Name: Imitando la función de las proteínas de señalización: hacia artificial de la señal de transducción Terapia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende a desarrollar transductores químicos sintéticos que facilitan la comunicación entre proteínas no relacionadas mediante espectrofotometría. Este método avanza la terapia de transducción de señales artificial.

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Esta investigación fue apoyada por la Fundación Minerva, la Organización HFSP, y un Consejo de Investigación Europeo de Grant (Starting Grant 338265).

1. Síntesis de la &#39;química del transductor&#39; <ol><li> Los preparativos preliminares <ol><li> Preparar tampón de acetato de 2 M de trietilamonio (TEAA) mediante la mezcla de 278 ml de trietilamina con 114 ml de ácido acético y 400 ml de agua ultrapura. Se ajusta el pH a 7 y se añade agua hasta un volumen final de 1 L. Guárdelo en un frasco oscuro. Nota: Esta solución es estable durante años. </li><li> Preparar una solución de ácido ascórbico 5 mM por disolución de 18 mg de ácido ascórbico en 20 ml de agua ultrapura. Use una solución fresca; la solución es estable durante un día. </li><li> Preparar una solución de Cu 10 mM (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amina (TBTA) mediante la disolución de 25 mg de cobre (II) pentahidratado sulfato en 10 ml de agua ultrapura y 58 mg de TBTA en 11 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Mezclar las dos soluciones. Mantenerlo a temperatura ambiente y protegerlo de la luz. </li></ol></li><li> procedimiento de conjugación <ol><li> Disolver 100 nmol del oligonucleótido modificado (ODN-1) en 80 lde agua ultra pura fresca. Añadir 20 l de M TEAA 2, pH = 7. Añadir 80 l de una solución recién hecha de ácido ascórbico (5 mM en agua). </li><li> Disolver 1,5 mol (574,5 g) de ácido etacrínico azido-modificado en 180 l de DMSO y añadirlo a la solución. Desgasificar la solución con argón durante 60 segundos y añadir rápidamente 40 l de la solución de TBTA Cu (II) / (10 mM en 55% (v / v) de DMSO / agua). </li><li> Se purga de nuevo con argón, cerrándola, y se agita durante la noche. </li><li> Monitorear el progreso de la reacción y purificar el conjugado por RP-HPLC (fase móvil: A) 5% de acetonitrilo, 5% TEAA, 90% de agua ultrapura; B) 65% de acetonitrilo, 5% TEAA, 30% de agua ultrapura). 24 </li></ol></li></ol> 2. El control de la actividad de GST por PDGF <ol><li> Los preparativos preliminares <ol><li> Preparar 50 ml de tampón de ensayo mediante la mezcla de 33,9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBSx1) con 16,1 ml de agua ultrapura para lograr una concentración de fosfato final de 8 mM y add 23,8 mg de MgCl2 para lograr un 5 mM de concentración final. </li><li> Preparar una solución madre de GST M1-1 disolviendo la proteína en un tampón que contiene 50 mM Tris pH 7,5, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM (DTT), y 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración final de 30 mM. Divida esta solución en pequeñas alícuotas y se almacena a -80 ° C. Diluir recientemente, de acuerdo con la sección 2.1.5.1, en el tampón de ensayo y mantener en hielo. Nota: La solución será estable durante aproximadamente 5 h, o hasta que hay una reducción en la actividad enzimática. </li><li> Preparar el sustrato de acuerdo con las siguientes instrucciones: <ol><li> Disolver 10 mg de glutatión reducido (GSH) en 325 l de agua ultrapura hasta una concentración final de solución madre 100 mM. Diluir 21 l de esta solución madre en 979 l de tampón de ensayo para una concentración final de solución de trabajo de 2,1 mM. </li><li> Disolver 10 mg de 2,4-dinitroclorobenceno (CDNB) en 492 l de correoTHANOL a una concentración final de solución madre 100 