Name: Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a evaluar conformaciones selectivas de GPCR usando sensores FRET modulares en células vivas. Este método permite estudiar interacciones con diferentes efectores y el impacto de fármacos en la señalización celular.

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RUM fue financiado por la beca de la Asociación Americana del Corazón Pre-doctoral (14PRE18560010). La investigación fue financiada por la subvención Asociación Americana del Corazón Desarrollo Científico (13SDG14270009) y el NIH (1DP2 CA186752-01 y 1-R01-GM-105646-01-A1) para SS

1. Preparación de ADN <ol><li> Diseño sensor construye utilizando un esquema de clonación modular. Por favor hacer referencia al diseño del sensor β 2-AR 1 se ha detallado anteriormente. </li><li> Preparar ADN de acuerdo con el protocolo miniprep kit comercial y eluir en solución 2 mM Tris-HCl, pH 8, a la concentración ≥ 750 ng / l, A260 / A280 de 1.7 a 1.9, A260 / 230 de 2,0 - de 2.29. </li></ol> 2. Preparación de cultivos celulares <ol><li> Cultura HEK-293T-Flp-n células en DMEM que contenía 4,5 g / L de D-glucosa, suplementado con 10% de FBS (inactivado por calor) (v / v), 1% de suplemento de L-glutamina, HEPES 20 mM, pH 7,5 a 37 ° C en atmósfera humidificada a 5% de CO 2. Manejar las células en una campana de seguridad biológica para las etapas posteriores. </li><li> Permiten que las células crezcan a una monocapa confluente antes de pases en placas de seis pocillos. Tiempo para alcanzar una confluencia depende de la densidad inicial de chapado. Use platos quellegado hasta la confluencia en 1 - 2 días de chapado de seis pocillos chapado. Un plato tratada con cultivo confluente 10 cm de tejido tiene una densidad celular de aproximadamente 4 x 10 6 células / ml. Véase la Figura 1 para una imagen de crecimiento del cultivo celular. </li><li> Lavar las células con 10 ml de PBS, y trypsinize con 0,25% de tripsina (véase el debate, el párrafo 2). Placa de 8 x 10 5 células / pocillo en 2 ml de medio de cultivo de tejidos tratados con seis platos bien y dejar que se adhieran durante 16 - 20 En hr. </li></ol> 3. Condiciones de transfección <ol><li> Escalonar las transfecciones para las construcciones que pueden requerir diferentes cantidades de tiempo para lograr una expresión óptima (entre 20 - 36 hr). Sincronizar condiciones para un tiempo de experimento unificado. También tienen un control no transfectadas bien en la densidad de células equivalente a utilizar para el ruido de fondo y la resta de dispersión durante el análisis. </li><li> Llevar los reactivos de transfección a temperatura ambiente: medio de suero reducido, el ADN, reactivo de transfección. </li><li> En uncampana de seguridad biológica se combinan los reactivos en un tubo estéril de microcentrífuga en el siguiente orden: mezclar 2 g de ADN con 100 l de suero reducido de medios de comunicación. Pico 6 l de reactivo de transfección en combinación de medios / DNA sin la superficie de la mezcla o en el lado del tubo de tocar. Configurar una reacción de transfección por pocillo. condiciones de transfección pueden ser optimizados (1 - 4 g de ADN, 3 - 6 l de reactivo de transfección) para lograr los niveles de expresión consistentes. Véase la Tabla 1 para relaciones más optimizadas. </li><li> Se incuba la mezcla a temperatura ambiente en una campana de seguridad biológica de 15 - 30 min. No utilice la reacción si se deja incubar durante más de 30 minutos. </li><li> Añadir reacción a las células de una manera gota a gota a través de bien y agitar suavemente seis pocillos para asegurar una buena mezcla. Añadir una reacción por pocillo. </li><li> Después de 20 h de expresión, la fluorescencia monitor mediante microscopio de fluorescencia de cultivo de tejidos. Evaluar la expresión de la población con 10 veces la localización objetivo y proteínas en una célula a 40X. Observe para la expresión de proteínas en la membrana plasmática (PM). Si se observa la internalización sustancial, supervisar la transfección hasta que se detecta expresión significativa en AM. </li></ol> 4. Reactivo y la Preparación de <ol><li> Preparar 100 mM existencias de medicamentos y almacenar a -80 ° C: bitartrato de isoproterenol (100 mM en dH 2 O que contiene ácido ascórbico 300 mM). Hacer en hielo / en la cámara fría, y el flash-congelar inmediatamente. Las alícuotas se pueden hacer y utilizar hasta un año. </li><li> Preparar Cell Buffer (~ 2 ml / condición) y guardar en un baño de agua a 37 °. Hacer de nuevo cada día. Consulte la Tabla 2 para celulares constituyentes de amortiguamiento. </li><li> Preparar tampón de Drogas (10 ml) y almacenar a temperatura