Name: Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende una técnica de imagen intraoperatoria quimioluminiscente con complejo de rutenio que mejora la relación señal-ruido en modelos biológicos. Este método ofrece mayor claridad sin luz incidente para investigación.

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Los autores agradecen al Prof. Jan Grimm y al Sr. Travis Shaffer por sus útiles discusiones y al Sr. David Gregory por editar el manuscrito. Se agradece los servicios técnicos prestados por el Centro Central de Imágenes Animales de MSK, respaldado en parte por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30CA008748-48 de los NIH. Los autores agradecen a los NIH (K25 EB016673 y R21 CA191679, T.R. y 4R00CA178205-02, B.M.Z.), al Centro MSK de Imágenes Moleculares y Nanotecnología (T.R.), a la Fundación Tow (B.C.) y a la National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 en Hunter College for B.C. y T.M.S.) por su generoso apoyo. La investigación reportada en esta publicación fue financiada por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah.

Declaración de la ética: Todos los experimentos con animales en vivo descritos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado y bajo las directrices éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC). 1. Construcción de un dispositivo de nebulización <ol><li> Adjuntar parte de madera A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en posición vertical en el centro de la parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3), utilizando dos tornillos (4 x 25 mm 2). Adjuntar madera parte C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) a la mitad de la parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) mediante un tornillo, de manera que la parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) todavía se pueden mover. Ver Figura 1. </li><li> Haga dos agujeros a través de la punta inferior de la botella de spray de disparo de un 3 oz mini rociador plástico (D) y empujar una varilla de acero inoxidable (10 cm de &quot;acero 1/16) (E) a través para formar dos bucles, uno a cada lado del gatillo. </li&gt; <li> Envuelva la parte inferior de la botella de spray con cinta adhesiva (F) para evitar los lazos de cable se deslice. Coloque la botella de spray a la madera la parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3), utilizando las dos bridas de plástico (28 cm) (G). </li><li> Cortar el motor servo 011 (I) y volverlo a conectar con los cables sueltos de la servo control (H). A continuación, conecte el servomotor a la parte superior de la parte de madera A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) el uso de cinta adhesiva. </li><li> Adjuntar un lápiz (J) a la palanca de servomotor con el clip de papel (K). Firmemente conectar las partes más externas del lápiz para los bucles de varilla de acero recubiertas de plástico que utilizan cables de torsión (L) y asegurar los extremos en el lápiz con cinta adhesiva. </li><li> Cortar el conector del cable magnético de la unidad de control del motor servo (M) y vuelva a conectarlo al cable del altavoz (N). A continuación, la cinta de la unidad de control del motor servo a la madera de la parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Cortar un cable con conectores magnéticos W1 por la mitad y colocar una parte por el extremo suelto de la s cobrepeaker cable (1 m). Conectar el interruptor de palanca (magnética) i2 y el poder p1 al cable W1 disponible y una batería de 9V. </li></ol> 2. Sensibilidad determinación del método <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar soluciones de [Ru (bpy) 3] Cl 2 en el agua de ósmosis inversa (100 l) en cantidades de 260 mg (347 nmol), 52 mg (69 nmol), 26 mg (34 nmol) , 5 g (6,9 nmol), 3 g (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), y 3 ng (3,5 pmol). </li><li> Mezclar 100 l de cada [Ru (bpy) 3] Cl 2 solución con 100 l de una solución acuosa de nitrato de cerio amonio ((NH4) 2 Ce (NO 3) 6) en agua (25 mM) en un portaobjetos de microscopio. </li><li> Configurar la adquisición en el lector de bioluminiscencia inicializando el software de imágenes. <ol><li> Iniciar sesión en el perfil de usuario y buscar la adquisición del panel de control. Haga clic en &quot;Iniciar&quot; y esperar hasta que el instrumento está listo. </li><li> Busque &quot;Modo de imagen&quot; y asegúrese de que &quot;luminiscente&quot; y &quot;Fotografía&quot; se comprueban y que &quot;fluorescente&quot; no esté marcada. </li><li> Cambio &quot;tiempo de exposición&quot; para establecer &quot;luminiscente&quot; a 20 s. Establecer los ajustes restantes para &quot;luminiscente&quot; de la siguiente manera: &quot;Agrupación&quot;: Media; &quot;F / parada&quot;: 1; y &quot;filtro de emisión&quot;: