Name: Trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende el trasplante en la almohadilla del ovario de ratón para estudiar epitelios normales y transformados del tracto reproductivo femenino. Este método permite investigar diferenciación, regeneración y potencial neoplásico celular.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Andrew K. Godwin, Universidad de Kansas Medical Center, para proporcionar a las células humanas HIO118. Estos estudios fueron apoyados por las subvenciones del Programa de Células Madre de Nueva York (NYSTEM; T028095) y los Institutos Nacionales de / Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (P50HD076210) para AFN Salud, y por las subvenciones de NYSTEM (C028125, C024174 y T028095), Institutos nacionales de / Instituto de Salud Nacional del cáncer (CA182413) y el Fondo de Investigación del cáncer de Ovario (327516) para AYN.

Todo el trabajo en vivo descrito es aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Universidad de Cornell. 1. Preparación de muestras para ensayos de ovario almohadilla de grasa <ol><li> Aislamiento y cultivo de células primarias de trompas Epitelio (TE) <ol><li> La eutanasia a los donantes de 6 a 8 semanas de edad virgen proteína verde fluorescente mejorada-β-actina (EFGP) o ratones β-actina-Discosoma proteína roja fluorescente (DsRed) por CO 2 administración seguido por dislocación cervical. Verificar la eutanasia con éxito por una pizca dedo del pie. </li><li> Coloque un ratón individual en una cortina absorbente, lado ventral hacia arriba, y luego limpie el abdomen con un 70% de etanol. Abra la piel haciendo una incisión lateral a la línea media del cuerpo y con la punta de los dedos tiran de la piel por encima y por debajo de la incisión hacia la cabeza y la cola del ratón. </li><li> Mantenga el peritoneo con unas pinzas romas y hacer un corte con tijeras finas para abrir la cavidad del cuerpo. Empuje suavemente la bobina del intestine un lado y localizar los órganos reproductores. </li><li> Con unas pinzas finas recoger un cuerno uterino y debe cortar 0,5 cm por encima del punto en el que se separan los cuernos uterinos. Mientras sostiene el cuerno uterino, diseccionar el tejido conectivo unido a la trompa uterina, trompa uterina, almohadilla de grasa de ovario y cáncer de ovario. Coloque tracto reproductivo diseccionado en un plato con 6 ml estéril salina tamponada con fosfato (PBS). Proceder con el segundo aparato reproductor. </li><li> Se pasa la placa a una cabina de bioseguridad y lavar los tejidos 3 veces en 6 ml de PBS estéril. Continuar el trabajo bajo un microscopio de disección situado en la cabina de bioseguridad. Coge el cuerno uterino con unas pinzas finas y desconecte el cuerno uterino de la trompa uterina mediante el corte en la unión útero-tubárica. Cortar la bolsa ovárica que rodea el ovario mediante el uso de una aguja de 25 G. Nota: Después de la bolsa ovárica se ha eliminado, la disección es completa y la trompa uterina individuo permanece en la solución de PBS. </li><li> Transferir una cabeza del ctrompa uterina e en una caída de 50 l de PBS a una placa de 3,5 cm y tiene pelos en trozos de 0,1 mm utilizando agujas de calibre 28. Traslado a 200 l de tampón de digestión 1 (Modificado (DMEM) F12 de Eagle de Dulbecco () medio de Ham suplementado con 300 unidades ml-1 de colagenasa y 100 unidades de ml -1 hialuronidasa) e incubar durante 1 hora a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Después de la incubación, añadir ácido etilendiaminotetraacético Tripsina-1 ml 0,25% (EDTA) y la suspensión de la solución con la ayuda de una punta de pipeta 1 ml (también conocido como punta azul) 20 veces durante 3 minutos. Añadir 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal al 2%. </li><li> Recoger los tejidos por centrifugación (600 RCF, 5 min, temperatura ambiente (RT)), y añadir tampón de digestión 1 ml 2 (DMEM F12 () medio de Ham suplementado con 7 mg ml -1 dispasa II y 10 mg ml -1 desoxirribonucleasa I ( DNasa I)). Suspender sedimento de tejido 20 veces con la ayuda de una pipeta de 1 ml tipag. </li><li> Añadir medio completo libre de suero de 5 ml del crecimiento del ratón epitelio tubárico (M-TE-GM, Tabla 1). </li><li> Recoger las células por centrifugación (600 rcf, 5 min, RT). Añadir 1 ml de M-TE-GM, suspender y contar las células mediante un hemocitómetro. Semillas 1 x 10 5 células en 1 ml por pocillo en una placa de 24 pocillos de baja unión y se incuban en M-TE-GM a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 4 días. </li><li> Cambiar el medio cada día. </li><li> Preparar suspensiones de células individuales de células TE suspensión primaria cultivadas a partir de ratones ß-actina-EGFP o β-actina-DsRed. <ol><li> Recoger los cultivos en suspensión TE de 24 pocillos placas de fijación bajas. Centrifugar (600 RCF, 5 min, RT), y suspender los sedimentos celulares con 1 ml 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Deja de actividad de la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal 5%. Recoger los sedimentos celulares por centrifugación (600 RCF, 5 min, RT). </li></ol></li><li> sedimentos de células de lavado dos veces con 4 ml de PBS frío (4 ° C), se añade 1 ml de PBS por sedimento celular, y suspender. Recuento de células mediante un hemocitómetro y la transferencia a 1,7 ml tubos de centrifugación. Trabajando en hielo, añadir 1 x 10 5 células a 10 l de PBS, a continuación, añadir la matriz de la membrana basal 10 l. Suspender y transportar en hielo a la sala de los animales. Nota: Realizar todos los trabajos de disección y el tejido de cultivo en una cabina de bioseguridad en condiciones estériles. </li></ol></li><li> Preparación de la línea celular inmortalizada humana <ol><li> Por separado crecer lentivirus-EGFP y -mCherry marcado inmortalizada humana superficial del ovario lineHIO118 célula epitelial hasta el 80 - 90% de confluencia en placas de 10 cm a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Lavar los platos dos veces con 10 ml de PBS, se añade 1 ml de 0,25% tripsina-EDTA por placa y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Detener la reacción mediante la adición de 10 ml de DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal 5%. Recogersedimentos celulares por centrifugación (600 rcf, 5 min, RT). </li><li> sedimentos de células de lavado dos veces con 10 ml de PBS frío (4 ° C), se añade 1 ml de PBS por sedimento celular, y suspender. Recuento de células mediante un hemocitómetro y la transferencia a 1,7 ml tubos de centrifugación. </li><li> Trabajando en hielo, añadir 1,0 x 10 6 células Lenti-mCherry etiquetados + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP células marcadas con 10 l de PBS. Añadir matriz de membrana basal 10 l. Suspender y transportar en hielo a la sala de los animales. </li></ol></li><li> Preparación de la trompa uterina <ol><li> Diseccionar trompas uterinas individuales de 6 a 8 semanas de edad ratones vírgenes β-actina-DsRed en PBS como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.5. Transferencia trompas uterinas individuales en una gota 200 l de PBS con un microscopio de disección. desenrolle suavemente trompas uterinas con la ayuda de pinzas y agujas de calibre 28 mediante la eliminación de la mesosalpinx, una parte del ligamento ancho que soporta los segmentos de la trompa uterina. Coloque trompas uterinas desenrollados individuales en una gota de 200 l de PBS frío hielo hasta que la almohadilla de grasa de ovario del destinatario se expone y se preparó para recibir el trasplante. </li></ol></li></ol> 2. Trasplante de ovario almohadilla de grasa Nota: Desinfectar instrumentos entre cada cirugía animal. Preparar y organizar todos los equipos con antelación. trasplantes dorsal a la almohadilla de grasa ovárica derecha son preferenciales ya que esto evita el bazo. Sin embargo, los receptores de trasplantes pueden tener tanto en las almohadillas de grasa de ovario. <ol><li> Utilizar ratones singénicos o ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID / NCR) como receptores de células primarias. Para las células humanas, tales como células, HIO118 / ratones SCID uso Nod / gamma (GSN) o ratones SCID. </li><li> Anestesie ratón receptor con una sola inyección intra-peritoneal de 2,2,2-tribromoetanol a una dosis de 0,15 ml / 10 g de peso corporal. Colocar el animal sobre una almohadilla térmica, en la campana animal y confirmar la anestesia adecuada por la pérdida del reflejo de pedal (pizca dedo del pie). Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que elanimal es bajo anestesia. Se inyecta por vía subcutánea el animal con el analgésico ketoprofeno en dosis de 4 mg / g de peso corporal para el tratamiento para el dolor post-quirúrgico. Nota: Como alternativa, el uso de anestesia con isoflurano. Colocar el animal en la cámara de inducción y ajustar el medidor de flujo de oxígeno al 0,8 a 1,5 L / min y el vaporizador de isoflurano al 2-3%. Retire el animal anestesiado de la cámara, que lo respira isoflurano de una máscara y ajustar el medidor de flujo de oxígeno a 0,4-0,8 l / min y el vaporizador de isoflurano al 1,5%, a continuación, iniciar la cirugía. </li><li> Afeitar el área quirúrgica con máquinas de cortar # 40; eliminar el vello de un área de 2 veces el área quirúrgica, preparar la piel afeitada con tres friega antisépticas de povidona yodada, seguido de etanol al 70%, y cubrir con un paño estéril. </li><li> Mover el animal bajo un microscopio de disección situado en una cabina de bioseguridad. Exponer el aparato reproductor mediante una incisión en la posición dorsomedial directamente encima de la almohadilla de grasa de ovario. Nota: Critpaso ical: incisión de la piel Precise facilita la cicatrización de heridas, el uso de un bisturí se recomienda en el paso 2.4. </li><li> Utilizando unas pinzas finas romos tire de la almohadilla de grasa de ovario cuidadosamente a través de la incisión hacia la línea media, se minimiza el daño a los nervios y los vasos sanguíneos principales. Paso Crítico: Si se produce una hemorragia, detener la cirugía y considerar el trasplante a un animal huésped diferente. </li><li> Bajo el control del microscopio de disección con la ayuda de una aguja de calibre 28 biselado hacer una incisión profunda de 2-4 mm en la almohadilla de grasa de ovario, 3-4 mm por encima del ovario. paso crítico: Asegúrese de que la incisión única pasa por la mitad de la almohadilla de grasa; punción de todo el camino a través de la parte inferior provoca fugas. Ser rápida y proceder sin demora después de este paso. </li><li> Para los trasplantes de células, llenar una jeringa (aguja de calibre 30) con 10-20 l de la membrana de la matriz-mezcla de células-sótano y se inyecta en la incisión almohadilla de grasa. Para el trasplante de trompa uterina, recoger el ingenio trompa uterinah pinzas finas y colocarlas en 10 - matriz de la membrana basal 20 l mantuvieron en hielo. El uso de un 0,1-10 l / 20 XL graduó punta del filtro (se ha reducido en un 3 mm) recoger el tejido y la suspensión de la membrana basal de la matriz y la liberación en la incisión almohadilla de grasa. </li><li> Espere 5 minutos para que la matriz de la membrana basal para solidificar y colocar el tracto reproductivo de nuevo en el peritoneo. Cierre los músculos con 2 puntos de sutura de sutura quirúrgica y la piel con dos clips pequeña herida o sutura quirúrgica. </li><li> Repita los pasos 2.4-2.8 para trasplantar una matriz de mezcla de membrana PBS-sótano en la almohadilla de grasa contra-lateral del animal que servirá como control. paso crítico: Después de la cirugía de colocar al animal en una almohadilla eléctrica, debido a la pérdida de calor es rápida en ratones anestesiados. </li><li> Deje que los animales se recuperan en una almohadilla térmica en la jaula nativa y observar el animal hasta que esté completamente despierto de la anestesia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para mantener los esternonesl decúbito. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. </li><li> Coloque un puñado de bolitas de comida pre-húmedas dentro de la jaula, además de secar el alimento en la jaula después de la cirugía. Aplicar analgésicos post-quirúrgicos si es necesario para los próximos días y examinar la herida diariamente. Aplicar los antibióticos de acuerdo con el protocolo aprobado de animales si se produce la infección de la herida. Retirar grapas para heridas 10 días después de la cirugía cuando la herida se ha cerrado completamente. </li></ol> 3. Histología y Adquisición de imágenes <ol><li> Injerto de recolección y preservación <ol><li> Preparar la solución de paraformaldehído al 4% mezclando 26 ml ddH2O con 4 ml 10x PBS y solución de paraformaldehído 10 ml de 16%. </li><li> Diseccionar en un bloque, la almohadilla de grasa ingerida en los ovarios, ovario, trompa de Falopio, el útero de 0,5 cm como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.4. colocar inmediatamente en 2 ml de paraformaldehído al 4% y fijar durante 2 horas, a temperatura ambiente. Desde el mismo animal, diseccionar la no injertadosistema de almohadilla de grasa de ovario contralateral trasplantados con PBS-sótano mezcla matriz de la membrana como un control (véase el paso 2.9). Fijar y el proceso de la misma manera. </li><li> Después del lavado de fijación tejidos tres veces con PBS durante 5 min y se incuba durante la noche en PBS a 4 ° C. </li><li> Para todo el montaje en la obtención de imágenes de la almohadilla de grasa de ovario continúe en el paso 3.2.1. Nota: Después de que los tejidos de adquisición de imágenes se pueden congelar (3.3.1) o tratados para la inclusión en parafina (3.3.2). incubación durante la noche en 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C mejora la calidad de los tejidos congelados. </li></ol></li><li> Adquisición de imágen <ol><li> Coloque todo el montaje en sistemas de la capa de grasa de ovario en los platos de PBS llenas y la imagen usando un microscopio invertido equipado con el accesorio de epi-fluorescencia y cámara a color de alta definición, con 4, 10 veces más objetivos, y un estereomicroscopio equipado con un accesorio de fluorescencia, cámara a color y el Plan Apo 1xWD70, objetivos ED plan de 1.5xWD45. </li></ol></li><li> Histología <ol><li> Siguiendotodo el montaje de adquisición de imágenes (3.2.1) se coloca una gota de 200-500 l de medio de inclusión para las muestras de tejido congelado en una pieza de 2 x 1 cm de la película de laboratorio y el uso de fórceps, transferir el tejido de la caída. Recoge la película en un borde y transferir la caída del tejido de mediano a un vial criogénico ml 1.8. Cerrar el vial y sumergirse en nitrógeno líquido. Almacenar tejidos congelados a -80 ° C. </li><li> Como alternativa, proceder a la inclusión en parafina estándar. Utilice 20-40 volúmenes de volumen de tejido para cada paso. <ol><li> Sumergir los tejidos una vez en 65% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. </li><li> Sumergir los tejidos una vez en 70% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. En esta etapa las muestras se pueden almacenar durante meses a temperatura ambiente. </li><li> Sumergir los tejidos una vez en 90% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. </li><li> Sumergir los tejidos una vez en 95% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. </li><li> Sumergir los tejidos dos veces en etanol absoluto (200 prueba) durante 30 min, agitando suavemente a TA. </li> &lt;li&gt; Sumergir los tejidos dos veces en cloroformo durante 30 minutos, agitando suavemente a TA. </li><li> Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 30 minutos, agitando suavemente a 58 ° C. </li><li> Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 12 horas, agitando suavemente a 58 ° C. </li><li> Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 3 horas, a 58 ° C. </li><li> Colocar en moldes de tejidos histológicos de metal y llenar los moldes con 58 ° C de parafina. Añadir un casete histología de plástico en la parte superior de la parafina y parafina se enfríe a 4 ° C. Extraer bloques de parafina de los tejidos y se almacena a temperatura ambiente. Nota: temperatura de parafina no debe exceder de 58 ° C para la conservación óptima de tejido adecuada para tinción inmunohistoquímica. </li></ol></li><li> Alternativamente, Prepárese para la inclusión en parafina con Espécimen de procesamiento del gel. <ol><li> Aspirar el PBS y transferir los tejidos de todo el montaje y el 70% de etanol. Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr. En un baño de agua, la muestra de procesamiento de precalentamiento de gel a 60 ° C. </li><li> pipeteee 200 l de gel de procesamiento de muestras en una placa de Petri forrada con película de laboratorio. Utilizando unas pinzas de disección finas transferir todo el montaje del sistema de tejidos a la caída de gel de procesamiento de las muestras. </li><li> Deje que el tapón de gel de procesamiento de las muestras se solidifique a temperatura ambiente, o se solidifique el tapón durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Coloque el tejido embebido gel procesamiento de muestras en cassettes de tejido histología intercaladas entre almohadillas de espuma biopsia. Incrustar en parafina como en los pasos 3.3.2-3.3.2.10. Nota: Espécimen de procesamiento incrustación de gel evita la pérdida y permite la conservación de las pequeñas muestras de tejidos frágiles. Nota: Los tejidos conservados por congelación o la inclusión en parafina son adecuados para la tinción inmunohistoquímica 14,15. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos establecido un ensayo de trasplante de almohadilla de grasa de ovario que permite la entrega precisa y la detección de las células y los tejidos epiteliales. La almohadilla de grasa procedimiento de trasplante de ovario ensayo es técnicamente menos exigente que la inyección de la bursa 10-12 y permite más uniforme y ubicación precisa de las células trasplantadas en comparación con la inyección intraperitoneal 9. También es muy adecuado para el trasplante a largo plazo de todo un órgano, tal como el tubo uterino. Es importante destacar que la almohadilla de grasa de ovario proporciona un microambiente familiar para los epitelios del sistema reproductor femenino. Debe ser particularmente adecuada para los estudios de las propiedades moleculares y celulares de ovario humano y de ratón y células del epitelio de las trompas durante la regeneración y transformación maligna. A diferencia de otros órganos, pocos estudios se han centrado en la identificación y caracterización de células madre en el epitelio de la r hembratracto EPRODUCTIVA 18,19. Este tipo de estudios son de particular importancia debido a que muchos cánceres se cree que se originan a partir de células madre adultas 20. Aún orígenes celulares de cáncer epitelial de ovario siguen siendo muy discutible 18. Cánceres ováricos epiteliales representan la mayoría de los cánceres de ovario y está en quinto lugar entre todas las muertes relacionadas con el cáncer de las mujeres en los EE.UU. 21. Por lo tanto el desarrollo de un ensayo ortotópico con varias ventajas sobre las técnicas de trasplante existentes 9-12 debería facilitar en gran medida los estudios en esta área. Dada la localización superficial de la almohadilla grasa de ovario, sistemas de imágenes de animales pequeños se pueden utilizar para el seguimiento de engraftments marcado con fuerte fluorescente o reporteros bioluminiscentes. También debe ser posible establecer ensayos de invasión mínima de formación de imágenes de alta resolución en vivo, como la microscopía no lineal 22. La almohadilla de grasa de ovario también se puede mantener en cultivos de órganos, permite de ese modoing cultivo tridimensional de epitelio normal y neoplásica en condiciones recapitulan de cerca la organización de las células y la matriz extracelular. Los estudios futuros deben abordar estas posibilidades prometedoras. Varios pasos críticos tienen que ser considerados. Proporcionar una resistencia de calentamiento y mantener caliente roedores durante la cirugía mejora en gran medida la tasa de supervivencia. La esterilidad de los instrumentos de manejo de la almohadilla de grasa se asegura de que los sistemas injertadas se mantienen estériles. En nuestra experiencia, los resultados de un sangrado significativo en el retraso del crecimiento de los trasplantes. Es importante destacar que la almohadilla de grasa de la incisión debe hacerse precisamente por desgarro de la almohadilla de grasa o perforar a través de las causas de sangrado. Coagulantes deben utilizarse para detener el sangrado, según sea necesario. Si engraftments no se desarrollan, una mayor concentración de células inyectadas debe ser considerado. Las primeras excrecencias exitosos pueden observarse tan pronto como una semana después del trasplante y más engraftments debe ser uno visiblemeses después del procedimiento. Para el transplante, agujas con diámetro más grande (23 a 25 G) se pueden utilizar para evitar cortes de las células grandes (más de 10 m de diámetro). Sin embargo, dichas agujas pueden ser más traumática de la almohadilla de grasa y su uso debe ser probado con antelación. Para nuestros experimentos hemos utilizado ratones de donantes y receptores 6-8 semana. Para ambos propósitos ratones jóvenes o mayores pueden ser utilizados. Sin embargo, puede ser necesario ajustar el número de células inyectadas. También será necesario tener en cuenta el menor tamaño de las almohadillas de grasa de ovario en los donantes jóvenes. Al igual que con cualquier método, hay algunas limitaciones del ensayo de trasplante de almohadilla de grasa de ovario de ratón. Aunque los ratones inmunocompetentes singénicos se pueden utilizar para células / tejidos primarios murinos, nuestra técnica requiere NSG o ratones SCID para el trasplante de material humano. Es probable posible humanizar la almohadilla de grasa para apoyar el crecimiento de células epiteliales humanas. Sin embargo, no hemos probado este enfoque todavía. El uso de más joven Felos machos pueden dar lugar a menores costes de cría; Sin embargo, los ratones hembras vírgenes maduros (edad 8 a 10 semanas) tienen una almohadilla de grasa más grande, permitiendo de este modo el trasplante de las muestras más grandes. Por último, el personal de laboratorio deben ser entrenados en la cirugía de los animales para asegurar la ejecución oportuna y con éxito del procedimiento.

