Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

El objetivo general de este procedimiento es identificar moléculas pequeñas que sean capaces de interrumpir la interacción entre los canales TRIP8b y HCN. Este método identifica moléculas candidatas que podrían convertirse en nuevos tratamientos para la depresión. La principal ventaja de esta técnica es que se puede completar de una manera de alto rendimiento.

Esta técnica tiene implicaciones para el desarrollo de una nueva terapia para el trastorno depresivo mayor, ya que nuestro laboratorio ha demostrado que la interrupción de la unión de TRIP8b a HCN puede ser beneficiosa terapéuticamente. Aunque este método se desarrolló teniendo en cuenta la depresión, la interrupción de la interacción entre TRIP8b y HCN puede ser beneficiosa terapéuticamente en otros trastornos, como el dolor crónico. La demostración visual de este protocolo es importante porque ilustra los beneficios de usar instrumentos automatizados de alto rendimiento para avanzar en la investigación básica y traslacional en instalaciones abiertas como el laboratorio de análisis de alto rendimiento de la Universidad Northwestern.

Después de purificar el fragmento de proteína TRIP8b 241-602 y examinar las interacciones proteína-proteína con un control positivo de acuerdo con el protocolo de texto, descongele las alícuotas de TRIP8b y HCN1-FITC y manténgalas en hielo. Utilice FP Buffer para preparar 20 mililitros de 2 micromolares TRIP8b y 50 nanomolares HCN1-FITC. A continuación, dispense 25 microlitros de la mezcla en cada pocillo de una placa de microtitulación negra de 384 pocillos de baja unión.

Para la detección de bibliotecas, use un manipulador de líquidos acústico para dispensar 100 nanolitros de compuestos en cada pocillo de las columnas 3 a 22 para una concentración final de 40 micromoles. Dispense 100 nanolitros de DMSO en cada pocillo de las columnas 1 y 23 como controles negativos. Dispensar 100 nanolitros de péptido HCN1 sin marcar en cada pocillo de las columnas 2 y 24 como controles positivos con una concentración final de 10 micromoles.

Incubar las placas a temperatura ambiente durante dos horas. Con un lector de placas, mida la polarización de fluorescencia. Alternativamente, las placas pueden almacenarse durante 16 horas a 4 grados centígrados antes de leerlas.

Usando la siguiente ecuación, calcule el porcentaje de inhibición, donde XN es el porcentaje normalizado de inhibición correspondiente a la señal, X.X positivo es la señal promedio de los pozos de control positivos y X negativo es la señal promedio de los pozos de control negativos. Para validar Hits con más del 50% de inhibición, prepare una mezcla maestra de 20 mililitros de 2 micromolares TRIP8b y 50 nanomolares HCN1 TAMRA en tampón FP. Dispense 25 microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa negra de microtitulación de 384 pocillos.

A continuación, añada 100 nanolitros de compuestos de una placa que contenga diluciones en serie dobles de cada compuesto activo en los pocillos respectivos. Para los pozos de control negativo, agregue 100 nanolitros de DMSO. Para un control positivo, agregue 100 nanolitros de péptido HCN1 sin marcar diluido en serie con concentraciones finales que oscilan entre 200 micromoles y 0,1 micromoles.

Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas, o a 4 grados centígrados durante 16 horas. Usando un lector de placas, mida la polarización de fluorescencia. Calcule los valores de IC50 ajustando los datos de FP dependientes de la concentración de cada compuesto utilizando un modelo de regresión no lineal de 4 parámetros.

Descongele una alícuota de cada una de las proteínas de fusión HCN1 marcadas con HIS TRIP8b y GST y manténgalas en hielo. Prepare 1 mililitro de 200 nanomolares HIS TRIP8b y 20 nanomoles de GST-HCN1C40 en tampón de ensayo para cada compuesto a probar. Utilice una pipeta de 16 canales para añadir 7 microlitros de la mezcla GST-HCN1C40 HIS-TRIP8b a tres pocillos por fila de filas de la A a la N para probar cada compuesto por triplicado.

Centrifuga brevemente la placa para asegurarte de que los líquidos estén en el fondo de cada pocillo y para eliminar las burbujas. A continuación, dispense los compuestos Hit que se van a probar en la placa para lograr una concentración final de 200 micromoles en la fila A y termine con 0,1 micromoles en la fila L. Agregue el mismo volumen de DMSO en la fila M. Luego dispense el péptido HCN1 sin etiquetar a una concentración final de 10 micromoles en la fila N. Agite la placa durante dos minutos e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Con tampón de ensayo, diluya las perlas aceptoras anti-GST de 1 a 50.

Con una pipeta de 16 canales, añada 3,5 microlitros de las perlas aceptoras diluidas a cada pocillo de la placa y mezcle pipeteando suavemente para evitar la creación de burbujas. Incube la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Diluya las perlas donantes de quelato de níquel de 1 a 50 con tampón de ensayo sin exponer la mezcla a la luz.

Añade 3,5 microlitros de las perlas donantes diluidas a cada pocillo del plato y mezcla suavemente, evitando las burbujas de aire. Selle la placa e incubela en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1,5 horas. A continuación, utilice un lector de placas para leer la placa con los parámetros de medición que se enumeran aquí.

Finalmente, calcule los valores de IC50 ajustando los datos para cada compuesto utilizando un modelo de regresión no lineal de 4 parámetros. Para evaluar la interacción con HCN1, TAMRA, TRIP8b se tituló en una concentración fija de HCN1 TAMRA. Este gráfico muestra que a medida que aumenta la concentración de TRIP8b, más moléculas de HCN1 TAMRA se unen y aumenta la polarización.

En este experimento, cuando HCN1 no marcado se tituló en una concentración fija de TRIP8b y HCN1 TAMRA, el péptido marcado se desplazó y la señal disminuyó. Un cribado de alto rendimiento muestra el porcentaje de inhibición de cada compuesto representado por puntos individuales en el gráfico. Los resultados de este cribado se trazan con controles positivos y negativos, y cada uno de ellos tiene el porcentaje medio de inhibición de cada compuesto a lo largo de dos fases del ensayo.

Los compuestos que mostraron más del 50% de inhibición se validaron en este experimento. Las coordenadas X e Y se determinaron por el porcentaje de inhibición en dos tandas del ensayo. En este experimento, HCN1C40 contiene una etiqueta GST de terminal final que se une a las cuentas del aceptor.

La interacción de los dominios TPR de TRIP8b y el tripéptido terminal C de HCN1 excita la perla donante con luz de longitud de onda de 680 nanómetros para producir oxígeno singlete. Finalmente, como se muestra en este gráfico, la titulación de concentraciones crecientes del compuesto golpeado NUCC-5953 en una concentración fija de TRIP8b y HCN1C40 aumentó la inhibición de la interacción TRIP8b HCN1. Antes de comenzar el cribado de alto rendimiento, valide la preparación de proteínas y la polarización de fluorescencia en ensayos de proximidad basados en microrón.

Asegúrese de que la proteína sea de alta pureza. Alícuota la proteína para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación. Es importante utilizar reactivos de alta calidad, incluidos DMSO y Triton frescos.

No olvide que trabajar con el DMSO puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electrofisiología y la citometría de flujo para determinar si los compuestos golpeados tienen actividad en las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una pantalla de alto rendimiento con un ensayo basado en polarización de fluorescencia.