Abierto. NOTA: que tenga que ser adaptada de acuerdo con la instrumentación y configuración experimental utilizada Los tiempos de exposición, si es diferente de la configuración presentada. </li><li> Por &quot;Fotografía&quot;, utilice los siguientes ajustes: &quot;El tiempo de exposición&quot;: auto; &quot;Agrupación&quot;: Media; y &quot;F / parada&quot;: 8. Ajuste el &quot;Asunto Altura&quot; en las imágenes de target.Look para el menú desplegable &quot;Campo de visión&quot;. El ajuste inicial es &quot;C&quot; Cambiará a &quot;B&quot; (14 cm de distancia entre la cAmera y etapa de la muestra). </li></ol></li><li> Configurar el nebulizador mediante la colocación de un portaobjetos de microscopio en una hoja de papel de construcción negro en el suelo de la cámara de formación de imágenes para protegerlo de agente oxidante. Mezclar un 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] 2 Cl solución al con 100 l de una solución acuosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6. Observe el cuadro de cruz verde. <ol><li> Colocar el tema de imagen en el papel de construcción negro, de tal manera que el área de interés está en el centro de la caja de luz verde en forma de cruz aparece en la etapa de la muestra. Preparar el nebulizador separando la botella con atomizador de plástico del soporte de madera. Llene una solución de trietilamina (1: 3 en agua / etanol) en su depósito de plástico y vuelva a conectarlo al soporte de madera. </li><li> Coloque el nebulizador en el interior del lector de bioluminiscencia y asegúrese de que el cable de alimentación está desconectado del cable de nebulizador. Asegúrese de que el interruptor de encendidoestá activado, el interruptor de palanca está apagado, y el LED rojo está encendido Coloque el nebulizador de tal forma que el flujo de pulverización está dirigido hacia el área de interés en la materia de formación de imágenes, al tiempo que minimiza la vista obstrucción de la cámara hacia el tema de formación de imágenes por la cabeza de la boquilla de pulverización. </li><li> Colocar las piezas pequeñas, negro de papel de construcción más puntos calientes potenciales (por ejemplo, las marcas blancas en las placas del microscopio o en los sitios de inyección) para protegerlos de aerosol. Coloque al menos 40 cm de la cuerda alejada nebulizador dentro de la cámara de formación de imágenes, de manera que no interfiera con el sujeto de formación de imágenes, el nebulizador, o el pestillo de la puerta magnética. Cierre la puerta del sistema de imagen. NOTA: El punto de mira cambiará el tamaño basándose en el &quot;campo de visión&quot; en la configuración &quot;imagen viva&quot;; asegúrese de que está ajustado a &quot;B&quot;. </li></ol></li><li> Adquirir una imagen mediante el inicio de la secuencia de imágenes. Haga clic en &quot;Adquirir&quot; en el &quot;Panel de control de adquisición&quot;. En la primera imagen lentejcia, permiten el guardado automático si se desea (recomendado) y elija una carpeta de datos. Ignorar el cuadro de diálogo &quot;Editar etiquetas de formación de imágenes&quot; hasta el final de la secuencia. NOTA: El software de control muestra las acciones del instrumento paso a paso en tiempo real. Después de preparar la medición y moviendo la etapa de la muestra a la posición correcta, se abre el obturador de la cámara y cuenta el tiempo de medición. La apertura del obturador también puede ser escuchado por un sonido de clic generada por la máquina. </li><li> A medida que se abre el obturador, rocíe tres explosiones de una solución de trietilamina (1: 3 en agua / etanol, 0,24 ± 0,04 ml por ráfaga spray) cambiando el interruptor de palanca de tres veces para generar quimioluminiscencia. NOTA: La etapa de la muestra se mueva durante la medición. Deje suficiente cable (mínimo 40 cm) dentro del instrumento para permitir esto. Asegúrese de que la solución a pulverizar por el nebulizador puede ser aspirado por el tubo ascendente y que no hay burbujas de aire en la tubería. Tienen varias incluye batería de repuestos para el nebulizador listo en caso necesario. </li></ol> 3. Después de imágenes in vivo Sistémico inyección intravenosa <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene entre 8 y 33 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparar una solución acuosa de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en agua (25 mM) al mismo tiempo. </li><li> Por vía intravenosa inyectar 100 l de [Ru (bpy) 3] Cl 2 en la vena caudal de ratones sanos (n = 5). </li><li> La eutanasia a los ratones 10 minutos después de la inyección mediante asfixia con CO2. <ol><li> Quitar la piel con un Y-corte del torso, a continuación, quitar el arco costal en forma de U para exponer el corazón y los pulmones. Perfundir los ratones mediante la