Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico

El objetivo general de este protocolo es ofrecer una nueva técnica de imagen preclínica, interoperatoria y quimioluminiscente que pueda proporcionar beneficios sobre las técnicas ópticas existentes en términos de relaciones señal-ruido y límites de detección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave que no han sido accesibles mediante las técnicas tradicionales de imagen óptica en muchos campos relacionados con las ciencias biológicas. Las principales ventajas de esta técnica son que tiene una alta relación señal-ruido y que no requiere luz ni radiación instantáneas.

Entonces, lo que descubrimos es que las implicaciones de esta técnica realmente se extienden hacia la obtención de imágenes interoperatorias de múltiples estados de enfermedad, incluido el cáncer, debido a las altas relaciones señal-ruido que esta técnica tiene para ofrecer. Como la luz incidente no es necesaria para esta técnica, no hay problemas con la absorción de la luz incidente. Además, hay una gran caja de herramientas químicas disponible para funcionalizar la molécula central quimioluminiscente.

Para comenzar el procedimiento, prepare 100 soluciones estándar de microlitros de cloruro de tris (bypiridina) rutenio (II) en agua de ósmosis inversa. Luego, combine cada patrón con 100 microlitros de una solución de 25 milimolares de nitrato de cerio y amonio en agua de ósmosis inversa en un portaobjetos de microscopio. Abra el software de imágenes del lector de bioluminiscencia y haga clic en inicializar.

En el modo de imagen, asegúrese de que luminiscente y fotografía estén marcados y que fluorescente esté desmarcado. Ajuste el tiempo de exposición luminiscente, el binning, el f/stop y los parámetros del filtro de emisión. Ajuste el tiempo de exposición de la fotografía, el binning y los parámetros f/stop.

A continuación, ajuste la altura del sujeto de acuerdo con la muestra que se va a fotografiar. Establezca el campo de visión en B para una distancia de 14 centímetros entre la cámara y la etapa de muestra. Cubra el suelo de la cámara de imágenes del lector de bioluminiscencia en la etapa de muestra con cartulina negra.

A continuación, coloque la primera diapositiva con la gota de mezcla estándar en la platina de muestra con la gota centrada en el punto de mira de la caja de luz verde. A continuación, llene la botella rociadora de tres onzas de un nebulizador hecho a medida con la solución 1:3 de trietilamina en una solución 50/50 de agua y etanol. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el tubo de aspiración.

Coloque el conjunto del nebulizador en la cámara de imágenes con la boquilla de pulverización apuntando hacia la gota que se va a fotografiar sin obstruir la vista de la cámara de la gota. Asegúrese de que el interruptor de encendido del nebulizador y el indicador de encendido estén encendidos, que el interruptor de palanca magnético esté apagado y que los cables del nebulizador de potencia y del control remoto no estén enredados. Cubra los puntos calientes, como las marcas en el portaobjetos, con pequeños trozos de cartulina negra.

Coloque al menos 40 centímetros del cable remoto del nebulizador en la cámara de imágenes. Cierre suavemente la puerta de la cámara sin engarzar los cables del nebulizador. En el software del instrumento, haga clic en adquirir, habilite el guardado automático y establezca la ruta del archivo de datos.

Inicie la secuencia de imágenes. Cuando el obturador se abra con un clic audible, cambie la palanca del nebulizador tres veces para rociar tres ráfagas de solución de trietilamina sobre la muestra. Repita el procedimiento con cada portaobjetos estándar para determinar la concentración mínima detectable del agente de imagen de rutenio.

Para comenzar el procedimiento de imagen in vivo, prepare 100 microlitros de una solución que contenga entre 8 y 33 nanomoles de cloruro de tris(bypiridina)rutenio(II) en solución salina tamponada con fosfato. Prepare una solución acuosa de 25 milimolares de nitrato de cerio amonical. A continuación, inyecte por vía intravenosa 100 microlitros del agente de imagen de rutenio en la vena de la cola de ratones sanos.

Sacrificar a los ratones 10 minutos después de la inyección por asfixia con dióxido de carbono. Retire la piel del torso con un corte en Y y luego retire el arco costal para exponer el corazón y los pulmones. Corta una salida en la aurícula derecha e inyecta 20 mililitros de PBS a través de una aguja de calibre 24 en el ventrículo izquierdo.

Corta a través de la piel del abdomen para exponer el riñón y el hígado. Si el órgano de interés es el hígado, el riñón o el bazo, haga un corte longitudinal visible a través del órgano. Prepare una nueva secuencia de imágenes en el software del lector bioluminiscente.

Para obtener imágenes de todo el abdomen, coloque el ratón en la cámara de imágenes con el abdomen abierto mirando hacia la cámara y la cabeza apuntando hacia la parte posterior del instrumento. Centre el órgano de interés en la cruz de la caja de luz verde. Lave a fondo la botella rociadora y la boquilla del conjunto del nebulizador y luego llene la botella con la solución de nitrato de cerio y amonio.

Coloque el nebulizador en la cámara de imágenes con la boquilla de pulverización dirigida al sitio de la imagen. Asegúrese de que la cámara no esté obstruida, que los cables no estén enredados y que haya al menos 40 centímetros del cable remoto en la cámara. Cierre la cámara e inicie la secuencia de imágenes.

A medida que el obturador se abre con un clic, cambie la palanca tres veces para rociar tres ráfagas del agente oxidante en el sitio de la imagen. Después de la toma de imágenes, retire el conjunto del nebulizador y enjuague bien la boquilla de pulverización para evitar la cristalización del nitrato de cerio y amonio. Para la posterior obtención de imágenes y cuantificación de órganos individuales, retire el ratón del instrumento y extirpe los órganos internos a partir de la cavidad corporal abierta.

Cortar la piel de la pata trasera para extirpar muestras de tejido muscular. Si el órgano de interés es el hígado, el riñón o el bazo, corte el órgano por la mitad longitudinalmente. A continuación, coloque el órgano en una placa de Petri o en un trozo de cartulina negra.

Visualice cada órgano de la misma manera que el animal entero, enjuagando la boquilla rociadora después de cada secuencia. En este procedimiento, se inyectó a los ratones un agente de imagen a base de rutenio y se roció el tejido de interés con un oxidante para inducir la quimioluminiscencia. Se determinó que la concentración mínima detectable del agente de imagen fue de 6,9 picomoles por centímetro cuadrado en estas condiciones.

Quimioluminiscencia en luz blanca Las imágenes de los órganos de interés se obtuvieron con un lector de bioluminiscencia. La señal de quimioluminiscencia se observó predominantemente en los riñones después de la inyección intravenosa, lo que indica la eliminación renal del catión hidrofílico tris(bypiridina)rutenio(II). La relación señal-ruido del agente de imagen frente al PBS solo fue de 27:1 en los riñones y de 21:1 en el hígado.

Los ganglios linfáticos poplíteos de ratón también se evaluaron con una inyección subcutánea de una solución más concentrada del agente de imagen a base de rutenio. Los ganglios linfáticos que contenían el agente de imagen mostraron un resplandor significativamente mayor que los ganglios linfáticos que contenían PBS solo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar excluir la luz ambiental y evitar la contaminación con rutenio tris bpy. Tras su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la imagen biomolecular exploren estados patológicos como el cáncer en ratones. Aunque este método puede proporcionar información sobre cuestiones a las que no se podía acceder mediante las técnicas tradicionales de imágenes ópticas, cualquier cuestión que pueda investigarse con técnicas tradicionales puede abordarse con quimioluminiscencia.