ambiente. Consulte la Tabla 2 para los componentes de amortiguación de Drogas. </li><li> Lavado ácido cubetas utilizando HCl concentrado. Neutralizar con una base débil (1 M KOH), y lavar bien las cubetas con dH2O </li><li> Preparar la estación de trabajo en torno a fluorómetro con varioscajas de 10, 200 y 1.000 l puntas de pipeta, un contador de tiempo establecido con una cuenta atrás de 10 minutos, una línea de vacío accesible con consejos para la limpieza de cubetas, toallitas tarea delicada, y la botella con atomizador con H2O ultrapura </li><li> Calentar baño de agua externa para el fluorómetro y el calor del bloque de 37 ° C. </li><li> Activar el fluorómetro; establecer programa de recolección de fluorescencia para la recogida de PPC a la excitación 430 nm, paso de banda 8 nm; rango de emisión de 450 nm - 600 nm, paso de banda de 4 nm. Para la recolección de YFP sólo como control del sensor (ver Discusión) conjunto de excitación a 490 nm, paso de banda 8 nm, rango de emisión 500 - 600 nm, paso de banda de 4 nm. configuración de la colección de la PPC se usarán para adquirir un espectro FRET en este experimento. </li><li> Coloque doce 1,5 ml tubos de microcentrífuga en el bloque de calor, como se muestra en la Figura 2 a continuación. Estos tubos son soportes para tubos de alícuotas de células (500 l tubos de microcentrífuga.) Coloque un pequeño trozo de tejido en soportes 1 y 7 para amortiguar las cubetas colocado aquí. Nota: Use cubetas separadas para la condición sin tratamiento y la condición del medicamento para prevenir la contaminación cruzada. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Figura 2. Tubo Microcentrífuga configurar y posición de referencia en el bloque de calor de la cubeta de muestras sin tratar está en la posición 1.; tubos de alícuotas de células se encuentran en las posiciones 2 - 6. Cubeta para las muestras tratadas con fármaco se encuentra en la posición 7; tubos de alícuotas de células se encuentran en las posiciones 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="9"><li> Llenar los titulares de 2 - 6 y 8 - 12 con ~ 750 l de agua para crear un mini 37 ° C baño de agua. </li><li> Coloque diez tubos de microcentrífuga de 500 l de alícuotas de células en baños de mini-agua (titulares de 2 - 6, 8 - 12). Cada tubo será una repetición individual de la condición (5 untreated, 5 droga tratada). </li><li> Monitor de células para la expresión (véase el paso 3.6). </li></ol> 5. Experimento y terminales de datos <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema experimental. Una guía detallada paso a paso para el montaje experimental y ejecución. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Consulte la Figura 3 para esquemática experimental. Cuando las células están listas para ser cosechadas, basado en la expresión de proteína detectada con microscopio de fluorescencia (véase la discusión en el párrafo 4): en la campana de seguridad biológica, retire con cuidado ~ 1 ml de medios de comunicación, suspender las células en su cultura con un P1,000 y la transferencia de resuspensión en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nota: Evitar el uso de tripsina, ya que puede digerir el extremo N-terminal y /o en el bolsillo del sensor de GPCR de enlace. </li><li> Recuento de células para asegurar la densidad celular adecuada en la resuspensión. Optimizar el volumen de resuspensión de 4 x 10 6 células / ml. </li><li> Girar las células en la centrifugadora de cubeta oscilante a temperatura ambiente, 290 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación. </li><li> Resuspender suavemente las células en 1 ml de tampón de la célula (almacenado a 37 ° C) y repetir el paso 5.3. Durante la segunda vuelta, se reúnen 100 mM de existencias de medicamentos alícuota de -80 ° C. Hacer una dilución 1: 100 en tampón de drogas por 1 mM de trabajo y mantener a temperatura ambiente. </li><li> Después de la segunda centrifugación, eliminar el sobrenadante y las células suavemente resuspender en 1 ml de Cell Buffer (4 x 10 6 células / ml). Medida OD 600 de la muestra en el espectrofotómetro utilizando 1 ml de células y 1 ml de Cell Buffer como blanco. Prescindir de células en una cubeta de plástico desechable y traslado de regreso a un tubo de microcentrífuga inmediatamente después de espectrofotometría. </li><li> Para un cel de control no transfectadasl espectro de condiciones, volver a suspender suavemente las células no transfectadas en 1 ml de tampón de la célula con P1,000 pipeta, añadir 90 l de células de cubeta y la adquisición de espectro de FRET a una excitación de 430 nm, paso de banda 8 nm, emisión a 450 - 600 nm, paso de banda de 4 