reducción de una salida en la aurícula derecha y la inyección de 20 ml de PBS a través de una aguja de calibre 24 en el ventrículo izquierdo 18. Corte con cuidado a través del vientrepiel y exponer el riñón y el hígado. Cortar longitudinalmente a través de los órganos para crear un corte visible. </li></ol></li><li> Configurar la adquisición como se describe en los pasos 2,3-2,6, con los siguientes cambios. <ol><li> Después de lavar a fondo el depósito de plástico nebulizador, llenarlo con una solución de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 en agua (25 mM) en lugar de trietilamina. NOTA: Es importante aclarar a fondo la boquilla del nebulizador después de cada uso, dado que la cristalización (NH4) 2 Ce (NO3) 6 pueden destruir la boquilla de pulverización después de varios usos. </li></ol></li><li> Utilice el conjunto de muestras de órganos animales o para la imagen. <ol><li> Para obtener imágenes de todo el abdomen, coloque la carcasa del ratón con el abdomen abierto frente a la cámara y la cabeza apuntando hacia la parte posterior del instrumento. Centrar el órgano para formar una imagen (por ejemplo, el hígado o el riñón) en el cuadro de luz verde en forma de cruz. </li><li> Fo individuo de imágenes de órganos y cuantificación, quitar el ratón desde el instrumento de imagen y el pin hacia abajo. A partir de la cavidad del cuerpo ya abierto-, extirpar los órganos internos (por ejemplo, riñón, hígado, pulmón, músculo, bazo, cerebro, y corazón). Corte a través de la piel de la pierna trasera para extirpar el tejido muscular. Abra cuidadosamente el cráneo con un bisturí para cortar el cerebro. <ol><li> Si el órgano de interés es el hígado, los riñones o el bazo, cortar todos los órganos en la mitad longitudinalmente, coloque cada órgano en una placa de Petri o un pedazo de papel de construcción negro. </li></ol></li><li> Siga el procedimiento descrito en los pasos 2.3-2.6 para establecer la relación de emisión del trazador de quimioluminiscencia de órganos individuales. </li></ol></li></ol> 4. imágenes in vivo de los ganglios linfáticos <ol><li> Preparar 10 l de una solución de PBS que contiene 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparar una solución acuosa de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en water (25 mM) al mismo tiempo. </li><li> Inyectar 10 l de la solución por vía subdérmica en la pata trasera de ratones sanos (n = 5). Como control negativo, inyectar la pata contralateral con 10 l de PBS puro. Sacrificar los ratones mediante asfixia con CO2 15 minutos después de la inyección. Retire la piel de ambas patas traseras para dejar al descubierto los canales linfáticos hasta los ganglios linfáticos poplíteos. </li><li> Configurar la adquisición como se describe en el paso 3.4. </li><li> Extraer los ganglios linfáticos poplíteos de ambas patas traseras, cortarlos por la mitad, y rociarlas con oxidante en un plato de Petri, como se ha descrito antes (etapa 3.5.3), con el propósito de cuantificación. </li></ol>

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<li>Bœuf, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/262418715_Encapsulated_RutheniumII_Complexes_in_Biocompatible_PolyDL-lactide-co-glycolide_Nanoparticles_for_Application_in_Photodynamic_Therapy">Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy.</a> ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).</li>
<li>Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+its+applications+in+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and its applications in surgery.</a> Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).</li>
<li>Barry, N. P. E., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+Metals+in+Medicine%3A+How+Nanotechnology+May+Help+To+Shape+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future.</a> ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).</li>
<li>Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Emission+of+Cationic+Iridium+%28III%29+Complexes+Towards+the+Red+Through+Methoxy+Substitution+of+the+Cyclometalating+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand.</a> Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).</li>
<li>Truong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescence+detection+with+water-soluble+iridium%28III%29+complexes+containing+a+sulfonate-functionalised+ancillary+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand.</a> Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos presentado una tecnología que es capaz de delinear ópticamente tejido por medio de la emisión de fotones creados por un reportero de quimioluminiscencia. En contraste con otras, más establecido, las tecnologías de 4, 5, 6, 7, 8, 9, este sistema reportero quimioluminiscente emplea una sonda de formación de imágene...

