Imitando la función de las proteínas de señalización: hacia artificial de la señal de transducción Terapia
29 de septiembre de 2016
Presentamos directrices para el desarrollo de 'transductores químicos' sintéticos que puedan inducir la comunicación entre proteínas naturalmente no relacionadas. Además, se presentan protocolos detallados para sintetizar y probar un "transductor" específico que permite a un factor de crecimiento activar una enzima desintoxicante y, en consecuencia, regular la escisión de un profármaco anticancerígeno.
El objetivo general de este experimento es seguir espectroscópicamente la comunicación antinatural entre dos proteínas inducida por un transductor químico sintético. Se demostrará la posibilidad de desarrollar análogos sintéticos de proteínas de señalización que serán capaces de llevar a cabo vías de transducción de señales que no se encuentran en la naturaleza. La capacidad de seguir la comunicación de proteína a proteína no natural mediante un espectrofotómetro común podría ayudar a desarrollar y mejorar la función de los transductores químicos artificiales y acercarnos al logro de la terapia de transducción de señales artificiales.
El transductor químico está compuesto por un factor de crecimiento derivado de plaquetas, o aptámero PDGF. Un inhibidor bivalente de la amida etacrínica GST, un fluoróforo y un extintor. La síntesis del transductor químico no se demostrará en este video.
Pero se describe en el protocolo de texto. Aquí se ilustran los principios de funcionamiento del transductor químico. El transductor químico inhibe la actividad enzimática de GST, cuando los dos grupos EA se unen a los sitios activos de las enzimas.
La adición de PDGF conduce a la formación del complejo transductor químico PDGF. Lo que interrumpe la interacción transductor-GST, restaurando así la actividad enzimática de GST. La siguiente adición de un aptámero PDGF no modificado libera el transductor químico y le permite volver a inhibir la enzima.
Antes de comenzar los experimentos para examinar el control de la actividad de GST por PDGF, configure un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética. Cree un nuevo experimento como protocolo estándar. Seleccione Procedimiento para abrir la ventana Configuración de procedimientos.
En la lista emergente en la parte superior de la ventana, elija el Tipo de placa 384 según el fabricante de la placa. Seleccione Leer en el menú de la izquierda. Elija Absorbancia para el método de detección.
y punto de conexión para el tipo de lectura. En la ventana Longitud de onda, escriba 340 nanómetros. Seleccione Placa completa y elija los pocillos que se van a medir.
A continuación, haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Leer. En el menú de la izquierda, elija Iniciar cinético. Establezca el tiempo de ejecución en 10 minutos.
Seleccione la opción Intervalos mínimos. A continuación, haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Kinetic. Arrastre la línea de lectura a la medición cinética.
Seleccione el botón Validar, seguido del botón Aceptar. Guarde el experimento. Selecciona el botón Reproducir.
Aparecerá un cuadro de diálogo, pero no seleccione el botón Aceptar hasta que esté listo para iniciar la medición cinética. Una vez que se ha configurado el lector de placas, el siguiente paso es preparar las muestras para medir la actividad de GST en presencia del transductor químico y PDGF. Para probar cuatro concentraciones de PDGF por triplicado, prepare cuatro muestras donde cada una contenga 3,25 microlitros del transductor químico y 3,25 microlitros de GST M-1.
Añadir a cada muestra, cero, 1,2, 2,4 o 4,9 microlitros de PDGF respectivamente. A continuación, añada el volumen adecuado del tampón de ensayo a cada muestra para llevar el volumen total a 130 microlitros. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de 10 minutos, transfiera 40 microlitros de cada muestra a los pocillos de una placa de 384 pocillos transparentes. Transfiera cada una de las cuatro muestras a los pozos pares o impares en la misma fila solamente. Para permitir el uso de un pipeteador múltiple para la adición de sustrato.
