Método de la entrega directa segmentaria intra-hepática utilizando un modelo de hígado de rata hiliar abrazadera
2 de abril de 2017
Un modelo de abrazadera hiliar hígado de rata única fue desarrollado para estudiar el impacto de moléculas farmacológicas en la mejora de la lesión por isquemia-reperfusión. Este modelo incluye la canulación directa del suministro de portal al segmento de hígado isquémico a través de una rama de la vena porta, lo que permite la entrega hepática directa.
El objetivo general de este modelo único de pinza hiiar de hígado de rata es permitir el estudio del impacto de las moléculas farmacológicas de interés en la mejora de la lesión por isquemia-reperfusión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del trasplante de hígado sobre qué moléculas se pueden infundir directamente en el hígado para ayudar a mediar la lesión por isquemia-reperfusión. La principal ventaja de esta técnica es que la molécula de interés se inyecta directamente en la vena porta, reduciendo el volumen de distribución.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el trasplante de todos los órganos, ya que permite probar moléculas que podrían agregarse a las perfusiones de órganos para la reducción de la lesión por isquemia-reperfusión. La demostración visual de este método es fundamental debido al pequeño tamaño de la rama de la vena porta utilizada para la canulación. Comience confirmando el nivel apropiado de sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies, luego coloque a la rata en una almohadilla térmica bajo un microscopio de disección y sujete las extremidades.
A continuación, haga una incisión en la piel de la línea media del abdomen desde el pubis hasta el xifoides, seguida de una incisión similar en el peritoneo a lo largo de la línea alba. Entra en el abdomen, teniendo cuidado de no dañar la vejiga o el intestino, y libera el hígado del peritoneo anteriormente cerca de la apófisis xifoides. Haga una incisión transversal a través de la piel y el peritoneo en el borde inferior del lóbulo derecho del hígado, y use una pinza curva para mosquitos para retraer la apófisis xifoides.
Use retractores de costillas para abrir las costillas lo más lejos posible de la línea media y corte los ligamentos falciformes, frénicos y gástricos. Luego, use hisopos de algodón estériles humedecidos para voltear el hígado hacia arriba y cortar ligamentos adicionales según sea necesario para acceder al porta. Con una gasa humedecida con solución salina, rotar visceralmente el hígado y luego extirpar el tejido conectivo suelto que recubre el hilio portal y el tejido conectivo suelto que recubre la longitud de la vena porta.
Con fórceps, empuje a través del tejido conectivo suelto posterior a la vena porta izquierda, la arteria y el conducto biliar para hacer una ventana y rodear los vasos sin apretar con una sutura de Potts 4-0. A continuación, limpie el tejido conectivo suelto que recubre la rama posterior hasta la vena porta en el riñón derecho. A continuación, utilice una jeringa de insulina para extraer 0,5 mililitros de sangre de la vena cava inferior y transfiera la sangre a un pequeño vial.
Centrifugar la muestra y recoger el suero en un nuevo vial para congelarlo rápidamente en nitrógeno líquido. Corta dos pedazos de sutura 7-0. Coloque el primer bucle 7-0 alrededor de la vena porta izquierda lo más medial posible y use una pinza curva para mosquitos para retraer la vena.
Coloque un segundo bucle 7-0 atado sin apretar en la rama posterior a la vena porta cerca de su intersección con la vena porta. Ahora, cargue la bomba de infusión con una jeringa de cinco mililitros que contenga tres mililitros de reactivo en solución salina al 0,9% y cebe el tubo. Use una pinza microquirúrgica para agarrar la vena porta distal para reducir el sangrado durante la canulación, y use tijeras microquirúrgicas pequeñas para cortar un orificio de 0,5 milímetros en la vena entre la sutura de soporte 7-0 y su intersección con la vena porta.
Con un catéter 27-0, canula el sistema venoso portal izquierdo, insertando el catéter más allá de la bifurcación de las venas portas izquierda y derecha. Infundir un mililitro de solución salina normal para confirmar la colocación de la cánula y vigilar si los lóbulos lateral izquierdo y mediano del hígado se blanquean. Evalúe manualmente que el catéter haya pasado el despegue de la vena porta derecha, pero no más allá del despegue de la vena porta que alimenta el lóbulo mediano, luego ciña la sutura de Potts, asegure el catéter con la sutura 7-0 y retire la pinza de la vena porta distal.