ensayos de trasplante, que implican la introducción de células y tejidos en sitios específicos del cuerpo en ratones, representan un enfoque esencial para los estudios de regeneración de tejidos y la carcinogénesis. trasplantes ortotópicos de células, es decir, su colocación en un medio nativo, son particularmente importantes para la caracterización de células madre adultas. La existencia de células madre mamarias fue sugerido por primera vez por el trasplante de fragmentos de las glándulas mamarias epiteliales en las almohadillas de grasa de la glándula mamaria de ratones libres 1. Ensayos de injerto a la almohadilla de grasa de ratón humanizado 2 se utilizaron para recapitular el desarrollo potencial regenerativo y normal de las células epiteliales de mama primarios humanos. Por otra parte, los trasplantes de dilución en serie y limitantes de tipos de células fenotípicamente distintas en la almohadilla de grasa mamaria despejado fueron cruciales para poner a prueba la capacidad de auto-renovación y diferenciación multilinaje de células madre mamarias 3-5. Los ensayos de trasplante en combinatiónico con rastreadora de linaje genético proporcionado evidencia de la célula de origen en la carcinogénesis mamaria 5. Trasplantes de riñón de la cápsula se utilizan comúnmente para ensayar las propiedades de las células madre de la próstata putativo 6. El trasplante ortotópico de ratón normal y neoplásico y organoides pancreáticos humanos reveló genes y las vías alteradas en la progresión del cáncer 7. La importancia del medio ambiente nativo también ha sido apoyado por la demostración de diversa regeneración después engraftments de las glándulas sudoríparas en diferentes lugares, tales como almohadillas de grasa mamaria, almohadillas de grasa y la piel de los hombros, la espalda 8. La cavidad peritoneal y la bolsa ovárica se utilizan normalmente como lugares para el trasplante ortotópico de las células epiteliales del tracto reproductor femenino 9-12. Ambos métodos tienen una serie de limitaciones. La inyección intraperitoneal de las células conduce a sus implantaciones en diferentes áreas de la cavidad peritoneal, con lo que comcomplicando la vigilancia del crecimiento celular. Además, las variaciones en el microentorno, tales como la extensión de la vascularización, inervación y la representación de las células inmunes, pueden ser muy importantes en diferentes zonas de la cavidad peritoneal. La bolsa ovárica tiene un volumen muy limitado, lo que permite la inyección de no más de 10 l de líquido. Esto limita significativamente la cantidad de células que se puede administrar. Además, las inyecciones en la bolsa ovárica puede ser bastante difícil técnicamente y el procedimiento requiere una cantidad significativa de tiempo. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos aprovechado las propiedades de la capa de grasa de ovario. La almohadilla de grasa de ovario de ratón tiene un tamaño grande, está al lado del ovario y la trompa uterina, y es fácilmente accesible por medio de cirugía. Se ha informado de que el trofoblasto equina puede ser trasplantado en la almohadilla de grasa de ovario de ratón 13. Sin embargo no se describieron los detalles de este método. Asimismo, no se informó de si esta meDTO se puede aplicar a las células y tejidos adultos. A continuación, describimos un enfoque fiable para el trasplante de células de ratón y humanos del tracto reproductivo femenino y demostramos que este método es también aplicable a los trasplantes de órganos a largo plazo.