A continuación, utilice un pipeteador múltiple de 12 canales para añadir rápidamente a cada muestra 10 microlitros de cada sustrato previamente preparado en una placa de 96 pocillos. Mezclar rápidamente, pero suavemente, para evitar burbujas. Inserte inmediatamente la placa en el lector de placas e inicie la medición cinética seleccionando el botón OK en el cuadro de diálogo.
Para examinar los ciclos de inhibición de la activación de GST mediados por el transductor químico, prepare cinco muestras, cada una de las cuales contiene 84,5 microlitros de tampón de ensayo, 3,25 microlitros de transductor químico y 3,25 microlitros de GST M1-1. Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos.
Agregue 3,65 microlitros de tampón de ensayo a la muestra uno y 3,65 microlitros de PDGF a las muestras dos, tres, cuatro y cinco. Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Añadir 3,12 microlitros de tampón de ensayo a las muestras uno y dos, y 3,12 microlitros de aptámero PDGF a las muestras tres, cuatro y cinco.
Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Añada 24,4 microlitros de tampón de ensayo a las muestras uno, dos y tres. Y 24,4 microlitros de PDGF a las muestras cuatro y cinco.
Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Agregue 7,8 microlitros de tampón de ensayo a las muestras uno a cuatro, y 7,8 microlitros de aptámero PDGF a la muestra cinco. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Transfiera las muestras a una placa de pocillos transparente de 384. Para realizar el experimento por triplicado, y añadir rápidamente el sustrato a las muestras. Inserte la placa en el lector e inicie la medición cinética.
Para comenzar este ensayo, configure un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética como se describe en el texto del protocolo. Prepare dos muestras en dos pocillos de una placa de pocillos transparentes de 384. Para cada pocillo, mezcle un microlitro de GST M1-1 y un microlitro del transductor químico en 38 microlitros de tampón de ensayo.
Deje un pozo vacío entre los dos pozos. Con un pipeteador múltiple de 12 canales, agregue rápidamente 10 microlitros de sustrato a cada pocillo. Y mezclar suave y rápidamente para evitar burbujas.
Inserte inmediatamente la placa en el lector e inicie la medición cinética. Cuando el lector de placas se abra después de 3,5 minutos, agregue rápidamente 1,125 microlitros de PDGF a uno de los pocillos, mezcle suavemente y permita que la placa vuelva a ingresar al lector para las mediciones cinéticas restantes. Antes de preparar las muestras para este experimento, configure un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética como se describe en el texto del protocolo.
Se utilizará un kit colorimétrico de nitrito/nitrato para medir la producción de óxido nítrico. En una placa de 96 pocillos, dispense 50 microlitros de tampón de ensayo por pocillo en la primera fila. 70 microlitros de reactivo Griess One por pocillo en la segunda fila.
Y 70 microlitros de reactivo Griess Two por pozo en la tercera fila. Prepare cuatro muestras, cada una de las cuales contiene 4,8 microlitros del transductor químico. Para tomar una muestra, agregue 155,2 microlitros de tampón de ensayo.
Para tomar la muestra dos, agregue 3,2 microlitros de GST M1-1 y 152 microlitros de tampón de ensayo. Para la muestra tres, agregue 9,6 microlitros de PDGF y 145,6 microlitros de tampón de ensayo. Y para la muestra cuatro, agregue 3,2 microlitros de GST M1-1, 9,6 microlitros de PDGF y 142,4 microlitros de tampón de ensayo.
Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Dispensar 50 microlitros de muestra por pocillo en una placa transparente de 384 pocillos para realizar el experimento por triplicado. Dispense muestras solo a los pocillos pares o impares en la misma línea para permitir el uso de un pipeteador múltiple para la adición de sustrato.
Añadir 0,54 microlitros de profármaco JS-K a cada muestra. Agregue rápidamente a cada muestra 10 microlitros de solución de glutatión y mezcle suave y rápidamente para evitar burbujas. Inserte la placa en el lector e inicie la medición cinética.