En las últimas décadas, las tecnologías de imágenes han revolucionado la forma en que los médicos a diagnosticar y controlar la enfermedad. Estas tecnologías de la imagen, sin embargo, han sido en gran parte limitada a los sistemas de formación de imágenes de todo el cuerpo, como la tomografía por emisión de positrones (PET), emisión de fotón único tomografía computarizada (SPECT), tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN). Especial atención se ha prestado a cáncer, y los avances tecnológicos de imagen han mejorado en gran medida la forma en que esta enfermedad es diagnosticada y tratada. A pesar de estos avances, hay un lugar donde estas tecnologías de imagen simplemente no encajan: la sala de operaciones. Mientras que las técnicas de imagen de todo el cuerpo puede ayudar en la planificación quirúrgica, por lo general carecen de resolución espacial lo suficientemente altas como para ayudar a los médicos a determinar en tiempo real si todo el tejido del tumor ha sido eliminado o tejido tumoral residual permanece oculto en los márgenes quirúrgicos 1. Asegurándose de que no infiltrantelos márgenes del tumor se quedan atrás es uno de los objetivos quirúrgicos más importantes, y los cirujanos deben caminar una cuerda floja entre la resección de tejido rigurosa y prudente. Si se quita demasiado, se exacerban los efectos secundarios no deseados para el paciente; si no hubiese suficiente se retira, las tasas de recurrencia se incrementan 2, 3. Por lo tanto, es crucial para delinear los márgenes tumorales precisos, y creemos que las imágenes intraoperatorias quimioluminiscente puede ayudar a mejorar la precisión de la identificación de los márgenes del tumor, ayudando a los cirujanos visualizar el tejido maligno que de otro modo podrían no ser detectados con técnicas establecidas. Hay muchas tecnologías de imagen que actualmente se investigan por su posible utilidad como sistemas de imágenes intraoperatorias. Estos incluyen sondas y ß-γ-emisores de radiación de fluorescencia óptica 4, 5, 6 espectroscopia Raman </sup&gt;, 7 y Cherenkov luminiscencia 8, 9. Hasta la fecha, sin embargo, ninguno de ellos se han establecido como herramientas clínicas estándar. imágenes de fluorescencia óptica hasta ahora ha demostrado ser el más prometedor de estas técnicas y por lo tanto es el más explorado. Si bien ya se ha demostrado ser una herramienta valiosa para muchas aplicaciones, no es sin sus limitaciones. De hecho, su principal inconveniente es la fluorescencia de fondo generado por el tejido biológico inherentemente autofluorescent. Esta señal de fondo autofluorescente es un producto de la excitación del tejido circundante, además de la fluoróforo, por la fuente de luz externa necesaria para la generación de una señal fluorescente. Desde una perspectiva práctica, esta autofluorescencia puede potencialmente conducir a bajas relaciones señal-ruido, que pueden limitar la utilidad de esta tecnología en la sala de operaciones. El directorventaja de quimioluminiscencia de imágenes sobre imágenes de fluorescencia es que ninguna luz de excitación es necesario. Como resultado, no hay fondo autofluorescencia. En las imágenes de quimioluminiscencia, la energía de excitación en su lugar se genera químicamente. Este proceso no produce señal de fondo no deseada y por lo tanto puede dar lugar a mayores relaciones de señal a ruido. Esto podría resultar en última instancia, la detección más precisa y exacta de los márgenes quirúrgicos. Sorprendentemente, la utilidad de este enfoque como una técnica de imagen intraoperatoria ha permanecido inexplorado 10. De hecho, el ejemplo más cercano a esta técnica es la oxidación del luminol por la mieloperoxidasa en ratones 11, 12, 13. Por lo tanto, las imágenes biomédicas quimioluminiscente es una zona bastante inexplorada de la investigación que podría ofrecer las siguientes ventajas: (1) autofluorescencia mínima que resulta en una señal de fondo baja con hiGher relaciones de señal a ruido; (2) longitudes de onda sintonizables de las emisiones de quimioluminiscencia que van desde lo visible a lo infrarrojo cercano; y (3) los complejos de quimioluminiscencia funcionalizables que, cuando se combina con las tecnologías de engarce y biomoléculas que ya existen dirigido, proporcionan acceso a bibliotecas enteras de sondas de imagen moleculares específicos 14. Este estudio de prueba de principio ilustra la utilidad potencial de las imágenes quimioluminiscente en el entorno biomédico utilizando un agente de formación de imágenes basado en rutenio. Las propiedades de este compuesto quimioluminiscente están bien estudiados, con las investigaciones que se remontan a mediados de la década de 1960 15. Tras la activación química, el agente produce la luz en torno a 600 nm 16, que es muy adecuado para los propósitos de imágenes médicas. La energía de activación se proporciona por una reacción redox que conduce a un estado excitado, que tiene una duración de 650 ns en agua 17 -folladeudado por la generación de fotones sobre la relajación de este estado excitado. A través del uso de un nebulizador a distancia especialmente diseñado, hemos sido capaces de detectar el compuesto tanto ex vivo como in vivo. Los resultados de los experimentos iniciales son muy prometedores, lo que sugiere una mayor investigación de esta tecnología.

