las piezas tumorales inyectadas por una semana, a continuación, después del crecimiento del tumor una semana será exacta. </li><li> Usa los volúmenes tumorales entre 50 - 300 mm $ ³ $ y lan promediar la tumores izquierdo y derecho. A continuación, selecciona aleatoriamente en grupos de tratamiento con 10 tumores por grupo y una media de grupo dentro de un par de números de diferencia. A continuación, ordenar los ratones en grupos y comenzar el estudio de tratamiento deseado. </li><li> La dosis a los ratones con el fármaco (horario depende de la droga), pesar y medir (tumor) dos veces por semana. Al final del estudio, la eutanasia a los ratones a través de la anestesia y la dislocación cervical y recoger tumor para el análisis farmacodinámico futuro en el laboratorio. Nota: El estudio tiene una duración de 30 días, dependiendo del tamaño del tumor vehículo y la salud de los ratones. </li></ol> 6. Organización de un banco PDTX <ol><li> Mantener una forma bien documentada para prevenir la repetición de la investigación y el uso apropiado de los animales. NOTA: Esto es clave para un banco PDTX éxito. <ol><li> Utilizar hojas de cálculo para realizar un seguimiento de un tumor del paciente en la clínica humana, a los ratones en el banco PDTX, tratamientos de datos, y lo que se recoge. Nota: esto incluye congelador, termos de nitrógeno líquidoY almacenamiento FFPE también. </li></ol></li></ol>

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<li>Ikebuchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+c-Met+phosphotyrosine+sites+in+human+cells+in+response+to+mouse+hepatocyte+growth+factor+but+not+human+hepatocyte+growth+factor%3A+the+possible+roles+of+different+amino+acids+in+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Funct%22%5BJournal%5D)">Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species.</a> Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).</li>
<li>Zhang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+growth+of+human+met-expressing+xenografts+in+a+new+strain+of+immunocompromised+mice+transgenic+for+human+hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor.</a> Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La plataforma de descubrimiento de fármacos PDTX ofrece un modelo mejorado de las deficiencias de otros modelos preclínicos que son poco fiables para predecir la actividad clínica de nuevos compuestos. Es importante destacar que los tumores en este modelo son biológicamente estable, retener potencial metastásico, y muestran la capacidad de respuesta droga similar de generación en generación. En este modelo, los tumores de pacientes derivada se inyectan en ratones desnudos atímicos, pases, y posteriormente utilizados en ...