Inmediatamente después de la medición cinética, transfiera 50 microlitros de cada muestra a cada pocillo de la primera fila de la placa de 96 pocillos con tampón de ensayo. Luego transfiera 50 microlitros de cada pocillo de la segunda fila del plato a los pocillos de la primera fila del plato. Y 50 microlitros por pocillo desde la tercera fila de la placa hasta los pocillos de la primera fila de la placa.
Incubar protegiendo de la luz durante 10 minutos a temperatura ambiente. Antes de medir la absorbancia a 550 nanómetros. La medición de la actividad de GST sin el transductor químico y con el transductor químico mostró que el transductor químico inhibe la actividad de GST.
El GST se reactiva mediante la adición de concentraciones crecientes de PDGF al complejo de transductores químicos GST. Las adiciones secuenciales de PDGF y un aptámero de PDGF no modificado al complejo transductor químico GST revelaron que la comunicación entre PDGF y GST era reversible. La adición de PDGF al complejo GST-transductor dio lugar a un rápido aumento de la actividad de GST, 3,5 minutos después de añadir los sustratos.
Mientras que la adición de un aptámero PDGF a una mezcla de GST, PDGF y el transductor químico resultó en una disminución de la actividad de GST. Estos resultados indican que el sistema responde en tiempo real a los cambios en su entorno. Posteriormente, se investigó la capacidad de este sistema para controlar la activación de profármacos utilizando JS-K, un profármaco anticancerígeno que se activa mediante GST para liberar óxido nítrico tóxico.
Las mediciones de las cantidades de óxido nítrico liberadas tras la adición de JS-K al transductor químico y las diferentes combinaciones de GST y PDGF confirmaron que solo la presencia de GST y PDGF activa JS-K. Todo esto muestra cómo un agente sintético puede permitir que un factor de crecimiento desencadene la actividad catalítica de la glutatión S-transferasa, que no es su socio enzimático natural. Por lo tanto, la biomimética futura de esta clase puede utilizarse para alterar la respuesta de las células a las señales ambientales o proporcionarles nuevas propiedades.
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Descripción general
Este estudio presenta pautas para desarrollar 'transductores químicos' sintéticos que faciliten la comunicación entre proteínas no relacionadas. Detalla protocolos para sintetizar y probar un transductor específico que activa una enzima desintoxicante mediante un factor de crecimiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- ingeniería de proteínas
- transducción de señales
Antecedentes
- Se puede inducir una comunicación no natural entre proteínas mediante transductores sintéticos.
- El desarrollo de análogos sintéticos de proteínas señalizadoras es crucial para estrategias terapéuticas novedosas.
- Mediante este enfoque se pueden explorar vías de transducción de señales que no existen en la naturaleza.
- Se pueden utilizar espectrofotómetros comunes para seguir estas interacciones.
Objetivo del estudio
- Demostrar la viabilidad de los transductores químicos sintéticos en la comunicación proteica.
- Mejorar la función de los transductores químicos artificiales.
- Avanzar en la terapia de transducción de señales artificiales.
Métodos Utilizados
- Síntesis de un transductor químico compuesto por un aptámero de PDGF.
- Utilización de un inhibidor bivalente de GST de etacrínico amida.
- Incorporación de un fluoróforo y un amortiguador para análisis espectroscópico.
- Configuración experimental para seguir espectroscópicamente interacciones proteicas.
Resultados principales
- Demuestra con éxito la comunicación de proteínas no naturales.
- Potencial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas utilizando transductores sintéticos.
- Conocimientos sobre los mecanismos de las vías de transducción de señales.
- Establecimiento de protocolos para investigaciones futuras en esta área.
Conclusiones
- Los transductores químicos sintéticos pueden mediar eficazmente las interacciones proteicas.
- Esta investigación allana el camino para enfoques innovadores en la terapia de transducción de señales.