nm. Recoge 3 - 5 espectros de repetición con frescos de 90 l de células. Guardar la acción de las células a 37 ° C entre las especificaciones, resuspender suavemente con P1,000 entre cada alícuota de la muestra, y enjuague cubeta con ultrapura H2O entre las muestras. </li><li> Para las condiciones experimentales, alícuotas de 90 l de células transfectadas a cada uno de los 500 tubos mu l en soportes 2 - 6, 8 - 12 en el bloque de calor. Resuspender reserva de células con una pipeta P1,000 entre cada alícuota. </li><li> Después se tomaron alícuotas de las células, añadir 10 l de tampón de drogas a los tubos 2 - 6 para ver estado las muestras no tratadas. </li><li> Comience experimento mediante la adición de 10 l de solución de fármaco 1 mM en el tubo 8, iniciar el temporizador de cuenta atrás de 10 min, y mezclar suavemente tubo con P200 pipeta. Cerrar el tubo y la de regreso al 37° C bloque de calor. </li><li> Inmediatamente recoger tubo 2, mezclar suavemente con P200 (utilizar una nueva punta), añadir 90 l de suspensión de células sin tratar a condición de cubeta, y el lugar en el fluorómetro. </li><li> Adquirir espectro de FRET a una excitación de 430 nm, paso de banda 8 nm, emisión a 450 - 600 nm, paso de banda de 4 nm. </li><li> A las 9 min - 10 seg, spike tubo 9 con 10 l de solución de fármaco 1 mM, mezclar suavemente con una P200 (utilizar la nueva punta), y el tubo para calentar el bloque de retorno. </li><li> Repita los pasos 5.10 a 5.11 con el tubo 3 y 5.12 con el tubo 10. </li><li> Repita los pasos 5.10 a 5.13 a intervalos de 1 min (08:10, 07:10, etc.) hasta que los espectros se recogen para todas las condiciones de las muestras sin tratar, y el fármaco ha sido añadido a todas las muestras de condición de drogas. Utilice una punta nueva para cada paso de la pipeta para evitar la contaminación cruzada. </li><li> A los 5 minutos - 10 segundos, comenzar a mezclar tubo 8 (condición de drogas) suavemente con una pipeta P200, añadir 90 l de suspensión celular a cubeta separada para la muestra tratada de drogas y el lugar en el fluorómetro. </li><li> adquirir Fespectro RET (véase el paso 5.11 para los ajustes). </li><li> Repita los pasos 5.15 a 5.16 a intervalos de 1 min (04:10, 03:10, etc.) para las muestras restantes condición de drogas (tubos 9 - 12). </li><li> Después de que termine el experimento, guardar archivos de proyecto, lavar bien las cubetas con H2O ultrapura, y volver a llenar los tubos para el próximo estado. Tenga cuidado para evitar la contaminación cruzada en la etapa de lavado. Cambiar la punta de la botella de H2O, así como en la línea de vacío en cada lavado. </li></ol> Análisis 6. Datos <ol><li> Guarda y archivos de datos de exportación en SPC formato que se utilizará para el análisis. programas de análisis están disponibles para su descarga desde el sitio web de la publicación Sivaramakrishnan laboratorio. </li><li> Crear archivos de ruta de software de análisis que incluyen los programas de análisis (v9, v15), archivos de muestras no transfectadas (véase el paso 5.6 para la recogida de espectro celular sin transfectar), el archivo de datos de salida, y los valores separados por comas (CSV) para la entrada de datos. </li><li> Introduzca siguiente informaciónen un archivo CSV (ver ejemplo en la Tabla 3) y designar condiciones respectivas de cada muestra, incluyendo: Nombre de archivo - archivos de gráficos individuales SPC Receptor - designado que construyen GPCR se puso a prueba (por ejemplo, Β2) Binder - designado la cual se probó variante de péptido de la construcción (por ejemplo, S) Agonist - designar sin tratar (N) o condiciones tratados con el fármaco (D) Directorio - la carpeta de la ruta en la que se guardan los archivos de SPC, por lo general organizados por fecha OD - registró la densidad óptica de la muestra del espectrofotómetro </li><li> Introduzca los nombres de archivo para las muestras no transfectadas (paso 5.6) para restar de amortiguación de ruido y la dispersión de las muestras. </li><li> Introduce las condiciones en el programa de análisis. </li><li> Ejecutar programas para analizar las muestras dentro de las condiciones individuales (v9) ya través de condiciones (v15). </li><li> Excluir archivos de ejemplo que son valores atípicos aparentes en el conjunto de datos, o ajustar para la resta, aumentando o disminuyendo el valor de la DO del indiviarchivos duales. </li><li> Exportar datos a archivo de salida para el acceso a FRET calculado ratios (525 nm / 475 nm). </li><li> Calcula ΔFRET restando el cociente medio de FRET para la condición no se trata de las relaciones de FRET individuales para las condiciones tratadas (drogas). </li></ol>