El cáncer colorrectal (CCR) es un importante contribuyente a las muertes por cáncer en los Estados Unidos. En 2015, había un estimado de 132.700 nuevos casos de CCR con 49.700 muertes 1. Aunque el pronóstico en pacientes con enfermedad localizada es excelente, los pacientes con enfermedad avanzada tienen resultados pobres, haciendo de esta una de las principales prioridades en el desarrollo de nuevas terapias. A pesar de los regímenes estándar de cuidado quimioterapéuticos y biológicos más nuevos que se implementan contra esta enfermedad, sólo ha habido un aumento gradual en la supervivencia global. En consecuencia, hay un esfuerzo significativo en la comprensión de las vías conductor implicado en facilitar el crecimiento del tumor en esta enfermedad. La Red Atlas del Genoma del Cáncer ha identificado recientemente numerosas vías principales que están implicados en la desregulación y CRC incluyen: WNT, fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K), RAS, factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y TP53 2. Juntos, con la descripción de las investigaciones otsus vías que potencien el crecimiento en el CCR han encendido el desarrollo de nuevas terapias destinadas a mejorar significativamente la supervivencia en esta población de pacientes 3-5. Utilizando modelos preclínicos en el desarrollo de fármacos oncológicos han sido esenciales en este proceso en la predicción de la actividad clínica de estos nuevos compuestos. Varios modelos preclínicos se han utilizado en el proceso de desarrollo de fármacos. Teniendo en cuenta que los modelos animales preclínicos transgénicas y líneas celulares inmortalizadas no han tenido éxito en la determinación de la actividad clínica de nuevas terapias de oncología, en gran parte debido a su incapacidad para reflejar la complejidad de los tumores humanos, se han establecido derivado del paciente de xenoinjertos de tumores (PDTX) modelos. La mayor ventaja de este modelo es que la heterogeneidad del tumor se mantiene intacto y refleja fielmente las características moleculares y clonalidad del tumor del paciente 6-9 originario. PDTX modelos proporcionan una excelente in vivoplataforma preclínico para el estudio de nuevos agentes, las vías de resistencia a fármacos, estrategias combinatorias, y la biología de células madre del cáncer 10. Una visión general del proceso de PDTX se ilustra en la Figura 1. Se inicia en la clínica, consintiendo pacientes para permitir que parte de su exceso de tejido tumoral que se utilizará para esta investigación. A continuación, en la cirugía, un pedazo del tumor se ganó en total por un patólogo y puesto en los medios de comunicación para ser transportado a personal de investigación. Inmediatamente después de esto, una sección del tumor se corta en trozos pequeños y trasplantado en ratones inmunodeficientes subcutáneamente. Una vez que el tumor crece, es pasado en diferentes generaciones de ratones con el fin de mantener el tumor 10. Normalmente, después de la generación F3 del tumor se puede ampliar en un estudio de tratamiento donde se evalúan nuevos compuestos y / o terapias combinadas. Utilizando Next Gen SEQ (Exoma Seq, ARN SEQ y SNP array) potenciales biomarcadores predictivos son descubrired que ayudan en la selección de pacientes que podrían beneficiarse de la de un tratamiento particular. Los objetivos generales de la utilización de modelos PDTX son los siguientes: 1) evaluar la eficacia de las terapias innovadoras como agente único o en combinación y 2) identificar biomarcadores predictivos de sensibilidad o resistencia antes de la investigación clínica. En este manuscrito, proporcionamos la metodología en la iniciación y mantenimiento de un banco CRC PDTX y proporcionar las ventajas y limitaciones de este modelo de desarrollo descubrimiento de fármacos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54393/54393fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción general del modelo de protocolo CRC PDTX. Un tumor derivado del paciente se recibe de la cirugía e inmediatamente se inyecta en ratones desnudos atímicos por vía subcutánea. Una vez que el tumor crece, se expande en las generaciones posteriores y, finalmente, se expandió por los estudios de tratamiento. tratamiento RESPOns son evaluados y biomarcadores predictivos son identificados que pueden ayudar en la selección de los pacientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54393/54393fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>RPMI o DMEM</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>Descongelación en -4 & grados; C, luego actívelo durante 30 minutos a 60 &deg; C Baño de agua</td></tr><tr><td>CPT tubo de sangre BD</td><td>vacutainer</td><td>362761</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Surelock</td><td>A-7002</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Viales cirogénicos</td><td>Cyroking</td><td>C0732901</td><td></td></tr><tr><td>plato de plástico para cortar tumores</td><td>Trueline</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Roboz</td><td>Pinzas RS-5881</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (mezcla de proteínas gelatinosas)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Almacenar a -20 o -80 & grados; C, luego descongele en hielo, no deje en RT</td></tr><tr><td>tazas de formalina al 10%</td><td>Protocolo</td><td>032-059</td><td></td></tr><tr><td>Almacenamiento de nitrógeno líquido Dewar</td><td>Thermolyne</td><td>CY50900</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido portátil dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-2000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Fischer</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación: Mr Frosty</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Decon</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trocars</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Patterson Caja</td> de anestesia veterinaria <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Patterson Isoflurano</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>veterinario Vet uno</td><td>1038005</td><td></td></tr><tr><td>Bote de aire F-Air</td><td>Bickford Omnicon</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Vet one</td><td>5182-90C</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fowler</td><td>54-100-167</td><td></td></tr><tr><td>Báscula</td><td>Ohaus</td><td>Scout Pro SP601</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos derivado modelo de xenoinjerto para la investigación de novela anti-cancer therapies

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Los modelos de xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDTX) proporcionan una plataforma necesaria para facilitar el desarrollo de fármacos contra el cáncer antes de los ensayos en humanos. Los trozos de tumores humanos se inyectan por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos (inmunocomprometidos, deficientes en células T) para crear un banco de tumores y, posteriormente, se pasan a diferentes generaciones de ratones con el fin de mantener estos tumores de los pacientes. Es importante destacar que la heterogeneidad celular del tumor original se emula estrechamente en este modelo, que proporciona un modelo clínicamente más relevante para la evaluación de estudios de eficacia de fármacos (agente único y combinación), análisis de biomarcadores, vías de resistencia y biología de células madre cancerosas. Algunas limitaciones del modelo PDTX incluyen el reemplazo del estroma humano por estroma de ratón después de la primera generación en ratones, la incapacidad de investigar los efectos del tratamiento sobre la metástasis debido a las inyecciones subcutáneas de los tumores y la falta de evaluación de inmunoterapias debido al uso de ratones inmunocomprometidos. Sin embargo, incluso con estas limitaciones, el modelo PDTX proporciona una potente plataforma preclínica en el proceso de descubrimiento de fármacos.

Similitudes de mutaciones comunes en los modelos CRC PDTX y el TCGA Hemos investigado si el porcentaje de mutaciones comunes (KRAS, las ANR, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 y TP53) en el banco CRC PDTX eran representativas de la frecuencia de mutación se observa en la población de pacientes de CRC. Como se muestra en la Figura 2A (TCGA) y B (CRC banco PDTX), la frecuencia d...