mM. Diluir 43,2 l de la solución madre en 956.8 l de un tampón de ensayo para una concentración final de solución de trabajo de 4,32 mM. </li></ol></li><li> En una placa de 96 pocillos, poner cada sustrato en una línea separada (12 pozos). Inserte al menos 60 l en cada pocillo para permitir la retirada fácil y rápida de la solución. Cubrir la placa con una lámina de aluminio para la protección contra la luz. </li><li> Preparar las siguientes soluciones madre en el tampón de ensayo: <ol><li> Diluir GST M1-1 por 50 a una concentración final de 0,6 M de dímero. </li><li> Se diluye la &#39;transductor química&#39; de una solución madre 30 mM. </li><li> Diluir PDGF a una concentración final de 40 mM. </li><li> Diluir PDGF aptámero a una concentración final de 250 mM. </li></ol></li></ol></li><li> Medir la actividad GST en la Presencia del &#39;transductor química&#39; y PDGF. <ol><li> Establecer un procedimiento experimental in el lector de placas para la medición cinética. <ol><li> Crear un nuevo experimento como un &quot;protocolo estándar &#39;. </li><li> Pulse en &quot;procedimiento&quot; para abrir la ventana de parámetros del procedimiento. </li><li> En la lista que aparece en el lado superior de la ventana, seleccione el tipo &#39;384 placa&#39; de acuerdo con el fabricante de la placa. </li><li> Pulse &#39;Leer&#39; en el menú de la izquierda. </li><li> En cuanto al método de detección elija &#39;Absorbancia&#39;. </li><li> En cuanto al tipo de lectura seleccione &#39;punto final&#39;. </li><li> Escribe 340 nm en la ventana de longitud de onda. </li><li> Pulse en la parte inferior &#39;Placa completa&#39; en la parte superior derecha y elegir el bien como para ser medidos. </li><li> Pulse &#39;OK&#39; para cerrar la &#39;Leer&#39; ventana. </li><li> Elija &#39;iniciar cinética&#39; en el menú de la izquierda. </li><li> Hacer que el tiempo de funcionamiento 10 min. </li><li> Seleccionar la opción intervalos mínimos. </li><li> Pulse &#39;Aceptar&#39; para cerrar la ventana cinética. </li><li> Arrastre el &quot;leídas&quot; línea dento la medición cinética. </li><li> Presione el botón &quot;validar&quot; y luego el botón &quot;OK&quot;. </li><li> Guarde el experimento. </li><li> Presione el botón de &#39;play&#39;. Un cuadro de diálogo aparecerá - pulse el botón &quot;OK&quot; sólo cuando la medición se debe iniciar. </li></ol></li><li> Con el fin de realizar el experimento por triplicado, preparar cuatro muestras que contienen cada uno 3,25 l de la &#39;transductor química&#39; y 3,25 l de GST M1-1. Añadir a cada muestra 0, 1,2, 2,4, o 4,9 l de PDGF y 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 o l del tampón de ensayo, respectivamente. </li><li> Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> En una placa de 384-transparente, inserte 40 l de muestra a cada pocillo. Inserte las muestras solamente en los pocillos impares, o sólo en los pocillos, incluso en la misma línea para permitir el uso de un multi-pipeta para la adición de sustrato. </li><li> El uso de un 12 canales multi-pipeta, añadir rápidamente 10 l de cada una de tél sustratos que fueron preparadas de antemano en la placa de 96 pocillos (sección 2.1.4). Mezclar suavemente y rápidamente para evitar burbujas. Inserte la placa en el lector e inicie la medición cinética. Desde la cinética de GST es bastante rápido, tratar de minimizar el tiempo entre la adición del sustrato y el comienzo de la medición cinética. </li></ol></li><li> La activación de GST Ciclos / inhibición mediada por el &#39;transductor química&#39;. <ol><li> Con el fin de realizar el experimento por triplicado, preparar 5 muestras, conteniendo cada uno 84,5 l de tampón de ensayo, 3,25 l de &#39;transductor química&#39;, y 3,25 l de GST M1-1. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Añadir 3,65 l de tampón de ensayo a la muestra 1 y de 3,65 l de PDGF a las muestras 2-5. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Añadir 3,12 l de tampón de ensayo para las muestras 1-2 y 3,12 l de PDGF aptámero a las muestras 3-5. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Añadir 24,4 l de tampón de ensayo a muestras1-3 y 24,4 l de PDGF a las muestras 4-5. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Añadir 7,8 l de tampón de ensayo hasta las muestras 1-4 y 7,8 l de PDGF aptámero a la muestra 5. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> En una placa de 384-transparente, inserte 40 l de muestra en cada pocillo. Las muestras sólo se puede enchufar a la par o solamente en los pocillos, incluso en la misma línea. </li><li> El uso de un 12-canal multi-pipeta, añadir rápidamente 10 l de cada sustrato (pre-preparada en la placa de 96 pocillos). Mezclar suavemente y rápidamente para evitar burbujas. Inserte la placa en el lector e inicie la medición cinética. </li><li> Calcular la V 0 [mod / min] en cada condición restando la DO a 340 nm medido en t = 0,5 min del OD se mide a 340 nm en t = 1,5 min para evaluar la activación / inhibición reciclabilidad. 25 </li></ol></li><li> Evaluar la respuesta en tiempo real de la &#39;transductor química&#39; a cambios en el medio ambiente. <ol> &lt;li&gt; efecto en tiempo real de la adición de PDGF <ol><li> Establecer un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética. </li><li> Repita los pasos 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Hacer que el tiempo de ejecución de 3,5 min. </li><li> Seleccionar la opción intervalos mínimos. </li><li> Pulse &#39;Aceptar&#39; para cerrar la ventana cinética. </li><li> Arrastre la línea &#39;Leer&#39; en la medición cinética. </li><li> Elija Placa de salida / entrada en el menú de la izquierda. </li><li> Elija la opción &#39;se resiembra (sin diálogo)&#39;. </li><li> Elige la opción &quot;Delay&quot; en el menú de la izquierda y entrar en 30 seg. </li><li> Elija Placa de salida / entrada en el menú de la izquierda. </li><li> Elija el &#39;plato en (sin diálogo) &quot;opción. </li><li> Crear una segunda medición cinética repitiendo los pasos 2.2.1.4 - 2.2.1.14 pero en la sección 2.2.1.11 establecer la cinética de ser de 25 minutos en lugar de 10 min. </li><li> Presione el botón &quot;validar&quot; y luego el botón &quot;OK&quot;. </li><li> Guarde el experimento. </li><li> Pulse el &#39;play Botón &#39;. Un cuadro de diálogo aparecerá - pulse el botón &quot;OK&quot; sólo cuando la medición se debe iniciar. </li><li> Se preparan dos muestras mediante la mezcla de 1 l de GST M1-1 y 1 l de la &#39;transductor química&#39; en 38 l de tampón de ensayo. Insertar las muestras en dos pocillos de una placa de 384-transparente, dejando un pozo vacío entre estos dos pozos. </li><li> El uso de un 12 canales multi-pipeta, añadir rápidamente 10 l de cada sustrato, mezclar suavemente y rápidamente para evitar burbujas, insertar la placa en el lector e iniciar la medición cinética. </li><li> Cuando la placa se abre (después de 3,5 minutos), añadir rápidamente 1.125 l de PDGF a uno de los pozos, mezclar suavemente y dejar que la placa de cierre para las mediciones cinéticas restantes. </li></ol></li><li> efecto en tiempo real de la adición de aptámero de PDGF <ol><li> Repita los pasos 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Se preparan dos muestras mediante la mezcla de 1 l de GST M1-1, 1 l de la &#39;transductor química &#39;, y 1.125 l de PDGF en 36,9 l de tampón de ensayo. Insertar las muestras en dos pocillos de una placa de 384-transparente, dejando un pozo vacío entre estos dos pozos. </li><li> El uso de un 12 canales multi-pipeta, añadir rápidamente 