<ol><li>Malik, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G+Protein-selective+G+Protein-coupled+Receptor+%28GPCR%29+Conformations+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells.</a> J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).</li>
<li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Alexander, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+analysis+of+the+rhodopsin-G-protein+complex+links+the+%CE%B15+helix+to+GDP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gi%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Conklin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyl-Terminal+Mutations+of+Gq%CE%B1+and+Gs%CE%B1+That+Alter+the+Fidelity+of+Receptor+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation.</a> Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).</li>
<li>Onaran, H. O., Costa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+have+all+the+active+receptor+states+gone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Where have all the active receptor states gone.</a> Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fbioluminescence+resonance+energy+transfer+techniques+to+study+G-protein-coupled+receptor+activation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling.</a> Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).</li>
<li>Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+millisecond+activation+switch+of+G+protein-coupled+receptors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Stumpf, A. D., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probes+based+on+G+protein-coupled+receptors+-+added+work+or+added+value%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value.</a> Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).</li>
<li>Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+control+of+protein+interaction+using+a+modular+ER%2FK+%CE%B1-helix+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

El rango dinámico ajustado de las mediciones de FRET en este sistema refuerza la necesidad de control de calidad sensibles en cada paso de este protocolo. Los pasos más importantes para garantizar un experimento exitoso de FRET son: 1) el cultivo de células, 2) la transfección 3) expresión de la proteína y 4) oportuna, precisa coordinación durante la ejecución del ensayo. la salud celular y el mantenimiento de la calidad / placas pueden tener un impacto significativo en la relación señal a r...