<table><tbody><tr><td>Aguja de calibre 25</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 28 (jeringa hipodérmica con aguja adjunta)</td><td>Kendall</td><td>30339</td><td>Número de pieza: 8881500014</td></tr><tr><td>factor de crecimiento básico de fibroblastos-2 Matriz</td> de membrana basal <td>Sigma-Aldrich</td><td>F9786</td><td></td></tr><tr><td>(Geltrex)</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actina-DsRatones rojos</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>6051</td><td>B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td></tr><tr><td>&beta;-actina-EGFP</td><td>ratones The Jackson Laboratory</td><td>3291</td><td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>albúmina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>VWR</td><td>EM-CX1058-1</td><td></td></tr><tr>Célula madre de<td>colagenasa/hialuronidasa</td><td> Technologies</td><td>7912</td><td></td></tr><tr><td>viales criogénicos</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>dispasa II</td><td>Worthington</td><td>NPRO2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 (HAM's)</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (Desoxirribonucleasa I)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>medio de inclusión para muestras de tejido congelado (O. C. T.)</td><td>Sakura Finetek&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>factor de crecimiento epidérmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>etanol 200 prueba</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td>para preparar 70%&nbsp;</td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>punta de filtro 0.1-10/20 y micro; l XL&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>FOXJ1 anticuerpo</td><td>eBioscience</td><td>E10109-1632</td><td>utilizado a concentración 1:1.000 (sin desenmascaramiento)</td></tr><tr><td>hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofeno</td><td>Zoetis</td><td>4396H</td><td></td></tr><tr><td>película de laboratorio (Parafilm M)</td><td>American National Can</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>insulina-transferina-selenito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I884</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano, 250 ml</td><td>Santa Cruz Animal Health</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>placa de fijación baja 24 pocillos</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>moldes de histología metálica</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>62527-22</td><td></td></tr><tr><td>microscopio, microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>, estéreo</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nod/SCID/gamma (NSG)</td><td>ratones The Jackson Laboratory</td><td>05557</td><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ</td></tr><tr><td>solución de paraformaldehído al 16% Electrónica</td><td>Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>parafina (Paraplast, X-TRA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>23-021-401</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo PAX8</td><td>Proteintech</td><td>10336-1-AP</td><td>utilizado a concentración 1:1.000 (sin desenmascaramiento)</td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>penicilina estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr> ratones con <tr><td>inmunodeficiencia combinada severa (SCID/NCr), antecedentes de BALB/C)</td><td>Programa de Producción Animal NCI-Frederick</td><td>01S11</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>gel de procesamiento de muestras (HISTOGEL)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 25%</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr></tbody></table>

trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Los ensayos de trasplante ortotópico en ratones son invaluables para los estudios de regeneración celular y transformación neoplásica. Los abordajes comunes para el trasplante ortotópico de la superficie ovárica y los epitelios tubáricos incluyen la administración intraperitoneal e intrabursal de células. Las limitaciones respectivas de estos métodos incluyen una ubicación mal definida de las células inyectadas y un volumen de espacio limitado. Además, son poco adecuados para la preservación estructural a largo plazo de los órganos trasplantados. Para abordar estos desafíos, hemos desarrollado un enfoque alternativo, que se basa en la introducción de células y fragmentos de tejido en la almohadilla de grasa del ratón. La almohadilla de grasa ovárica de ratón se encuentra en las inmediaciones del ovario y la trompa uterina (también conocida como oviducto, trompa de Falopio) y proporciona un microambiente familiar para las células y los tejidos de estos órganos. En nuestro enfoque, las células de ratón y humanas marcadas con fluorescencia, y los fragmentos de la trompa uterina se injertan mediante cirugía de incisión dorsal mínimamente traumática. Las células trasplantadas y sus excrecencias se localizan fácilmente en la almohadilla de grasa ovárica durante más de 40 días. El trasplante a largo plazo de toda la trompa uterina permite la correcta conservación de todos los componentes principales del tejido y no produce efectos secundarios adversos, como fibrosis e inflamación. Nuestro enfoque debería ser aplicable de manera única para responder a preguntas biológicas importantes como la diferenciación, el potencial regenerativo y neoplásico de poblaciones celulares específicas. Además, debe ser adecuado para estudios de factores microambientales en el desarrollo normal y el cáncer.