10 l de cada sustrato, mezclar suavemente y rápidamente para evitar burbujas, insertar la placa en el lector, e inicie la medición cinética. </li><li> Cuando la placa se abre (después de 1,5 min), añadir rápidamente 1,2 l de PDGF aptámero a uno de los pozos, mezclar suavemente y dejar que la placa para cerrar para las mediciones cinéticas restantes. </li></ol></li></ol></li><li> Medir JS-K profármaco de activación por GST en la Presencia del &#39;transductor química&#39; y PDGF. <ol><li> Establecer un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética. <ol><li> Crear un nuevo experimento como un &quot;protocolo estándar &#39;. </li><li> Pulse en &quot;procedimiento&quot; para abrir la ventana de parámetros del procedimiento.</li><li> En la lista que aparece en el lado superior de la ventana, seleccione el tipo &#39;384 placa&#39; de acuerdo con el fabricante de la placa. </li><li> Pulse &#39;Leer&#39; en el menú de la izquierda. </li><li> En cuanto al método de detección eligió &#39;Absorbancia&#39;. </li><li> En cuanto al tipo de lectura seleccione &#39;punto final&#39;. </li><li> Escribe 305 nm en la ventana de longitud de onda. </li><li> Pulse en el botón &#39;Placa completa&#39; en la parte superior derecha y elegir el bien como para ser medidos. </li><li> Pulse &#39;OK&#39; para cerrar la &#39;Leer&#39; ventana. </li><li> Elija &#39;iniciar cinética&#39; en el menú de la izquierda. </li><li> Hacer que el tiempo de funcionamiento 10 min. </li><li> Seleccionar la opción intervalos mínimos. </li><li> Pulse &#39;Aceptar&#39; para cerrar la ventana cinética. </li><li> Arrastre la línea &#39;Leer&#39; en la medición cinética. </li><li> Presione el botón &quot;validar&quot; y luego el botón &quot;OK&quot;. </li><li> Guarde el experimento. </li><li> Presione el botón de &#39;play&#39;. Un bo de diálogox aparecerá - pulse el botón &quot;OK&quot; sólo cuando la medición se debe iniciar. </li></ol></li><li> Para la producción de NO mediciones utilizan un kit colorimétrico nitrito / nitrato. En una placa de 96 pocillos insertar 50 l de tampón de ensayo en una fila, 70 l de Griess I reactivo en una segunda fila, y 70 l de reactivo de Griess II en una tercera fila. </li><li> Con el fin de realizar el experimento por triplicado, preparar cuatro muestras que contienen cada uno 4,8 l de la &#39;transductor química&#39;. Para muestra 1, añadir 155,2 l de tampón de ensayo; a la muestra 2, añadir 3,2 l de GST-M1-1 y 152 l de tampón de ensayo; a la muestra 3, añadir 9,6 l de PDGF y 145,6 l de tampón de ensayo; y para la muestra 4, añadir 3,2 l de GST-M1-1, 9,6 l de PDGF, y 142,4 l de tampón de ensayo. </li><li> Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> En una placa de 384-transparente, inserte 50 l de muestra en cada pocillo. Las muestras sólo se puede enchufar en el par o sólo en elincluso pozos en la misma línea para permitir el uso de una multi-pipeta para la adición de sustrato. </li><li> Añadir 0,54 l de JS-K (5 mM en DMSO) a cada pocillo. </li><li> El uso de un 12-canal multi-pipeta, añadir rápidamente 10 l de la solución de GSH (pre-preparada en la placa de 96 pocillos), se mezcla suavemente y rápidamente para evitar burbujas. Inserte la placa en el lector e inicie la medición cinética. </li><li> Inmediatamente después de la medición cinética, el uso de un 12-canal multi-pipeta, tomar 50 l de cada muestra en la fila de tampón de ensayo en la placa de 96 pocillos pre-preparado y añadir rápidamente a la misma 50 l de reactivo de Griess I y 50 l de reactivo de Griess II. Incubar la vez que protege de la luz durante 10 minutos a temperatura ambiente y se mide la absorbancia a 550 nm. Nota: El tampón de ensayo y volúmenes de reactivos dependen de protocolo de los kits. </li></ol></li></ol>