receptores acoplados a proteína G (GPCR) son receptores de siete transmembrana. El genoma humano solo contiene aproximadamente 800 genes que codifican para GPCRs, que se activan por una variedad de ligandos, incluyendo la luz, odorantes, hormonas, péptidos, fármacos y otras moléculas pequeñas. Casi el 30% de todos los productos farmacéuticos actualmente en el mercado de los GPCR diana, ya que juegan un papel importante en muchos estados de enfermedad 2. A pesar de décadas de un amplio trabajo realizado en esta familia de receptores, aún quedan cuestiones pendientes importantes en el campo, sobre todo en lo que respecta a los mecanismos moleculares que conducen a interacciones GPCR-efectoras. Hasta la fecha, sólo una estructura cristalina de alta resolución ha sido publicada, proporcionando información sobre la interacción entre la β 2-adrenérgicos (β 2-AR) y la proteína Gs 3. Junto con una amplia investigación en las últimas tres décadas, se reitera un componente estructural específico que es fundamental en esteinteracción: la subunidad Gα C-terminal. Esta estructura es importante tanto para la activación de la proteína G por el GPCR 4 y G selección proteína 5-6. Por lo tanto, la Gα C-terminal proporciona un vínculo crucial entre la estimulación del ligando GPCR y activación de la proteína G selectiva. Las investigaciones realizadas durante la última década sugiere que los GPCR pueblan un amplio paisaje conformacional, con el ligando de unión a la estabilización de los subconjuntos de conformaciones GPCR. Aunque varias técnicas, incluyendo la cristalografía, RMN y espectroscopía de fluorescencia, y espectrometría de masas están disponibles para examinar el paisaje conformacional GPCR, hay una escasez de enfoques para dilucidar su significado funcional en la selección del efector 7. A continuación, se describe un enfoque basado en Fӧrster transferencia de energía de resonancia (FRET) para detectar la proteína G-selectiva conformaciones GPCR. FRET se basa en la proximidad y la orientación paralela de dos fluoróforos con la superposición de emisión (donante) unand excitación (aceptor) espectros 8. Como los fluoróforos donante y aceptor se acercan juntos como resultado de cualquiera de cambio conformacional en la proteína o una interacción proteína-proteína, la FRET entre ellos aumenta, y se puede medir usando una gama de métodos 8. Biosensores basados ​​en FRET se han empleado ampliamente en el campo de GPCR 9. Se han utilizado para investigar los cambios de conformación en el GPCR mediante la inserción de donante y aceptor en el tercer bucle intracelular y GPCR C-terminal; sensores han sido diseñados para sondear GPCR y las interacciones efectoras mediante el etiquetado por separado el GPCR y el efector (G proteína subunidades / arrestins) con un par FRET 10; algunos sensores también detectan cambios conformacionales en la proteína G 11. Estos biosensores han permitido el campo para hacer una multitud de cuestiones pendientes, incluyendo cambios conformacionales en el GPCR y efector, la cinética de interacción GPCR-efectoras, y ligandos alostéricos 12. Nuestro grupoestaba particularmente interesado en la creación de un biosensor que puede detectar la proteína G específica conformaciones GPCR en condiciones agonistas impulsada. Este biosensor se basa en una tecnología desarrollada recientemente nombrado ESPASMO (sistemática afinidad de la proteína de modulación de fuerza) 13. ESPASMO implica la inmovilización interactuando dominios de la proteína utilizando un enlazador / ER K, que controla sus concentraciones eficaces. Flanqueando el enlazador con un par de FRET de fluoróforos crea una herramienta que puede reportar el estado de la interacción entre las proteínas 12. Anteriormente 1 del módulo ESPASMO se utilizó para atar el Gα C-terminal a un GPCR y controlar sus interacciones con fluoróforos FRET, mCitrine (se hace referencia en el presente Protocolo mediante su variante conocida, Amarillo Proteína Fluorescente (YFP), excitación / pico de emisión en 490/525 nm) y mCerulean (denominado en el presente Protocolo mediante su variante conocida comúnmente cian proteína fluorescente (PPC), de excitación / emisión de 430/475 nm pico). De N- a C-terminal, tsu codificado genéticamente único polipéptido contiene: una longitud total GPCR, aceptor de FRET (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K enlazador, donante de FRET (mCerulean / CFP), y el péptido Gα C-terminal. En este estudio, los sensores se abrevian como péptido GPCR-enlazador-longitud Gα. Todos los componentes están separados por un no estructurada (Gly-Ser-Gly) 4 enlazador que permite la rotación libre de cada dominio. La caracterización detallada de este tipo de sensores se realizó previamente utilizando dos GPCRs prototípicos: β 2-AR y opsina 1. Este sensor se transfecta transitoriamente en células HEK-293T y experimentos de células en vivo espectros de fluorescencia medida a base de fluorómetro del par FRET en unidades arbitrarias de cuentas por segundo (CPS) en presencia o ausencia de ligando. Estas mediciones se utilizan para calcular una relación de FRET entre los fluoróforos (YFP max / CFP max). Un cambio en FRET (ΔFRET), entonces se calcula restando la relación media de FRETde las muestras sin tratar de la relación de FRET de muestras tratadas con ligando. ΔFRET puede ser comparado a través de construcciones (β 2-AR-10 nm péptido-Gαs frente ß 2-AR-10-nm sin péptido). A continuación, detallamos el protocolo para expresar estos sensores en células HEK-293T en vivo, supervisamos su expresión, y la configuración, ejecución y análisis de la célula viva basada en FRET fluorómetro medida para no tratada en comparación con las condiciones tratados con el fármaco. Mientras que este protocolo es específico para la nm-Gαs sensor péptido β 2-AR-10 tratadas con 100 mM de bitartrato de isoproterenol, que puede ser optimizado para diferentes pares y ligandos GPCR-Gα.