- Se necesitan estudios adicionales para optimizar estos sistemas sintéticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este trabajo establece una base para la terapia de transducción de señales artificiales al demostrar cómo los transductores químicos sintéticos pueden mediar una comunicación proteína-proteína no natural. El enfoque permite reducir mecanísticamente los riesgos en la validación de objetivos mediante la creación de vías de señalización ortogonales que evitan los mecanismos reguladores nativos. Dichos sistemas ofrecen valor predictivo en modelos preclínicos al permitir un control temporal preciso de la actividad enzimática, lo cual puede aprovecharse en estrategias de activación de profármacos en oncología y otras áreas de enfermedades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de hipótesis terapéuticas mediante la comunicación inducible y reversible de proteínas entre asociados no nativos.
- Valor operativo: Proporciona un sistema ajustable para evaluar la interacción con el blanco y la modulación de la vía sin manipulación genética.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante la cuantificación de la recuperación dependiente de la dosis de la actividad enzimática en respuesta a ligandos terapéuticos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas y en tiempo real de la dinámica de interacciones proteicas mediante detección espectrofotométrica estándar.
- Valor operativo: Establece un formato de ensayo reproducible compatible con lectores de placas de alta densidad para análisis cinéticos.
- Escalabilidad: Facilita la prueba de condiciones multiplexadas mediante protocolos definidos de titulación de reactivos y adición secuencial.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Demuestra aplicabilidad directa a la activación de profármacos, donde la actividad de GST mediada por el transductor controla la liberación de la carga citotóxica.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Valida que la señal de salida depende tanto del transductor como del ligando correspondiente, reduciendo los riesgos de activación falsa positiva.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Facilita la evaluación de circuitos de señalización artificiales en sistemas relevantes para enfermedades antes de la validación in vivo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un interruptor químicamente inducible que conecta la unión al objetivo con lecturas funcionales, permitiendo avanzar desde la validación de impactos hasta la optimización de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante el control externo de la actividad enzimática a través del cambio conformacional del transductor inducido por ligandos.
- Selección: Ofrece listo para ensayo mediante mediciones cinéticas estandarizadas que reflejan eventos de comunicación proteica en tiempo real.
- Análisis: Genera datos de actividad con resolución temporal que permiten comparar la dinámica de señalización entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Relaciona la interacción con el blanco con resultados funcionales mediante la activación de profármacos, apoyando decisiones de avance o interrupción basadas en la fidelidad de la señal.
- Reutilización Empresarial: Establece un marco de diseño de transductores independiente de la plataforma, aplicable a diversos pares de proteínas más allá de PDGF-GST.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco al desacoplar la señalización del ruido endógeno de la vía.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante proporciones estandarizadas de reactivos, tiempos de incubación y parámetros de detección.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir una evaluación temprana de la viabilidad mecanicista antes de invertir en formatos terapéuticos complejos.
- Impacto en la cartera: Orienta el avance ajustado al riesgo mediante la cuantificación de la especificidad y reversibilidad de los eventos de señalización inducidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en ingeniería de proteínas, diseño de aptámeros y cinética enzimática para optimizar los componentes del transductor.
- Depende del acceso a lectores de placas capaces de realizar mediciones cinéticas de absorbancia a 340 nm y 550 nm.
- Necesita la estandarización entre equipos en la preparación de reactivos y protocolos de incubación para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el diseño del transductor a nuevos pares de proteínas con cinéticas de unión o restricciones estéricas diferentes.
- Comprende limitaciones prácticas, como la estabilidad del transductor, posibles interacciones fuera del blanco y la necesidad de una titulación cuidadosa para evitar la saturación de la señal.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Synthesis and Operating Principles of the 'Chemical Transducer'
1:51
Setting Up the Plate Reader for Kinetic Measurement
3:26
Measuring GST Activity in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
4:59
Evaluating GST Activation/Inhibition Cycles Mediated by the 'Chemical Transducer'
6:37
Evaluating the Real-time Effect of PDGF Addition
7:42
Measuring JS-K Prodrug Activation by GST in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
10:16
Results: 'Chemical Transducer' Induces Artificial Communication Between PDFG and GST
11:53
Conclusion