<table><tbody><tr><td>Pieza de madera A (12,5 y veces; 2,5 y veces; 1,8 cm)</td><td>&nbsp; 131404 de carpintería</td><td></td><td>Corte de una hoja de madera contrachapada de abedul de 3/4" x 24" x 30" Pieza de</td></tr><tr><td>madera B (12.7 veces; 10.7 veces; 1.8 cm)</td><td>131404</td> <td>de carpintería</td><td>Corte de una hoja de madera contrachapada de abedul de 3/4" x 24" x 30"</td></tr><tr><td>Pieza de madera C (11 veces; 2.5 veces; 1.8 cm)</td><td>131404 de carpintería</td><td></td><td>Corte de 3/4" x 24" x 30 cm rdquo; Hoja de madera contrachapada de abedul</td></tr><tr><td>Tornillos (4 y veces; 25 mm)</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values Mini rociador de 3 oz</td> Varilla de acero inoxidable <td>Bed, Bath and Beyond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 cm de acero de 1/16")</td><td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Pencil Classic HB</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>Clip</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>cable de altavoz</td><td>RCA Inc.</td><td></td><td></td>AH1650SN</tr><tr><td>Pila alcalina Energizer 9V</td><td>Energizer Holdings Inc.</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, par de salida de 3.4 kg / cm @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo Comentarios</td><td></td></tr><tr><td>Bridas de plástico de 28 cm</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1 cable</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 cable</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 potencia</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 power</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 interruptor de palanca</td><td>littleBits Inc.</td>Interruptor <td></td><td>de palanca i2</td></tr><tr><td>littleBits 011 servo</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 servo</td><td></td></tr><tr><td>20 cm bridas de alambre recubiertas</td><td>de plástico Four Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2&prime;-bipiridyl)diclororutenio(II) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 224758 <tr><td>Nitrato de cemonio (IV)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>Baxter Healthcare</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td>El agua se purificó utilizando un Milipore Mili-Q (R&ge; 18 M&Omega;)</td></tr><tr><td>Ratones hembra desnudos (endogámicos)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>1929</td><td>edad 5 - 6 semanas</td></tr><tr><td>Cepa C57BL/6J&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones machos NU/J at&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>edad 6 &ndash; 8 semanas</td></tr><tr><td>Lector de bioluminiscencia IVIS 200</td><td>Caliper Live Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Image 4.2 software</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

una nueva técnica para generar y observación de quimioluminiscencia en un contexto biológico

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Las técnicas de imagen intraoperatoria tienen el potencial de hacer que las intervenciones quirúrgicas sean más seguras y efectivas; por estas razones, dichas técnicas se están trasladando rápidamente al quirófano. Aquí, presentamos un nuevo enfoque que utiliza una técnica aún no explorada para la imagen intraoperatoria: la imagen quimioluminiscente. Este método emplea un reportero quimioluminiscente a base de rutenio junto con un sistema de nebulización hecho a medida para producir imágenes ex vivo o in vivo con altas relaciones señal-ruido. El reportero a base de rutenio produce luz después de la exposición a una solución oxidante acuosa y la rereducción dentro del tejido circundante. Este método nos ha permitido detectar concentraciones reporteras tan bajas como 6,9 pmol/cm2. En este trabajo, presentamos una guía visual de nuestros estudios in vivo de prueba de concepto que involucran inyecciones subdérmicas e intravenosas en ratones. Los resultados sugieren que esta tecnología es una candidata prometedora para futuras investigaciones preclínicas y, en última instancia, podría convertirse en una herramienta útil en el quirófano.