<table><tbody><tr><td>B2-AR-10 nm-Sensor de péptidos gaseosos</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr> <tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Elute en 2 mM Tampón de elución Tris</td></tr><tr><td>Células HEK-293T-Flp-n</td><td>Life Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- alta glucosa</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Warm in&nbsp; 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>FBS, certificado, Calor inactivado, origen en EE. UU.</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medios de suero reducidos; Llevar a RT antes de usar</td></tr><tr><td>XtremeGene HP transfection reagenet</td><td>Roche 6366236001</td><td></td><td>Muy recomendable por su consistencia. Llevar a RT antes de usar</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>Úselo con el software FluorEssence V3.8</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo de 3 mm de longitud de paso</td><td>Starna NC9729944</td><td>(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Puede requerir un soporte/adaptador de cubeta para usar en el fluorómetro, disponible en Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Bomba de baño de agua circulante calentada</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Cálido hasta 37 grados; C antes de usar</td></tr><tr><td>Thermomixer Heat Block</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Warm to 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Agua ultrapura libre de ADN/ARNasa</td><td>Life Technologies</td><td>10977015</td><td>uso en RT</td></tr><tr><td>D(+)-glucosa, anhidra</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina de pulmón bovino</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>hemisulfato de leupeptina</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico, grado reactivo</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- isoproterenol (+)-bitartrato</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Utilice alícuotas frescas en cada experimento</td></tr></tbody></table>

conformaciones gpcr proteína g-selectivos mide usando sensores fret en un fluorómetro ensayo de suspensión de células vivas

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Fӧrster transferencia de energía de resonancia (FRET) a base de los estudios se han vuelto cada vez más común en la investigación de la señalización de GPCR. Nuestro grupo de investigación ha desarrollado un sensor de FRET intra-molecular para detectar la interacción entre las subunidades y GPCRs en células vivas después de la estimulación agonista Gα. Aquí, nos detalle el protocolo para la detección de cambios en FRET entre la β 2-adrenérgicos y el péptido C-terminal Gαs por tratamiento con hidrocloruro de isoproterenol 100 mM tal como se caracteriza anteriormente 1. Nuestro sensor FRET es un único polipéptido que consiste en serie de un GPCR de longitud completa, un fluoróforo aceptor de FRET (mCitrine), una ER / K SPASM (afinidad de proteína sistemática modulación fuerza) enlazador, un fluoróforo donante FRET (mCerulean), y un Gα C péptido-terminal. Este protocolo de preparación detalle celular, condiciones de transfección, la configuración del equipo, la ejecución del ensayo y análisis de datos. Este diseño experimental detecta pequeña changes en FRET indicativo de interacciones proteína-proteína, y también puede ser utilizado para comparar la fuerza de la interacción a través de ligandos y parejas de proteínas GPCR-G. Para mejorar la relación señal-ruido en nuestras mediciones, este protocolo requiere una precisión aumentada en todas las etapas, y se presenta aquí para permitir la ejecución reproducible.

Un esquema generalizado de la experimentación y la ejecución se detalla en la Figura 3. Con el fin de detectar un cambio de FRET en el estrecho rango dinámico del sensor, que es fundamental para cumplir con los matices del sistema deben ser respetados. La calidad de la célula es imprescindible para la expresión de proteínas, así como la coherencia en la toma de muestras. La Figura 1 muestra imágenes de células cultivadas que crecen en una monocapa consistent...

