Multimodal de imágenes y la Plataforma Microendoscopy Espectroscopia de fibra paquete para no invasiva, En Vivo Análisis de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es la caracterización funcional del tejido in vivo mediante la combinación de información estructural de alta resolución con datos espectrales cuantitativos. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como la cuantificación de los efectos de la terapia sobre la microestructura y la perfusión de los tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar una sola sonda para recopilar datos de imagen y espectroscopia desde la misma ubicación.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del cáncer gastrointestinal debido a que la sonda es compatible con las técnicas endoscópicas convencionales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque pequeñas irregularidades en la colocación de la sonda pueden afectar significativamente la precisión de los datos. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de la importancia de combinar una técnica de imagen de alta resolución con un método de espectroscopia cuantitativa.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación son difíciles de aprender debido a la complejidad tanto de la construcción como de la calibración. Para comenzar a ensamblar la modalidad de microscopía de fluorescencia de alta resolución del microendoscopio multimodal, monte un espejo dicroico de 470 nanómetros en un cubo de jaula de 30 milímetros. Fije las varillas de ensamblaje de la jaula a los lados delantero, derecho e izquierdo del cubo de la jaula.

Fije un anillo de retención sin tensión a una placa de jaula roscada y atornille un tubo de lente en el anillo de retención. Coloque otra placa de jaula en el tubo de la lente alineada con la primera placa de jaula. A continuación, asegure un espejo de aluminio mejorado con rayos UV en un soporte de espejo en ángulo recto.

Coloque cuatro varillas en la parte delantera de la montura del espejo y dos varillas en diagonal al lado derecho de la montura. Deslice el conjunto del tubo de la lente en el lado izquierdo del cubo de la jaula. Conecte el lado derecho del conjunto de la montura del espejo al conjunto del tubo del lente.

Deslice un soporte de traslación del eje Z en el lado derecho del ensamblaje. Coloque una lente de objetivo acromático de 10x en la montura de traslación. A continuación, fije una placa adaptadora de fibra a una montura de lente de traslación del eje XY.

Deslice la montura en el conjunto delante de la lente del objetivo. Usando anillos de retención, asegure un filtro de excitación y un filtro de emisión apropiados en los tubos de la lente. Atornille el tubo de la lente del filtro de excitación en la parte delantera del cubo de la jaula.

Y el tubo de la lente del filtro de emisión en la parte delantera de la montura del espejo en ángulo recto. Con epoxi, conecte un LED de 455 nanómetros a la placa de la jaula frente al filtro de excitación. Deslice una placa de jaula frente a cada tubo de lente de filtro.

Con un anillo de retención, asegure una lente de tubo doble acromático en otro tubo de lente de modo que la flecha en el exterior de la lente mire hacia el lado roscado externamente del tubo de la lente. Coloque la lente del tubo en la placa de la jaula izquierda, coloque otra placa de la jaula frente a la lente del tubo. Con un anillo de retención sin estrés, conecte una cámara monocromática USB a la placa del armazón.

Para comenzar a ensamblar la modalidad de espectroscopia de reflexión subdifusa, conecte una placa de jaula roscada a la parte frontal de una fuente de luz halógena de tungsteno con epoxi. Inserte cuatro varillas de ensamblaje de jaula en la placa de jaula y deslice un soporte de traslación del eje Z en las varillas. Atornille una lente de objetivo acromática de 20x en la montura de traslación del eje Z.

Conecte una placa adaptadora de fibra a una montura de traslación del eje XY y deslice la montura en el ensamblaje frente a la lente del objetivo. Por último, fije ambos conjuntos a una mesa óptica muy cerca unos de otros utilizando los dispositivos de montaje adecuados. Para comenzar a construir el dispositivo de conmutación de separación del detector de fuente, atornille una placa adaptadora de fibra SMA roscada externamente en un brazo de motor de aluminio.

Conecte un adaptador de brazo del motor en la parte posterior del brazo del motor. Luego, atornille un motor paso a paso en una carcasa de motor de aluminio. Enrosque el conjunto del brazo del motor en la varilla del motor y apriete el tornillo de bloqueo.

A continuación, atornille tres placas adaptadoras de fibra en un interruptor óptico y, a continuación, atornille la placa frontal en el interruptor óptico. Pase la varilla del motor paso a paso a través del orificio central del interruptor óptico. Coloque un controlador de motor paso a paso a través de la línea central de una tabla roja sin empapado.