El sistema nebulizador se describe en la sección de protocolo 1 puede construirse a partir de materiales fácilmente disponibles a un bajo costo. Se tiene la intención de ser una inserción para-remoto activado pulverización del agente reductor / oxidante dentro de un lector de bioluminiscencia (Figura 1). Nuestro diseño permite la operación segura del nebulizador en el lector de bioluminiscencia a una distancia de 14 cm desde el objetivo. No se observó ningún empañamiento...

Este protocolo describe una nueva técnica de imagen intraoperatoria que utiliza un complejo de rutenio como fuente de emisión de luz quimioluminiscente, produciendo así altas relaciones señal-ruido durante la obtención de imágenes in vivo. Las imágenes intraoperatorias son un campo en expansión que podría revolucionar la forma en que se realizan los procedimientos quirúrgicos.

Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

El objetivo general de este protocolo es ofrecer una nueva técnica de imagen preclínica, interoperatoria y quimioluminiscente que pueda proporcionar beneficios sobre las técnicas ópticas existentes en términos de relaciones señal-ruido y límites de detección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave que no han sido accesibles mediante las técnicas tradicionales de imagen óptica en muchos campos relacionados con las ciencias biológicas. Las principales ventajas de esta técnica son que tiene una alta relación señal-ruido y que no requiere luz ni radiación instantáneas.Entonces, lo que descubrimos es que las implicaciones de esta técnica realmente se extienden hacia la obtención de imágenes interoperatorias de múltiples estados de enfermedad, incluido el cáncer, debido a las altas relaciones señal-ruido que esta técnica tiene para ofrecer. Como la luz incidente no es necesaria para esta técnica, no hay problemas con la absorción de la luz incidente. Además, hay una gran caja de herramientas químicas disponible para funcionalizar la molécula central quimioluminiscente.Para comenzar el procedimiento, prepare 100 soluciones estándar de microlitros de cloruro de tris (bypiridina) rutenio (II) en agua de ósmosis inversa. Luego, combine cada patrón con 100 microlitros de una solución de 25 milimolares de nitrato de cerio y amonio en agua de ósmosis inversa en un portaobjetos de microscopio. Abra el software de imágenes del lector de bioluminiscencia y haga clic en inicializar.En el modo de imagen, asegúrese de que luminiscente y fotografía estén marcados y que fluorescente esté desmarcado. Ajuste el tiempo de exposición luminiscente, el binning, el f/stop y los parámetros del filtro de emisión. Ajuste el tiempo de exposición de la fotografía, el binning y los parámetros f/stop.A continuación, ajuste la altura del sujeto de acuerdo con la muestra que se va a fotografiar. Establezca el campo de visión en B para una distancia de 14 centímetros entre la cámara y la etapa de muestra. Cubra el suelo de la cámara de imágenes del lector de bioluminiscencia en la etapa de muestra con cartulina negra.A continuación, coloque la primera diapositiva con la gota de mezcla estándar en la platina de muestra con la gota centrada en el punto de mira de la caja de luz verde. A continuación, llene la botella rociadora de tres onzas de un nebulizador hecho a medida con la solución 1:3 de trietilamina en una solución 50/50 de agua y etanol. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el tubo de aspiración.Coloque el conjunto del nebulizador en la cámara de imágenes con la boquilla de pulverización apuntando hacia la gota que se va a fotografiar sin obstruir la vista de la cámara de la gota. Asegúrese de que el interruptor de encendido del nebulizador y el indicador de encendido estén encendidos, que el interruptor de palanca magnético esté apagado y que los cables del nebulizador de potencia y del control remoto no estén enredados. Cubra los puntos calientes, como las marcas en el portaobjetos, con pequeños trozos de cartulina negra.Coloque al menos 40 centímetros del cable remoto del nebulizador en la cámara de imágenes. Cierre suavemente la puerta de la cámara sin engarzar los cables del nebulizador. En el software del instrumento, haga clic en adquirir, habilite el guardado automático y establezca la ruta del archivo de datos.Inicie la secuencia de imágenes. Cuando el obturador se abra con un clic audible, cambie la palanca del nebulizador tres veces para rociar tres ráfagas de solución de