Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo la electroforesis capilar-espectrometría de masas, o CE-MS, utilizando una interfaz de punta porosa sin vaina, se puede utilizar para el análisis de metabolitos altamente polares y cargados. Suponiendo que no se pueden cargar metabolitos a menudo, y que pueden ser catiónicos o aniónicos, y separarlos mediante separaciones electrolíticas como la electroforesis capilar, es el método más adecuado. Sin embargo, en los últimos años, la sensibilidad no fue lo suficientemente buena.

Eso se debía a la interfaz y al método que tampoco era sólido. Pero creo que hemos resuelto muy bien ambos problemas utilizando una funda como interfaz libre y para usar este nuevo protocolo. La espectrometría de masas por electroforesis capilar que utiliza una novedosa interfaz de punta porosa sin vaina puede utilizarse para abordar cuestiones clínicas clave en el campo de la metabolómica.

Por ejemplo, el perfil de metabolitos altamente cargados polarmente se puede realizar fácilmente con esta tecnología. Compuestos S separados en base a la relación carga-tamaño. Más a menudo, esta técnica es muy adecuada para el perfilado de este tipo de compuestos marcados en volumen a muestras biológicas.

Una característica única de la metodología CE-MS sin vaina propuesta es que se pueden utilizar para el perfil de metabolitos aniónicos y catiónicos solo cambiando la polaridad de voltaje CE y la polaridad de detección MS. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la CE-MS se considera una técnica relativamente nueva y complicada. Para comenzar este procedimiento, coloque un nuevo cartucho de sílice fundida desnudo con un emisor de punta porosa en la electroforesis de la zona capilar o instrumento CE.

Aplique un enjuague de metanol hacia adelante a 50 psi durante 15 minutos con el software que controla el instrumento CE. Y compruebe visualmente si el líquido fluye desde la salida capilar. Luego, realice un enjuague en la dirección opuesta a 50 psi durante cinco minutos usando el electrolito de fondo, o solución BGE, para examinar visualmente si el líquido fluye desde el capilar conductor.

Repita el paso anterior a una presión de 100 psi en caso de que no se haya observado que el líquido salga de la salida capilar. A continuación, enjuague el capilar de separación con agua a 50 psi durante 10 minutos, seguido de hidróxido de sodio 0,1 molar a 50 psi durante 10 minutos, agua a 50 psi durante 10 minutos y solución de BGE a 50 psi durante 10 minutos. A continuación, retire la punta del pulverizador del cartucho de sílice fundida del tubo de agua e instálelo en el adaptador de fuente de nanospray para acoplarlo al instrumento MS.

Asegúrese de que la altura de los viales de solución de BGE en el instrumento CE coincida con la altura de la punta del rociador. Verifique el flujo de líquido a través del capilar conductor enjuagando con la solución de BGE a 50 psi durante cinco minutos. Durante este paso de enjuague, se debe observar una gota de líquido en la base de la ionización por electrospray, o aguja rociadora ESI.

Después de enjuagar, enjuague el capilar de separación con solución de BGE a 50 psi durante 10 minutos en la dirección de avance. Se debe observar una gota de líquido en la punta del emisor de punta porosa durante este paso. Ahora, coloque el emisor de punta porosa en la entrada de la MS a una distancia aproximada de dos a tres mm.

Aplique un voltaje de 30 kV usando un tiempo de rampa de un minuto y comience a adquirir datos MS en el rango de masa a carga de 65 a 1000 para estudios de perfiles metabólicos utilizando primero un voltaje ESI de cero. Ajuste el voltaje ESI a 1000 V mientras mide los datos. Aumente el voltaje ESI con incrementos de 200 V hasta que se observe una señal de fondo constante durante al menos 15 minutos.

Transfiera 20 microlitros de una mezcla estándar de metabolitos aniónicos previamente preparada a un microvial vacío de 100 microlitros. Coloque el microvial en un vial CE y coloque el vial CE en la bandeja de muestras de entrada. Inicie un método de modo de iones negativos de adquisición MS creado anteriormente y, posteriormente, inicie la secuencia CE utilizando el software que controla el instrumento CE.

Después de esto, enjuague el capilar de separación con una solución de BGE a 50 psi durante tres minutos, seguido de inyecciones a dos psi durante 60 segundos y un psi durante 10 segundos. Aplique un voltaje de 30 kV con un tiempo de rampa de un minuto y una presión de 0,5 psi durante 30 minutos en la entrada. Después de una separación electroforética de 30 minutos, detenga la adquisición de datos MS y disminuya el voltaje CE a 1 kV utilizando un tiempo de rampa de cinco minutos.

Entre las inyecciones de muestras, enjuague el capilar de separación con agua, hidróxido de sodio 0,1 molar, agua y solución de BGE a 30 psi durante tres minutos. Una vez completadas las carreras, analice los datos registrados determinando los tiempos de migración y la intensidad de la señal de la mezcla de metabolitos aniónicos analizada. Evaluar si los patrones de metabolitos aniónicos aparecen en la región entre 10 y 28 minutos.

Luego, verifique si los tres isómeros estructuralmente relacionados, D-glucosa 1-fosfato, D-glucosa 6-fosfato y D-fructosa 6-fosfato, están parcialmente separados. Se demuestra el rendimiento de separación del método CE-MS sin vaina para el análisis de metabolitos aniónicos altamente polares para tres isómeros de fosfato de azúcar estructuralmente relacionados. Aunque no se obtuvo una separación basal para estos tres analitos, una separación parcial es suficiente para permitir su detección selectiva por MS, ya que estos analitos tienen la misma masa exacta.

Al analizar muestras biológicas, con esta metodología CE-MS sin vaina, es importante verificar regularmente el rendimiento analítico a lo largo del tiempo utilizando estándares académicos. En general, la metodología sin vaina permite el perfilado de este tipo de compuestos en muestras biológicas ultra pequeñas, lo que abre muchas posibilidades para analizar este tipo de muestras en los campos de las ciencias biomédicas, los campos de la química bioanalítica y áreas de investigación fuera de ella. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo acoplar CE a MS a través de una interfaz porosa sin vaina para el perfil de metabolitos altamente polares y cargados.