Células y tejidos experimentales pueden ser trasplantados con precisión en la almohadilla de grasa de ovario bajo un microscopio de disección (Figura 1). Los ejemplos incluyen las células del epitelio de las trompas de ratón primarios derivados de ratones de forma ubicua que expresan EGFP (Figura 2A) o DsRed (Figura 2B) y células inmortalizadas humanos superficie del ovario epitelio HIO118 16,17 células marcadas con mCherry y EGFP lentivirus (Figura 2C - F). El enfoque es aplicable para el trasplante a largo plazo de órganos, como la trompa uterina de ratón (Figura 3) también. De acuerdo con la tinción inmunohistoquímica, tanto ciliadas (Foxj1 positiva 14) y células secretoras (Pax8 positiva 15) se conservan en el epitelio de las trompas de tejidos trasplantados (Figura 3D y E). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1:. Ovárico almohadilla de grasa Trasplante (A) área expuesta del trasplante (flecha). (B) Se realiza una incisión por un 28 G aguja (flecha). (C) UT / matriz de la membrana basal mezcla de injerto por punta de la pipeta (flecha). (D) UT injertadas (flecha, rojo brillante, UT de los ratones-DsRed β-actina). FP, almohadilla de grasa; Ov, ovario; UT, trompa uterina. Barra de escala = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> Figura 2: Detección de Trasplantados. Alfombrilla de células primarias de epitelio y Tubal humanas inmortalizadas ovárico células del epitelio de superficie (A, B) de salida<html> crecimientos de ratón primaria células del epitelio de las trompas (flechas) de ratones β-actina-EGFP (A, verde) y la beta-actina-DsRed (B, rojo) 8 días después del trasplante en un ratón singénico. (C, D) Engraftments de células mixtas HIO118 (flechas) etiquetados, ya sea con Lenti-EGFP (verde) o Lenti-mCherry (rojo) 10 días después del trasplante en ratones GSN. (D) Área ampliada a partir de (C, flecha). (E, F) del injerto desarrolló 43 días después del trasplante de las mismas células que en C, D para ratón SCID (flechas). AD, M, fluorescencia; E, de campo claro, FP, almohadilla de grasa; Ov, ovario; UT, trompa uterina. (A, B, DF) Barra de escala = 500 micras; (C) Barra de escala = 1,600 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> ad / 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Caracterización de Trasplantes uterino tubo. (A) trompa uterina completa (flecha) de la β-actina-DsRed ratón 6 días después del trasplante en la almohadilla de grasa de ovario (flecha, de color rojo brillante). (B) sección congelada fluorescente de la almohadilla de grasa con el trasplante se muestra en (A). Rojo, DsRed; Azul, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) contratinción nuclear. (C) de la prótesis tubular uterino (flecha) 40 días después del trasplante en GSN ratón receptor (flecha). una sección de parafina. Nota correcta conservación de todos los componentes del tubo uterino principales, y la falta de la fibrosis y la inflamación trasplante asociada. Hematoxilina y eosina. (D, E) La detección de marcadores de epitelio de las trompas-paired box gen 8 (PAX8) y caja forkhead J1 (Foxj1; de color marrón nuclear, puntas de flecha) en las células del injerto (flechas) que se muestran en ( <strong&gt; C). sistema de inmunoperoxidasa. Contratinción con verde de metilo. FP, almohadilla de grasa; Ov, ovario; UT, trompa uterina. (A) Barra de escala = 1,000 m; (B) Barra de escala = 200 micras; (CE) Barra de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> 1x DMEM F12 medio (Ham) </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> pruvate de sodio </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Factor de crecimiento epidérmico </td><td> 10 ng ml-1 </td></tr><tr><td> Básica factor-2 de crecimiento de fibroblastos </td><td> 10 ng ml-1 </td></tr><tr><td> hidrocortisona </td><td> 500 ng ml-1 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> 5 mg ml -1 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 5 mg ml -1 </td></tr><tr><td> selenita de sodio </td><td> 5 ng ml-1 </td></tr><tr><td> albúmina bovina </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> 100 unidades ml -1 / 100 mg ml -1 </td></tr><tr><td> Medio Eagle (MEM) aminoácidos no esenciales mínimos esenciales </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Beta-mercaptoetanol </td><td> 10 -4 M </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Tubal ratón Epithelim Medio de Crecimiento (M-TE-GM) componentes enumerados en la columna de la izquierda se disuelven en 1x DMEM F12 medio (Ham) a las concentraciones indicadas, columna derecha. La composición del medio final es libre de suero.

Se describe un ensayo de trasplante de la almohadilla de moda de ovario adecuado para estudios de epitelios normales y transformadas del tracto reproductivo femenino. La almohadilla de grasa del ratón permite el trasplante de fragmentos grandes de tejido, es de fácil acceso para la cirugía y la imagen, y proporciona el entorno nativo más favorable para los tejidos de origen de Müller.

Trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

El objetivo general de este ensayo de trasplante del páncreas adiposo ovárico es facilitar estudios de epitelios normales y transformados del tracto reproductivo femenino en el entorno nativo más favorable. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo, como el potencial de diferenciación, regenerativo y neoplásico de poblaciones celulares específicas del tracto reproductivo femenino. La principal ventaja de esta técnica es que el páncreas adiposo ovárico del ratón permite el trasplante de células y fragmentos tisulares grandes.Es fácilmente accesible para cirugía e imágenes. La cavidad peritoneal y la bursa ovárica se utilizan frecuentemente como sitios para el trasplante ortotópico de células epiteliales del tracto reproductivo femenino. Estos métodos tienen varias limitaciones.Después de sacrificar ratones beta-actina EGFP o ratones beta-actina DS rojos según el protocolo descrito en el texto, coloque un ratón individual sobre un campo absorbente con la cara ventral hacia arriba. Abra la piel realizando una incisión media lateral y, con las yemas de los dedos, tire de la piel por encima y por debajo de la incisión hacia la cabeza y la cola del ratón. Utilizando pinzas romas, sostenga el peritoneo y use tijeras finas para abrir la cavidad corporal.Luego, empuje suavemente la bobina del intestino hacia un lado y localice los órganos reproductivos. Con pinzas finas, tome un cuerno uterino y corte 0,5 centímetros por encima del punto donde se separan los cuernos uterinos. A continuación, mientras sostiene el cuerno uterino, separe el tejido conectivo adherido al cuerno uterino, al tubo uterino, al ovario y al tejido adiposo ovárico.Coloque el tracto reproductivo diseccionado en un recipiente con seis mililitros de PBS estéril y continúe con el segundo tracto reproductivo antes de cultivar las células de epitelio tubárico primario, o TE, según el protocolo descrito en el texto. Después de diseccionar tubos uterinos individuales de los cuernos uterinos de ratones vírgenes beta-actina DS rojos de seis a ocho semanas de edad en PBS según el protocolo descrito en el texto, bajo un microscopio de disección, transfiera tubos uterinos individuales a una gota de 200 microlitros de PBS. Utilizando pinzas y agujas de calibre 28, desenrolle suavemente los tubos uterinos eliminando el mesosálix, una porción del ligamento ancho que sostiene los segmentos del tubo uterino.Coloque tubos uterinos individuales y parcialmente desenrollados en una gota de 200 microlitros de PBS frío con hielo hasta que la almohadilla grasa ovárica del receptor quede expuesta y esté preparada para recibir el trasplante. Traslade el animal a una cabina de seguridad biológica para realizar el trasplante en la almohadilla grasa. Después de anestesiar un ratón singénico según el protocolo descrito, use una afeitadora número 40 para rasurar un área del doble del tamaño del área quirúrgica.Utilice povidona-iodo, seguido de etanol al 70%, para realizar tres frotis quirúrgicos. A continuación, coloque al animal bajo un microscopio estereoscópico. Luego, utilizando un bisturí, realice una incisión en la posición dorsomedial directamente por encima del tejido adiposo ovárico y exponga el tracto reproductivo.A continuación, cubra el área con un campo estéril. Luego, con pinzas finas de punta roma, extraiga cuidadosamente el páncreo adiposo ovárico a través de la incisión hacia la línea media, minimizando el daño a los nervios y a los vasos sanguíneos principales. Para prevenir el retraso en el crecimiento de los trasplantes, la incisión en el páncreo adiposo debe realizarse con la mayor precisión posible, ya que desgarrar o perforar completamente el páncreo adiposo provoca hemorragia.Los coagulantes deben usarse para detener el sangrado según sea necesario. Utilice una aguja biselada de 28 gauge para hacer una incisión de 2 a 4 milímetros de profundidad en el páncreas adiposo ovárico, a 3 a 4 milímetros por encima del ovario, asegurándose de que la aguja penetre aproximadamente hasta la mitad del páncreas adiposo. Para los trasplantes celulares, llene una jeringa con una aguja de 30 gauge con 10 a 20 microlitros de la mezcla de matriz de membrana basal celular e inyéctela en la incisión del páncreas adiposo.Para el trasplante del tubo uterino, utilice pinzas finas para tomar el tubo uterino y colóquelo en 10 a 20 microlitros de matriz de membrana basal mantenida en hielo. Luego, con una punta filtrante graduada de 0,1 a 10 a 20 microlitros XL, aspire la suspensión del tejido y la matriz de membrana basal y libérela dentro de la incisión del tejido adiposo. Espere cinco minutos para que la matriz de membrana basal se solidifique y coloque nuevamente el tracto reproductivo en el peritoneo.Cierre los músculos con dos puntadas de sutura quirúrgica y use clips pequeños para heridas o suturas quirúrgicas para cerrar la piel. Después del trasplante, permita que el animal se recupere según el protocolo descrito en el texto. Para recolectar y preservar los injertos, prepare una solución al 4% de paraformaldehído, o PFA, mezclando 26 mililitros de agua doblemente destilada con cuatro mililitros de PBS 10X y 10 mililitros de solución de PFA al 16%.Después de diseccionar en un solo bloque el páncreas ovárico injertado, el ovario, la trompa uterina y el útero, coloque inmediatamente el tejido en dos mililitros de PFA al 4 % y fije a temperatura ambiente durante dos horas. Del mismo animal, fije y procese de manera similar el control del páncreas ovárico contralateral no injertado. Después de la fijación, lave los tejidos con PBS tres veces durante cinco minutos cada vez e incube en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche.Realice imágenes en montaje completo e histología según el protocolo descrito. En este experimento, se trasplantó e injertó una trompa uterina de un ratón beta-actina DS rojo en el cojín adiposo ovárico, como se observa en esta imagen de fluorescencia. Aquí se muestran los crecimientos de células epiteliales tubáricas primarias de ratón procedentes de ratones beta-actina EGFP y ratones beta-actina DS rojo ocho días después del trasplante en un ratón singénico.Esta imagen muestra injertos de células HI0118 mixtas marcadas con Lenti-eGFP o Lenti-mCherry 10 días después del trasplante en un ratón NSG. En estos paneles, las flechas indican un injerto de 43 días de edad procedente del trasplante de células HI0118 mixtas en un ratón SCID. En esta imagen fluorescente, se muestra un tubo uterino completo de un ratón beta-actina DS rojo seis días después del trasplante en el tejido adiposo ovárico.En este panel, una sección congelada del tejido adiposo fluorescente se contratiñe con DAPI. Este injerto de trompa uterina a los 40 días posteriores al trasplante en un ratón receptor NSG muestra una preservación completa de los componentes de la trompa uterina y ausencia de fibrosis e inflamación. Finalmente, las secciones se tiñeron con los marcadores del epitelio tubárico Pax8 y FOXJ1 y se contratiñeron con verde metilo para demostrar la preservación de las células ciliadas y secretoras, respectivamente.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 a 30 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante preparar con antelación las placas quirúrgicas, los reactivos y los instrumentos. Tras seguir este procedimiento, otros métodos, como la imagenología intravital y las inyecciones de fármacos anticancerígenos, pueden ayudar a responder preguntas adicionales, tales como la formación del cáncer y los efectos de la terapia anticancerígena.Esta técnica allana el camino para que los investigadores en los campos de la biología reproductiva y el cáncer de ovario exploren las funciones normales de las células madre y el desarrollo del cáncer en los tejidos del tracto reproductivo femenino. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células y tejido del tubo uterino y luego trasplantarlos en el tejido adiposo. No olvide que trabajar con animales en condiciones estériles durante cirugías de supervivencia es extremadamente importante para obtener un resultado exitoso.Proporcionar una almohadilla térmica para mantener calientes a los roedores mejora considerablemente la tasa de supervivencia.