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<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos un método para diseñar y probar un "transductor químico" que puede inducir una comunicación artificial entre dos proteínas naturalmente no relacionadas, GST y PDGF, sin modificar las proteínas nativas. Las comunicaciones no naturales GST-PDGF podrían detectarse en tiempo real mediante el uso de ensayos enzimáticos que siguen los cambios en la actividad del GST en presencia del "transductor químico" y el aumento de las concentraciones de PDGF. Además de detectar la activación de GST por PDGF, estos ensayos se ...

Las vías de transducción de señal desempeñan un papel importante en prácticamente todos los procesos celular y permiten a la célula responder rápidamente a las señales ambientales. 1 Estas vías son a menudo desencadenan por la unión de una molécula de señalización a un receptor extracelular, lo que resulta en la activación de enzimas intracelulares. La amplificación y la propagación de esta señal dentro de la célula está mediada por la función de las proteínas que forman una red de interacciones proteína-proteína en el que las enzimas se activan de forma reversible con una alta especificidad de señalización. Debido a la desregulación de estas redes con frecuencia conduce al desarrollo del cáncer, no ha habido mucho interés en el establecimiento de &quot;terapia de transducción de señales de cáncer &#39;, 2 por el que los medicamentos están diseñados para interrumpir las rutas de señalización malignas. Recientemente hemos propuesto un enfoque alternativo a la señal de transducción de la terapia que se basa en la capacidad de los fármacos para generar vías de transducción de señales no naturales. <sup&gt; 3 En particular, creemos que mediante el diseño de agentes sintéticos que imitan la función de las proteínas de señalización, sería posible para modular la función de la célula indirectamente. Por ejemplo, estas redes artificiales pueden permitir biomarcadores de proteínas para activar las enzimas que escinden profármacos. Alternativamente, estos miméticos de proteína de señalización podrían ser capaces de activar las vías de señalización celular no naturales, dando como resultado efectos terapéuticos. Para demostrar la viabilidad de este enfoque, hemos creado recientemente un &quot;transductor química &#39;sintética 4 que permite el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para activar la escisión de un profármaco anticáncer mediante la activación de la glutatión-s-transferasa (GST), que es no su pareja de unión natural. La estructura de este &quot;transductor&quot; consiste en un anti-PDGF aptámero de ADN que se ha modificado con un inhibidor bivalente para GST. Por lo tanto, este agente sintético pertenece a una familia de moléculas con sitios de unión adiferentes proteínas, 5-7, tales como inductores químicos de dimerización (CID) 8-10 y también para el grupo de proteínas aglutinantes sobre la base de los conjugados de molécula de oligonucleótido sintético. 11-21 Los principios generales que subyacen en el diseño de tales sistemas se describe en este documento y se proporcionan protocolos detallados para sintetizar y probar la función de este &quot;transductor&quot; con ensayos enzimáticos convencionales. Este trabajo tiene por objeto facilitar el desarrollo de transductores &#39;&#39; adicionales de esta clase, que se puede utilizar para mediar en la comunicación proteína-proteína intracelular y, por consiguiente, para inducir la vías de señalización celular artificiales. La Figura 1 describe esquemáticamente los principios de funcionamiento de los transductores &#39;&#39; químicos sintéticos que pueden mediar comunicaciones proteína-proteína no naturales. En esta ilustración, un &quot;transductor química &#39;, que integra aglutinantes sintéticos para proteins I y II (aglutinantes I y II), permite a la proteína II para desencadenar la actividad catalítica de la proteína I, que no es su pareja de unión natural. En la ausencia de la proteína II, el transductor se une al sitio catalítico de la enzima (proteína I) e inhibe su actividad (Figura 1, el estado ii). La unión de la &quot;transductor&quot; a la proteína II, sin embargo, promueve interacciones entre aglutinante I y la superficie de la proteína II (Figura 1, el estado iii), lo que reduce su afinidad hacia la proteína I. Como resultado, la concentración eficaz de la &quot; transductor libre &#39;en la solución se reduce, lo que conduce a la disociación del transductor-proteína complejo I y para la reactivación de la proteína I (Figura 1, el estado iv). Tomados en conjunto, estos pasos destacar tres principios fundamentales que subyacen en el diseño de transductores &#39;&#39; eficientes: (1) un &quot;transductor&quot; debe tener una carpeta específica para cada una de las proteínas diana, (2) la interacción between ligante II y II de la proteína debe ser más fuerte que la interacción entre la proteína ligante I y I, y (3) ligante debo ser capaz de interactuar con la superficie de la proteína II. Este último principio no requiere necesariamente que ligante yo solo tendría una alta afinidad y selectividad para la proteína II. En su lugar, se basa en nuestros estudios recientes que mostraron que traer una molécula sintética en la proximidad de una proteína puede promover interacciones entre esta molécula y la superficie de la proteína. 19,22,23 <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Figura 1:. Operando principios de transductores químicos &#39;&#39; Cuando se añade el &#39;transductor química&#39; a una proteína activa I (estado i), se une a su sitio activo a través de aglutinante que e inhibe su actividad (estado II). En presencia de la proteína II, sin embargo, el no unido &#39;química transducer &#39;interactúa con la proteína II a través de aglutinante II, que promueve las interacciones entre aglutinante I y la superficie de la proteína II. Esta carpeta inducida I-II de la proteína de interacción reduce la concentración efectiva de aglutinante I, que conduce a la disociación de la &#39;transducer&#39;-proteína complejo I y para la proteína I reactivación (estado IV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a>