Conecte el controlador a una fuente de alimentación adecuada y al motor paso a paso. Fije el interruptor óptico a la mesa óptica. Conecte un cable de conexión de 550 micrómetros y 0,22 na al brazo del motor.

Conecte el otro extremo a un espectrómetro USB. Para conectar la sonda de fibra óptica, conecte el cable central de fibra de imagen de 1 milímetro al conjunto de modalidad de microscopía de fluorescencia de alta resolución. Conecte el cable multimodo izquierdo de 200 micrómetros al conjunto de modalidad de espectroscopia de reflexión subdifusa.

Continuando desde la izquierda, conecte los cables multimodo restantes en orden a los adaptadores izquierdo, central y derecho del dispositivo de conmutación óptica. Para comenzar la calibración del experimento, conecte todos los periféricos USB a la computadora. Encienda toda la instrumentación y asegúrese de que el obturador de la lámpara halógena de tungsteno esté abierto.

Luego, apague las luces de la habitación y cierre otras fuentes de luz ambiental. Abra el software de adquisición de datos. Deje que el equipo funcione durante 30 minutos antes de proceder a la calibración.

Coloque un patrón de reflexión difusa del 20% en la sección inferior del dispositivo de calibración. Inserte la sonda de fibra óptica en la ranura izquierda del dispositivo y coloque el interruptor óptico motorizado a la izquierda para seleccionar el micrómetro 374 como configuración DS. En el software, establezca el tiempo de integración en 500 milisegundos.

A continuación, haga clic en adquirir espectro para comenzar la adquisición de RMAX para esta SDS. Una vez finalizada la adquisición de RMAX, guarde el espectro en una carpeta designada. Cierre el obturador de la lámpara halógena de tungsteno y adquiera el espectro oscuro R para esta SDS.

Abra el obturador, mueva la sonda a la ranura derecha del dispositivo de calibración y coloque el interruptor óptico motorizado en la posición central para el ajuste SDS de 730 micrómetros. Adquiera RMAX y RDARK para esta SDS para completar la calibración. Primero, determine el área de piel apropiada para la recopilación de datos.

Usando un resaltador amarillo como fuente de piranina, tiñe ligeramente el área elegida. Para comenzar la microscopía de fluorescencia de alta resolución, encienda el LED de 455 nanómetros y cierre el obturador de la lámpara halógena de tungsteno. Coloque la sonda de fibra óptica en contacto suave con la piel.

Mueva la sonda a través del tejido teñido con piranina para mostrar la arquitectura de información de corriente apical. En el software establezca un tiempo de exposición y una ganancia adecuados para evitar la saturación de la imagen. A continuación, haga clic en adquirir imagen para obtener una imagen estática.

Mantenga la sonda en su lugar para la espectroscopia de reflectancia subdifusa. Apague el LED de 455 nanómetros y abra el obturador de la lámpara halógena de tungsteno. A continuación, cambie a la configuración SDS de 374 micrómetros a la izquierda.

Haga clic en adquirir espectros para adquirir el espectro de tejido R para esta SDS. A continuación, cambie a la posición central y adquiera el espectro de tejido SDS R de 730 micrómetros. Abra el software de posprocesamiento y haga clic en ejecutar.

Cuando se le solicite, seleccione los espectros de calibración, los espectros in vivo y la imagen de fluorescencia de alta resolución para obtener la imagen de tejido. La modalidad de microscopía de fluorescencia de alta resolución proporciona una imagen enfocada y de alta resolución del sitio del tejido. La tinción de piranina muestra contornos individuales de queratinocitos.

El software de posprocesamiento utiliza los datos de espectroscopia de reflectancia subdifusa para calcular la concentración de hemoglobina, la concentración de melanina y la saturación de oxígeno en los tejidos. Un nevus melanocítico benigno se comparó con el tejido cutáneo normal vecino utilizando este microendoscopio multimodal. El nevo melanocítico mostró una concentración de hemoglobina ligeramente inferior y una concentración de melanina ligeramente elevada en comparación con el tejido normal.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante dejar que la lámpara halógena de tungsteno se caliente durante 15 minutos y calibrar la instrumentación con un estándar de reflectancia antes de la recopilación de datos. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otras técnicas como la microscopía confocal o la microscopía multifotónica para explorar los cambios subcelulares en la estructura o el metabolismo de las proteínas.

Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores exploren la relación entre la perfusión tisular y la microestructura en respuesta a la quimioterapia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir y usar un dispositivo híbrido de imágenes microendoscópicas y espectroscopia.