Iniciar inmediatamente la infusión de dos mililitros del reactivo de interés durante un periodo de entrega de 15 minutos, con monitorización continua de las constantes vitales del animal durante toda la perfusión. Una hora después del inicio del tiempo isquémico, retire la sutura de Potts y el catéter, luego ciña la sutura 7-0 en la rama posterior a la vena porta. Dos horas después de comenzar la reperfusión, extraiga lentamente 0,5 mililitros de sangre de la vena cava inferior, seguido de una transferencia lenta de la sangre a un nuevo vial.
Aplique una presión suave para detener el sangrado de la vena según sea necesario. A continuación, centrifuga la sangre y congela la mitad del suero para su posterior procesamiento, como se acaba de demostrar. En el criterio de valoración experimental, haga una incisión en el diafragma en un círculo y corte cualquier tejido conectivo adicional que quede conectando el hígado con la cavidad peritoneal.
Recoja el hígado y obtenga cuatro muestras grandes de los lóbulos izquierdo y mediano, y cuatro muestras grandes del lóbulo derecho. A continuación, coloque las muestras en viales individuales etiquetados y congele los tejidos en nitrógeno líquido para su procesamiento posterior. La medición de la alanina aminotransferasa sérica en suero fisiológico normal y en animales pinzados hiliares con infusión de PEG-SOD demuestra una diferencia significativa entre los niveles de expresión de enzimas hepáticas en suero y en animales experimentales a los 120 minutos después de la reperfusión.
La expresión de malondialdehído tisular en el lóbulo clamp derecho, no hiliar, no muestra una diferencia significativa entre los grupos control y experimental. Sin embargo, el pinzamiento posthiliar izquierdo y el lóbulo de reperfusión muestran un nivel significativamente mayor de expresión de malondialdehído tisular en comparación con el lóbulo control no reperfundido y no infundido, así como con el lóbulo derecho con infusión de PEG-SOD. El mismo patrón también se observa para la expresión tisular de glutatión.
El análisis de Western blot indica un aumento del nivel de expresión de caspasa-3 escindida en el lóbulo izquierdo después del pinzamiento hiliar y la reperfusión que disminuye en los animales tratados con infusión de PEG-SOD, diferencias que se confirman significativas mediante densitometría. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en tres horas y 30 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar obtener una tracción sustancial en la rama de la vena porta para la canulación al colocar la pinza de la vena porta distal.
Una vez que se domina este procedimiento, se puede utilizar para explorar el impacto de una variedad de sustancias farmacológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo canular el sistema venoso portal izquierdo.
Descripción general
Este artículo presenta un modelo único de pinzamiento hiliar hepático en rata diseñado para estudiar los efectos de moléculas farmacológicas sobre la lesión por isquemia-reperfusión. El modelo permite la administración hepática directa de sustancias a través de la vena porta, facilitando investigaciones dirigidas en trasplante hepático.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Farmacología
- Trasplante de hígado
Antecedentes
- La lesión por isquemia-reperfusión es un problema crítico en el trasplante hepático.
- Comprender las intervenciones farmacológicas puede mejorar los resultados del trasplante.
- Los métodos de infusión directa pueden aumentar la eficacia de los agentes terapéuticos.
- La demostración visual de las técnicas quirúrgicas es esencial para la reproducibilidad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo para estudiar agentes farmacológicos en la lesión hepática por isquemia-reperfusión.
- Evaluar los efectos directos de las moléculas infundidas sobre la salud hepática.
- Proporcionar una metodología aplicable a otros escenarios de trasplante de órganos.
Métodos Utilizados
- Modelo de pinzamiento hiliar del hígado de rata con canulación de la vena porta.
- Infusión directa de agentes farmacológicos en la vena porta.
- Monitoreo de los signos vitales durante el proceso de infusión.
- Recolección y análisis de muestras de suero y tejido tras la reperfusión.