La utilización de los tumores derivados del paciente en un modelo preclínico subcutánea es una manera excelente para estudiar la eficacia de nuevas terapias, el descubrimiento de biomarcadores predictivos y vías resistentes a los fármacos. Este modelo, en el proceso de desarrollo de fármacos, es fundamental para determinar el destino de muchas nuevas terapias contra el cáncer antes de la investigación clínica.

Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

El objetivo general de este procedimiento de xenoinjerto de tumor derivado del paciente por vía subcutánea es estudiar la eficacia de nuevas terapias, el descubrimiento de biomarcadores predictivos y las vías de resistencia a fármacos en tumores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología sobre si un fármaco determinado exhibe actividad contra un tipo específico de tumor. La principal ventaja de esta técnica es que los xenoinjertos de tumor derivados del paciente conservan la heterogeneidad molecular, genética e histológica típica de los tumores de origen, lo que hace que el modelo sea más clínicamente relevante.La procedura será demostrada por Stacey Bagby, una asistente de investigación profesional y técnica veterinaria certificada de nuestro laboratorio. Después de recolectar uno a dos mililitros de sangre en un tubo de separación de células sanguíneas que contiene citrato de sodio, centrifugue las muestras y transfiera la capa de células mononucleares periféricas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Llene el tubo hasta arriba con PBS estéril.Luego, centrifugar las células nuevamente. A continuación, realizar un lavado rápido con un mililitro de PBS, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de PBMC. Luego, usar una pipeta para transferir el plasma desde el tubo de recolección de células sanguíneas a un vial criogénico estéril de 1,5 mililitros y almacenar el plasma y el pellet de PBMC a menos 80 grados Celsius.Transfiera el tejido tumoral humano a la instalación animal en un vaso estéril que contenga medio completo y coloque el vaso en una cabina de flujo laminar. Lo antes posible, después de la recolección, transfiera el tejido a un recipiente de corte plástico estéril con una pequeña cantidad de medio de recuperación. Luego, utilizando tijeras y pinzas pequeñas esterilizadas en autoclave, corte el tejido en trozos de aproximadamente tres por tres por tres milímetros y coloque de 10 a 12 trozos en un tubo microcentrífugo esterilizado en autoclave de 1,5 mililitros que contenga 300 microlitros de solución de mezcla proteica gelatinosa sobre hielo para la implantación.Para almacenamiento flash congelado, transfiera el número apropiado de fragmentos tumorales a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y coloque el tubo en un recipiente con nitrógeno líquido. Luego, colóquelo en un congelador a menos 80 grados Celsius. Para fijación formaldehídica e inclusión en parafina, coloque tres pequeños fragmentos tumorales en un recipiente de 10 mililitros con formalina al 10 % durante 24 horas.Después de procesar los tejidos en bloques embebidos en parafina, transfiera los fragmentos de tejido restantes a un tubo criogénico. A continuación, agregue un mililitro de medio completo suplementado con 10% DMSO al tejido y almacene los tubos sobre hielo hasta que puedan transferirse a un recipiente de congelación de alcohol isopropílico. Luego, coloque ese recipiente en un congelador a menos 80 grados Celsius.Para inyectar el tejido tumoral, cargue los fragmentos de tumor almacenados en la solución de mezcla de proteína gelatinosa en trocares esterilizados de calibre 12, teniendo cuidado de que cada fragmento de tumor se inserte completamente dentro del trocar. A continuación, confirme la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo del pie en un ratón desnudo, atímico, de seis a ocho semanas de edad, y transfiera el ratón a un campo limpio dentro de una campana de flujo laminar estéril. Introduzca el tumor F0 subcutáneamente en la región dorsal del cuello y en cada lado del flanco del ratón, seguido por la administración subcutánea de analgesia distal a uno de los sitios del flanco donde se inyectó el tumor.Luego, devuelva el ratón a su jaula con monitoreo hasta que se recupere completamente. Monitoree el crecimiento y la salud de los ratones con xenoinjertos al menos una vez por semana, registrando el tamaño de los tumores, la generación de tumores, la fecha de inyección de los tumores y la salud de los ratones en un sistema de seguimiento adecuado. Cuando un tumor alcance aproximadamente entre 1.500 y 2.000 milímetros cúbicos de tamaño, use tijeras y pinzas autoclavadas para extirpar el tumor y pasar el tumor F1 a la siguiente generación de cinco animales, como se acaba de demostrar, teniendo cuidado de recolectar muestras de tumor fijadas en formalina y viables congeladas rápidamente, tal como se mostró para cada tumor.Cuando los ratones restantes del grupo de tumores F0 presenten tumores de aproximadamente 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos de tamaño, recolecte estos tumores tal como se acaba de demostrar para la recolección. Cuando se alcance la generación de tumores en la etapa F15, utilice la generación más temprana de fragmentos de tumor viables disponibles en almacenamiento con nitrógeno líquido para la siguiente serie de inyecciones tumorales. Cuando el tumor deseado sea muy grande, de 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos, siga los procedimientos anteriores para recolectar el tumor y expandirlo en la cantidad deseada de ratones.Dosifique a los ratones con el fármaco y péselos y mídalos dos veces por semana. Asigne al azar a los ratones a grupos de tratamiento con 10 tumores por grupo, y un volumen tumoral promedio entre 100 y 300 milímetros cúbicos, dentro de unas pocas desviaciones estándar entre sí. Luego, distribuya a los ratones en los grupos apropiados para el tratamiento.La hibridación fluorescente in situ de dos colores para el ADN humano y murino muestra que las células estromales humanas en el tumor F0 son reemplazadas por células estromales murinas en el tumor F1. Mientras que todo el factor de crecimiento hepatocito humano derivado en la generación F0 es reemplazado por el factor de crecimiento hepatocito murino en la generación F1, el ligando del factor de crecimiento endotelial vascular consiste en proteínas tanto humanas como murinas en la generación F1. El tratamiento de diferentes generaciones del mismo tumor no cambia la respuesta al tratamiento.Con la resistencia o sensibilidad del tumor que parece ser específica del linaje tumoral más que de la generación del tumor. Además, la frecuencia de mutaciones en estos genes comúnmente mutados es muy similar entre el atlas del genoma del cáncer y el banco de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer colorrectal, lo que sugiere que las mutaciones comunes observadas en la población de pacientes con cáncer colorrectal están bien representadas en el modelo de xenotransplante derivado de pacientes con cáncer colorrectal.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una a dos horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental contar con un equipo clínico cohesionado para identificar y obtener el consentimiento de los pacientes con cáncer, así como para la extracción y seccionamiento macroscópico del tejido tumoral. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la investigación de compuestos anticancerígenos como agentes individuales o en combinación, para responder preguntas adicionales sobre la viabilidad de estas estrategias en pacientes con un tipo específico de tumor.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran nuevos tratamientos contra el cáncer, la heterogeneidad tumoral, los mecanismos de resistencia al tratamiento, la biología de las células madre cancerosas y las interacciones estromales tumorales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar y mantener un modelo de xenoinjerto tumoral derivado de pacientes para evaluar nuevos tratamientos contra el cáncer.