<table><tbody><tr><td>1-cloro-2,4-dinitrobenceno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetitrilo</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etacrínico</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión-s-transferasa M1-1 Centro de</td><td>Proteómica Estructural de Israel (Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatión reducido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensayo colorimétrico de nitrato/nitrito</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td>de la Fundación W. M. Keck Biotecnología en la Universidad</td><td></td> de Yale <td>pedido personalizado</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Centro de Proteómica Estructural de Israel (Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Columna de desalinización</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Columnas</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td><td>2695 módulo</td><td></td>de separación</tr><tr><td>columna de HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST Columna C18 (2.5 &mu; M, 4,6 mm y veces; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Columna de HPLC</td><td>Columna</td><td>XBridgeTM OST C18 de Waters (2,5&nbsp; &mu; M, 10 mm y veces; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

imitando la función de las proteínas de señalización: hacia artificial de la señal de transducción terapia

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Las vías de transducción de señales, que controlan la respuesta de las células a diversas señales ambientales, están mediadas por la función de proteínas de señalización que interactúan entre sí y se activan entre sí con alta especificidad. Por lo tanto, los agentes sintéticos que imitan la función de estas proteínas podrían usarse para generar pasos de transducción de señales no naturales y, en consecuencia, alterar la función de la célula. Presentamos pautas para el diseño de "transductores químicos" que puedan inducir la comunicación artificial entre proteínas nativas. Además, presentamos protocolos detallados para sintetizar y probar un 'transductor' específico, que puede inducir la comunicación entre dos proteínas no relacionadas: el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la glutatión-S-transferasa (GST). También se presenta la forma en que esta comunicación no natural PDGF-GST podría utilizarse para controlar la escisión de un profármaco anticancerígeno, lo que indica el potencial para el uso de dichos sistemas en la "terapia de transducción de señales artificiales". Este trabajo pretende facilitar el desarrollo de "transductores" adicionales de esta clase, que puedan utilizarse para mediar la comunicación intracelular proteína-proteína y, en consecuencia, para inducir vías de señalización celular artificiales.

El diseño, la síntesis y mecanismo de acción de un &quot;transductor química &#39;que puede inducir la comunicación artificial entre PDGF y GST se presentan en la Figura 2. La estructura del&quot; transductor &quot;integra un aptámero de ADN PDGF y una amida-bis etacrínico (BEA ), que es un conocido inhibidor de GST (figura 2a). 19 Estos aglutinantes permiten la &quot;transductor&quot; para unirse tanto a PDGF y GST con diferentes afinidades, ...

Presentamos directrices para el desarrollo de 'transductores químicos' sintéticos que puedan inducir la comunicación entre proteínas naturalmente no relacionadas. Además, se presentan protocolos detallados para sintetizar y probar un "transductor" específico que permite a un factor de crecimiento activar una enzima desintoxicante y, en consecuencia, regular la escisión de un profármaco anticancerígeno.

Imitando la función de las proteínas de señalización: hacia artificial de la señal de transducción Terapia