Los métodos sencillos para detectar la activación selectiva de proteínas G por receptores acoplados a proteínas G siguen siendo un desafío pendiente en la señalización celular. Aquí, los biosensores de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster se han desarrollado mediante la unión por pares de un GPCR a péptidos de proteínas G para sondear los cambios conformacionales a concentraciones controladas en células vivas.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

El objetivo general de este ensayo basado en transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) en células vivas es evaluar las conformaciones del receptor acoplado a proteína G, o GPCR, selectivas para proteínas G bajo diferentes condiciones de agonista. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los GPCR sobre las interacciones de los GPCR con diferentes efectores y el efecto de distintas drogas sobre la conformación del receptor. La principal ventaja de esta técnica es que los sensores son modulares y pueden reingenierarse fácilmente para diferentes combinaciones de GPCR y péptidos de subunidades G alfa, incluyendo la subunidad completa y la subunidad G alfa.Aunque este método puede proporcionar información sobre la selección de proteínas G y la respuesta a diferentes ligandos, también puede aplicarse para explorar la consecuencia fisiológica de la activación diferencial de las proteínas G. Antes de comenzar el procedimiento, cultive las células de interés en medio completo a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con cinco por ciento de dióxido de carbono hasta que los cultivos alcancen confluencia.A continuación, desprenda las células con tripsina y pase los cultivos a ocho por diez a la quinta células por mililitro en dos mililitros de medio a placas de cultivo de tejidos tratadas de seis pocillos durante 16 a 20 horas de cultivo. Después de 16 a 20 horas, prepare una reacción de transfección por pocillo cuando las células se hayan adherido a las placas dentro de una cabina de seguridad biológica y permita que las mezclas de reactivos se equilibren durante 15 a 30 minutos. Al final de la incubación, añada una reacción a cada cultivo celular gota a gota sobre el pocillo.Agite suavemente la placa para asegurar una distribución completa del reactivo en todas las cultivos. Luego, regrese la placa al incubador de cultivo celular. Después de 20 horas, analice las cultivos para evaluar la expresión proteica en la membrana plasmática y determine la salud celular.Si se observa una internalización sustancial de la proteína, supervise la transfección hasta que se detecte una expresión significativa en la membrana plasmática. Evaluar el nivel de expresión proteica es imprescindible para un diseño experimental óptimo. Si las células se transfectaron deficientemente o la expresión proteica es demasiado baja, espere antes de recolectar las células.De lo contrario, la señal fluorescente podría ser inadecuada para el análisis. Cuando las células estén listas para ser recolectadas, transfiéralas al gabinete de seguridad biológica y retire suavemente un mililitro de medio. Utilizando una pipeta P1000, resuspenda las células en un mililitro de medio restante por pocillo y transfiera las suspensiones celulares a tubos individuales de microcentrifugado de 1,5 mililitros.Cuente las células y haga un pellet de las células por centrifugación. Retire el medio del pellet celular. Suspender suavemente el sobrenadante en un mililitro de tampón celular a 37 grados Celsius y repetir la centrifugación.Resuspenda el precipitado a una concentración de cuatro veces 10 a la sexta célula por mililitro en tampón celular fresco tras la segunda centrifugación. A continuación, agregue 90 microlitros de células control a una cubeta y obtenga el espectro de FRET control. Después de recopilar de tres a cinco espectros control repetidos con 90 microlitros frescos de células para cada medición, repita los pasos de suspensión, centrifugación y lavado para las células transfectadas.Aliquotar 90 microlitros de células transfectadas en cada tubo de 500 microlitros en los soportes del dos al seis y del ocho al 12 en un bloque térmico, resuspendiendo suavemente las células entre cada alícuota. Cuando todas las células hayan sido transferidas, añadir 10 microlitros de tampón de fármaco a los tubos del dos al seis para las muestras en condiciones no tratadas. Luego, añadir 10 microlitros de la solución de fármaco de un milimolar al tubo ocho.Inicie un temporizador para contar desde 10 minutos y utilice una pipeta P200 para mezclar suavemente el contenido del tubo. Cierre el tubo después de mezclar y devuélvalo al bloque de calor. Luego, tome inmediatamente el tubo dos.Mezcle su contenido suavemente con una punta nueva. Añada 90 microlitros de la suspensión de células transfectadas al cubeta en la condición no tratada y coloque la cubeta en el