trietilamina sobre la muestra. Repita el procedimiento con cada portaobjetos estándar para determinar la concentración mínima detectable del agente de imagen de rutenio.Para comenzar el procedimiento de imagen in vivo, prepare 100 microlitros de una solución que contenga entre 8 y 33 nanomoles de cloruro de tris(bypiridina)rutenio(II) en solución salina tamponada con fosfato. Prepare una solución acuosa de 25 milimolares de nitrato de cerio amonical. A continuación, inyecte por vía intravenosa 100 microlitros del agente de imagen de rutenio en la vena de la cola de ratones sanos.Sacrificar a los ratones 10 minutos después de la inyección por asfixia con dióxido de carbono. Retire la piel del torso con un corte en Y y luego retire el arco costal para exponer el corazón y los pulmones. Corta una salida en la aurícula derecha e inyecta 20 mililitros de PBS a través de una aguja de calibre 24 en el ventrículo izquierdo.Corta a través de la piel del abdomen para exponer el riñón y el hígado. Si el órgano de interés es el hígado, el riñón o el bazo, haga un corte longitudinal visible a través del órgano. Prepare una nueva secuencia de imágenes en el software del lector bioluminiscente.Para obtener imágenes de todo el abdomen, coloque el ratón en la cámara de imágenes con el abdomen abierto mirando hacia la cámara y la cabeza apuntando hacia la parte posterior del instrumento. Centre el órgano de interés en la cruz de la caja de luz verde. Lave a fondo la botella rociadora y la boquilla del conjunto del nebulizador y luego llene la botella con la solución de nitrato de cerio y amonio.Coloque el nebulizador en la cámara de imágenes con la boquilla de pulverización dirigida al sitio de la imagen. Asegúrese de que la cámara no esté obstruida, que los cables no estén enredados y que haya al menos 40 centímetros del cable remoto en la cámara. Cierre la cámara e inicie la secuencia de imágenes.A medida que el obturador se abre con un clic, cambie la palanca tres veces para rociar tres ráfagas del agente oxidante en el sitio de la imagen. Después de la toma de imágenes, retire el conjunto del nebulizador y enjuague bien la boquilla de pulverización para evitar la cristalización del nitrato de cerio y amonio. Para la posterior obtención de imágenes y cuantificación de órganos individuales, retire el ratón del instrumento y extirpe los órganos internos a partir de la cavidad corporal abierta.Cortar la piel de la pata trasera para extirpar muestras de tejido muscular. Si el órgano de interés es el hígado, el riñón o el bazo, corte el órgano por la mitad longitudinalmente. A continuación, coloque el órgano en una placa de Petri o en un trozo de cartulina negra.Visualice cada órgano de la misma manera que el animal entero, enjuagando la boquilla rociadora después de cada secuencia. En este procedimiento, se inyectó a los ratones un agente de imagen a base de rutenio y se roció el tejido de interés con un oxidante para inducir la quimioluminiscencia. Se determinó que la concentración mínima detectable del agente de imagen fue de 6,9 picomoles por centímetro cuadrado en estas condiciones.Quimioluminiscencia en luz blanca Las imágenes de los órganos de interés se obtuvieron con un lector de bioluminiscencia. La señal de quimioluminiscencia se observó predominantemente en los riñones después de la inyección intravenosa, lo que indica la eliminación renal del catión hidrofílico tris(bypiridina)rutenio(II). La relación señal-ruido del agente de imagen frente al PBS solo fue de 27:1 en los riñones y de 21:1 en el hígado.Los ganglios linfáticos poplíteos de ratón también se evaluaron con una inyección subcutánea de una solución más concentrada del agente de imagen a base de rutenio. Los ganglios linfáticos que contenían el agente de imagen mostraron un resplandor significativamente mayor que los ganglios linfáticos que contenían PBS solo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar excluir la luz ambiental y evitar la contaminación con rutenio tris bpy. Tras su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la imagen biomolecular exploren estados patológicos como el cáncer en ratones. Aunque este método puede proporcionar información sobre cuestiones a las que no se podía acceder mediante las técnicas tradicionales de imágenes ópticas, cualquier cuestión que pueda investigarse con técnicas tradicionales puede abordarse con quimioluminiscencia.

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