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

El objetivo general de este experimento es seguir espectroscópicamente la comunicación no natural entre dos proteínas inducida por un transductor químico sintético. Esto demostrará la posibilidad de desarrollar análogos sintéticos de proteínas señalizadoras que puedan llevar a cabo vías de transducción de señales que no existen en la naturaleza. La capacidad de seguir la comunicación no natural entre proteínas mediante un espectrofotómetro común podría ayudar a desarrollar y mejorar la función de transductores químicos artificiales y acercarnos más a lograr una terapia de transducción de señales artificial.El transductor químico está compuesto por un aptámero de factor de crecimiento derivado de plaquetas, o PDGF, un inhibidor bivalente de GST de etacrínico amida, un fluoróforo y un apagador. La síntesis del transductor químico no será demostrada en este video.Pero se describe en el protocolo del texto. Aquí se ilustran los principios de funcionamiento del transductor químico. El transductor químico inhibe la actividad enzimática de GST cuando los dos grupos EA se unen a los sitios activos de la enzima.La adición de PDGF conduce a la formación del complejo químico transductor de PDGF, lo que interrumpe la interacción entre el transductor y GST, restaurando así la actividad enzimática de GST. La adición posterior de un aptámero de PDGF no modificado libera al transductor químico y permite que vuelva a inhibir la enzima.Antes de comenzar los experimentos para examinar el control de la actividad de GST por PDGF, configure un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética. Cree un nuevo experimento como un protocolo estándar. Seleccione Procedimiento para abrir la ventana de Configuración de Procedimiento.En la lista emergente en la parte superior de la ventana, seleccione el tipo de placa 384 según el fabricante de la placa. Seleccione Leer en el menú izquierdo. Elija Absorbancia como método de detección.Y punto final para el tipo de lectura. En la ventana de longitud de onda, escriba 340 nanómetros. Seleccione placa completa y elija las pocillos que se medirán.Luego, haga clic en Aceptar para cerrar la ventana de lectura. En el menú de la izquierda, elija Iniciar cinética. Establezca el tiempo de ejecución en 10 minutos.Seleccione la opción Intervalos Mínimos. Luego haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Cinética. Arrastre la Línea de Lectura hacia la Medición Cinética.Seleccione el botón Validar, seguido del botón Aceptar. Guarde el experimento. Seleccione el botón Reproducir.Aparecerá un cuadro de diálogo, pero no seleccione el botón Aceptar hasta que esté listo para comenzar la medición cinética. Una vez que el lector de placas haya sido configurado, el siguiente paso es preparar las muestras para medir la actividad de GST en presencia del transductor químico y PDGF. Con el fin de probar cuatro concentraciones de PDGF por triplicado, prepare cuatro muestras donde cada una contenga 3,25 microlitros del transductor químico y 3,25 microlitros de GST M-1.Agregue a cada muestra, respectivamente, cero, 1,2, 2,4 o 4,9 microlitros de PDGF. Luego agregue el volumen apropiado del tampón de ensayo a cada muestra para llevar el volumen total a 130 microlitros. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos.Después de 10 minutos, transfiera 40 microlitros de cada muestra a los pocillos de una placa transparente de 384 pocillos. Transfiera cada una de las cuatro muestras solo a los pocillos impares o pares dentro de la misma fila, para permitir el uso de un multicanilla en la adición del sustrato.A continuación, utilice un multicanal de 12 canales para agregar rápidamente a cada muestra 10 microlitros de cada sustrato previamente preparado en una placa de 96 pocillos. Mezcle rápidamente, pero con suavidad, para evitar la formación de burbujas. Inserte inmediatamente la placa en el lector de placas y comience la medición cinética seleccionando el botón Aceptar en el cuadro de diálogo.Para examinar los ciclos de inhibición de la activación de GST mediados por el transductor químico, prepare cinco muestras, cada una conteniendo 84,5 microlitros de tampón de ensayo, 3,25 microlitros de transductor químico y 3,25 microlitros de GST M1-1. Incube a temperatura ambiente durante tres minutos.Añada 3.65 microlitros de tampón de ensayo a la muestra uno, y 3.65 microlitros de PDGF a las muestras dos, tres, cuatro y cinco. Incube a temperatura ambiente durante tres minutos. Añada 3.12 microlitros de tampón de ensayo a las muestras uno y dos, y 3.12 microlitros de aptámero de PDGF a las muestras tres, cuatro y cinco.Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Añadir 24,4 µL de tampón de ensayo a las muestras uno, dos y tres. Y 24,4 µL de PDGF a las muestras cuatro y cinco.Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Añadir 7,8 microlitros de tampón de ensayo a las muestras uno a cuatro, y 7,8 microlitros de aptámero de PDGF a la muestra cinco. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Transfiera las muestras a una placa de 384 pocillos transparentes. Para realizar el experimento por triplicado, agregue rápidamente el sustrato a las muestras. Inserte la placa en el lector e inicie la medición cinética.Para comenzar este ensayo, configure un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética según se describe en el texto del protocolo. Prepare dos muestras en dos pocillos de una placa transparente de 384 pocillos. Para cada pocillo, mezcle un microlitro de GST M1-1 y un microlitro del transductor químico en 38 microlitros de tampón de ensayo.Deje un pocillo vacío entre los dos pocillos. Utilizando un multicanal de 12 canales, agregue rápidamente 10 microlitros de sustrato a cada pocillo. Y mezcle suavemente y con rapidez para evitar burbujas.Introduzca inmediatamente la placa en el lector y comience la medición cinética. Cuando el lector de placas se abra después de 3,5 minutos, agregue rápidamente 1,125 microlitros de PDGF a uno de los pocillos, mezcle suavemente y permita que la placa vuelva al lector para las mediciones cinéticas restantes. Antes de preparar las muestras para este experimento, configure un procedimiento experimental en el lector de placas para la medición cinética según se describe en el texto del protocolo.Se utilizará un kit colorimétrico de nitrito/nitrato para medir la producción de óxido nítrico. En una placa de 96 pocillos, agregue 50 microlitros de tampón de ensayo por pocillo en la primera fila. Agregue 70 microlitros de Reactivo Griess Uno por pocillo en la segunda fila.Y 70 microlitros del reactivo dos de Griess por pocillo en la tercera fila. Prepare cuatro muestras, cada una conteniendo 4,8 microlitros del transductor químico. A la muestra uno, añádale 155,2 microlitros de tampón de ensayo.Para la muestra dos, añada 3.2 microlitros de GST M1-1 y 152 microlitros de tampón de ensayo. Para la muestra tres, añada 9.6 microlitros de PDGF y 145.6 microlitros de tampón de ensayo. Y para la muestra cuatro, añada 3.2 microlitros de GST M1-1, 9.6 microlitros de PDGF y 142.4 microlitros de tampón de ensayo.Incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Dispense 50 microlitros de muestra por pocillo en una placa de 384 pocillos transparentes para realizar el experimento por triplicado. Dispense las muestras solo en los pocillos impares o pares de la misma fila para permitir el uso de un multicanilla en la adición del sustrato.Añada 0.54 microlitros de profármaco JS-K a cada muestra. Añada rápidamente a cada muestra 10 microlitros de solución de glutatión y mezcle suavemente y con rapidez para evitar burbujas. Inserte la placa en el lector y comience la medición cinética.Inmediatamente después de la medición cinética, transfiera 50 microlitros de cada muestra a cada pocillo de la primera fila de la placa de 96 pocillos con tampón de ensayo. Luego transfiera 50 microlitros de cada pocillo de la segunda fila de la placa a los pocillos de la primera fila de la placa. Y 50 microlitros por pocillo de la tercera fila de la placa a los pocillos de la primera fila de la placa.Incubar protegiendo de la luz durante 10 minutos a temperatura ambiente. Antes de medir la absorbancia a 550 nanómetros. La medición de la actividad de GST sin el transductor químico y con el transductor químico mostró que el transductor químico inhibe la actividad de GST.La GST se reactiva mediante la adición de concentraciones crecientes de PDGF al complejo de transductor químico de GST. Adiciones sucesivas de PDGF y de un aptamero de PDGF no modificado al complejo de transductor químico de GST revelaron que la comunicación entre PDGF y GST era reversible. La adición de PDGF al complejo de transductor de GST provocó un aumento rápido de la actividad de GST, 3,5 minutos después de añadir los sustratos.Aunque la adición de un aptámero de PDGF a una mezcla de GST, PDGF y el transductor químico provocó una disminución en la actividad de GST. Estos resultados indican que el sistema responde en tiempo real a los cambios en su entorno. Posteriormente, se investigó la capacidad de este sistema para controlar la activación de profármacos utilizando JS-K, un profármaco anticancerígeno que es activado por GST para liberar óxido nítrico tóxico.Las mediciones de las cantidades de óxido nítrico liberadas tras la adición de JS-K al transductor químico y a diferentes combinaciones de GST y PDGF confirmaron que solo la presencia simultánea de GST y PDGF activa a JS-K. Todo esto muestra cómo un agente sintético puede permitir que un factor de crecimiento desencadene la actividad catalítica de la Glutation S-Transferasa, que no es su enzima asociada natural. Por lo tanto, futuros biomiméticos de esta clase podrían utilizarse para modificar la respuesta de las células a señales ambientales o dotarlas de nuevas propiedades.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Aquí, presentamos un protocolo para matrices de anticuerpo para identificar alteraciones en las vías de señalización en distintos modelos celulares. Estos cambios, causados por drogas/hipoxia/ultra-violet luz radiación, o sobreexpresión/downregulation/nocauts, son importantes para varios modelos de la enfermedad y pueden indicar si una terapia eficaz o puede identificar mecanismos de drogas resistencia.

Evaluación de la resistencia a inhibidores de la cinasa de tirosina por un interrogatorio de vías de transducción de señal por Arrays de anticuerpos

Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.

Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Aprende a desarrollar transductores químicos sintéticos que facilitan la comunicación entre proteínas no relacionadas mediante espectrofotometría. Este método avanza la terapia de transducción de señales artificial.

Imitando la función de las proteínas de señalización: hacia artificial de la señal de transducción Terapia

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