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Investigación

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Medicina

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado...

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

En este video, usamos un modelo de ratón hembra eutanasiado con cáncer de ovario. A continuación, describimos un protocolo para identificar y extraer depósitos de grasa o tejidos adiposos asociados a los cinco órganos peritoneales primarios para estudiar la colonización de células cancerosas metastásicas.

Recolección de depósitos de grasa peritoneal: una técnica para estudiar la colonización por cáncer de ovario de tejidos adiposos peritoneales en modelos de ratón

En este video, demostramos un ensayo para el trasplante de células experimentales y fragmentos de tejido en la almohadilla de grasa ovárica de ratón. Este método se puede utilizar para monitorizar la regeneración celular y la transformación tumoral mediante técnicas no invasivas.

Ensayo de trasplante de almohadilla de grasa ovárica: una técnica in vivo para introducir células en almohadilla de grasa ovárica en modelos de ratón

Este video describe el protocolo para crear un modelo experimental murino para estudiar el desarrollo tumoral y la metástasis peritoneal. Este modelo de cáncer de ovario se genera mediante la inoculación ortotópica de células epiteliales de cáncer de ovario humano en los ovarios de una ratón.

Inoculación ortotópica de células de cáncer de ovario en ovarios murinos: un procedimiento para establecer un modelo de ratón de cáncer de ovario para estudiar la diseminación peritoneal de las células

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para extraer ovario intacto de un modelo de ratón.

Recolección de ovario intacto de ratón: un procedimiento quirúrgico para aislar ovario completo de un modelo murino

Describimos un protocolo que implementa enfoques in vivo y ex vivo para estudiar la colonización del cáncer de ovario por los tejidos adiposos peritoneales, particularmente el epiplón. Además, presentamos un protocolo para cuantificar y analizar las estructuras de las células inmunitarias en el epiplón conocidas como manchas lechosas, que promueven las metástasis del tejido adiposo peritoneal.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

Aquí descritos es orthotopic trasplante ovárico protocolos para modificar el ovario influencia sobre la fisiología del ratón receptor. Este procedimiento quirúrgico se utiliza para exponer ratones hembra a los varios tipos de influencia ovárico y puede incluir trasplantes heterocrónicas y el trasplante de ovarios que han experimentado diversos tratamientos ex vivo .

Ortotópico trasplante ovárico procedimientos para investigar la influencia de la vida y salud de la senescencia ovárica en ratones hembra

Para algunos pacientes, la única opción para la preservación de la fertilidad es la criopreservación de tejido ovárico. Desafortunadamente, la revascularización tardía socava la viabilidad folicular. Aquí, presentamos un protocolo de co trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales para utilización como una estrategia basada en celda combinando acelerada la perfusión con una entrega de paracrina directa de moléculas bioactivas.

Co el trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales Ingeniería: una combinación de estrategia basado en la célula acelerada perfusión con entrega directa paracrina

Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.

Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

Aquí presentamos un protocolo de trasplante de tejido adiposo blanco y marrón que ofrece una estrategia prometedora para revertir la subfertilidad, la obesidad y la hiperglucemia, al tiempo que mejora la función renal en ratones BTBR diabéticos y obesos.

Injertos adiposos blancos y marrones: un enfoque para corregir los déficits reproductivos, metabólicos y renales en ratones obesos negros y tostados (BTBR)

Aquí presentamos un protocolo paso a paso para establecer los modelos de tumores intraperitoneal e intrabursal para estudiar la progresión, metástasis y respuesta terapéutica del cáncer de ovario. Además, describimos cómo utilizar imágenes in vivo no invasivas basadas en luciferasa en estos modelos para monitorizar la progresión tumoral en ratones.

Modelos tumorales trasplantables clínicamente relevantes para estudiar el cáncer de ovario metastásico y la respuesta terapéutica en ratones

Aprende el trasplante en la almohadilla del ovario de ratón para estudiar epitelios normales y transformados del tracto reproductivo femenino. Este método permite investigar diferenciación, regeneración y potencial neoplásico celular.

Trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa

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