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Las células humanas de mieloma múltiple (MM) requieren el microambiente de apoyo de células mesenquimales y componentes de la matriz extracelular para la supervivencia y proliferación. Hemos establecido un modelo in vivo de embriones en pollo con células de mieloma y mesenquimales humanas injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer en el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

El trasplante de células cancerosas es una herramienta importante para la identificación de mecanismos de cáncer y respuestas terapéuticas. Las técnicas actuales dependen de animales inmuno-incompetentes. En este artículo, describimos un método para trasplantar células tumorales de pez cebra en embriones inmune-competentes para el análisis a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y las respuestas in vivo a los fármacos.

Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) recapitulan más robustamente las características moleculares y biológicas del melanoma y son más predictivos de la respuesta terapéutica en comparación con los ensayos tradicionales basados en el cultivo de tejido plástico. Aquí describimos nuestro protocolo operativo estándar para el establecimiento de nuevos modelos PDX y la caracterización/experimentación de los modelos PDX existentes.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma

Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

El protocolo actual describe métodos para establecer modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX) y líneas celulares primarias de cáncer a partir de muestras de cáncer gástrico quirúrgico. Los métodos proporcionan una herramienta útil para el desarrollo de fármacos y la investigación de la biología del cáncer.

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

En el siguiente trabajo, describimos los pasos consecutivos necesarios para el establecimiento de un gran biobanco de cáncer colorrectal y pancreático.

Creación y mantenimiento de un biobanco vivo - Cómo lo hacemos

El presente protocolo establece y caracteriza un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), ya que los modelos PDX se están convirtiendo rápidamente en el estándar en el campo de la oncología traslacional.

Establecimiento y caracterización de modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de carcinoma anaplásico de tiroides y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.

Presentación de oportunidades terapéuticas con modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma

Este protocolo describe el xenoinjerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B y T derivadas del paciente, que ocurre 4 días después de la inyección.

En Ovo Xenoinjerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-ALL)

Aprende a desarrollar y mantener modelos de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes para evaluar terapias antitumorales novedosas. Este método permite estudiar la eficacia de fármacos y descubrir biomarcadores predictivos en oncología.

Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies (Video) | JoVE Journal

Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies

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