fluorómetro. Adquiera el espectro FRET de la muestra utilizando los mismos parámetros que para los espectros de control.A los nueve minutos y 10 segundos, agregue 10 microlitros de la solución de fármaco de un milimolar al tubo nueve. Mezcle suavemente el contenido del tubo y regrese el tubo al bloque de calor. Luego, tome inmediatamente el tubo tres y mezcle y mida el contenido de la cubeta como se acaba de demostrar con el tubo dos.A los cinco minutos y 10 segundos, mezcle suavemente el tubo ocho con una pipeta P200. Añada 90 microlitros de la suspensión celular a una cubeta separada para la medición de la muestra tratada con fármaco y adquiera el espectro FRET para la muestra en condiciones con fármaco. Una vez que se hayan adquirido todos los espectros, guarde los archivos del proyecto.Lave minuciosamente las cubetas con agua ultrapura y reponga los tubos para la siguiente condición. En esta imagen, se muestra una monocapa de cultivo celular homogénea que es óptima para el plaqueo en placas de seis pocillos y la transfección. Sin embargo, estas células que crecen en patrones agrupados que dan lugar a formas dendríticas no se recomiendan para un plaqueo consistente ni para un análisis preciso de la expresión proteica o mediciones de FRET.Las condiciones de transfección también se pueden optimizar para lograr una expresión reproducible. Una vez que se han recopilado y registrado todos los datos en un archivo CSV para su análisis, los resultados generados tendrán un aspecto similar a estos espectros representativos de FRET promedio en bruto y normalizados. Todos los espectros de FRET en bruto de este experimento representativo demuestran un rango de señal a ruido suave y suficiente, lo que permite un análisis de datos consistente con un pico mínimo de agua proveniente de la muestra.Cuando los datos se normalizan a 475 nanómetros, las cuentas por segundo de este valor se establecen en 1,0 y el cambio significativo en la lectura a 525 nanómetros entre las muestras tratadas y no tratadas se vuelve evidente. Si la expresión proteica es baja o existe una baja eficiencia de transfección o una baja densidad celular en la cubeta para la lectura de fluorescencia, los datos brutos pueden ser ruidosos, lo que genera problemas en la sustracción del fondo y en la normalización, dando como resultado espectros que no se alinean y que no pueden analizarse. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 25 minutos si se realiza correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser cuidadoso al manipular las células durante todas las etapas del experimento. Tras este procedimiento, la técnica puede ampliarse para probar diferentes sensores de receptores por FRET, diferentes fármacos y efectores, así como diferentes tipos celulares. Desde su desarrollo, esta técnica ha contribuido al campo de los RCPG, en el que estudios recientes que utilizan estos sensores han permitido comprender los mecanismos moleculares de selección de proteínas G.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar confirmaciones específicas de RCPG mediante un ensayo de medición con un constructo de FRET anclado en células vivas. No olvide que trabajar con cultivos celulares de mamífero y ciertas drogas experimentales puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células...

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.

Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos

Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.

Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.

Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

El protocolo presentado en este estudio ilustra la efectividad del Detector de Diferencia de AMPc In Situ  en la medición de AMPc a través de dos métodos. Un método utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos con celdas HEK-293. El otro método muestra células HASM individuales bajo un microscopio fluorescente.

Dinámica de cAMP en tiempo real en células vivas utilizando el detector de diferencia de cAMP fluorescente in situ

Este protocolo describe el uso de biosensores basados en BRET para la medición en tiempo real de la activación de la proteína G en células HEK293 vivas tras la estimulación del ligando del receptor acoplado a proteína G. Aquí, el receptor β2-adrenérgico y el receptor cannabinoide tipo 1 sirven como ejemplos para demostrar la eficiencia de los sensores para varios subtipos de proteína G y en varios GPCR.

Biosensores de proteína G basados en BRET para medir la actividad del receptor acoplado a proteína G en células vivas

Aprende a evaluar conformaciones selectivas de GPCR usando sensores FRET modulares en células vivas. Este método permite estudiar interacciones con diferentes efectores y el impacto de fármacos en la señalización celular.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

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