Resultados principales
- Diferencias significativas en los niveles séricos de alanina aminotransferasa tras el tratamiento.
- Aumento de la expresión de malondialdehído en los lóbulos hepáticos tratados.
- El análisis por inmunotransferencia mostró niveles alterados de caspasa-3 escindida.
- Se demostró el potencial de agentes farmacológicos para mitigar el daño.
Conclusiones
- El modelo de pinzamiento hiliar del hígado de rata es efectivo para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión.
- Las técnicas de infusión directa pueden mejorar la eficacia terapéutica.
- Los hallazgos podrían orientar estrategias futuras en el trasplante de órganos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de pinza hiliar en hígado de rata permite la administración dirigida de agentes farmacológicos a segmentos hepáticos isquémicos, reduciendo la exposición sistémica y mejorando la comprensión mecanicista de la lesión por isquemia-reperfusión. Al permitir la infusión directa en el sistema venoso portal, el método apoya la evaluación preclínica de compuestos citoprotectores con una relación señal-ruido mejorada en puntos finales específicos del tejido. Este enfoque ayuda a reducir los riesgos de los candidatos principales para el trasplante hepático y otras estrategias de perfusión orgánica, al aislar los efectos hepáticos de los factores de confusión sistémicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la administración directa de compuestos de prueba al lóbulo hepático isquémico, aclarando los mecanismos de acción específicos del blanco.
- Valor operativo: Reduce el volumen necesario del compuesto y minimiza los efectos fuera del blanco, mejorando la sensibilidad del ensayo y la especificidad del blanco.
- Valor traslacional: Facilita la validación del blanco en un modelo relevante de isquemia/reperfusión, aumentando la confianza en la relevancia fisiopatológica antes de avanzar a especies más grandes.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Genera lecturas bioquímicas cuantificables, como los niveles séricos de ALT y de MDA en tejido, lo que permite la selección estandarizada de compuestos con actividad hepatoprotectora.
- Reproducibilidad: El modelo quirúrgico proporciona patrones consistentes de lesión isquémica, favoreciendo evaluaciones confiables de respuesta a la dosis entre lotes experimentales.
- Escalabilidad: Una vez dominado, el procedimiento permite la realización repetida de pruebas con múltiples agentes farmacológicos de manera controlada y específica por segmento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Imita la isquemia clínica cálida durante la obtención de órganos y el trasplante, proporcionando un modelo predictivo para la lesión y disfunción del injerto.
- Reducción mecanicista de riesgos: Permite evaluar agentes antioxidantes y antiapoptóticos (por ejemplo, PEG-SOD) sobre marcadores clave de lesión como la caspasa-3 escindida y la peroxidación lipídica.
- Continuidad preclínica: Facilita la optimización de compuestos líderes al vincular la interacción con el objetivo en el hígado con resultados funcionales en la liberación de enzimas y el estrés oxidativo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El modelo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, permitiendo la selección mecanicista en etapas tempranas de agentes citoprotectores antes de realizar perfiles farmacocinéticos o toxicológicos más amplios.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la validación de dianas al aislar los efectos del fármaco al segmento hepático que sufre la lesión por isquemia/reperfusión.
- Tamizaje: Permite la evaluación estandarizada de la eficacia de compuestos mediante resultados cuantificables como la liberación de ALT y la formación de MDA.
- Análisis: Proporciona lecturas multiplexadas (enzimáticas, oxidativas, apoptóticas) para comparar los mecanismos y la potencia de los compuestos.
- Investigación Traducional: Relaciona la protección hepática con resultados relevantes para el trasplante, apoyando decisiones de avance o interrupción de estrategias de preservación de órganos.
- Reutilización Empresarial: La plataforma quirúrgica puede reutilizarse en múltiples campañas de prueba de compuestos, maximizando el retorno de la inversión en el desarrollo del modelo y la capacitación del operador.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al reducir la variabilidad farmacocinética y centrarse en la farmacodinamia específica del hígado.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante un acceso vascular estandarizado y una perfusión segmentaria, minimizando la variabilidad entre animales.
- Valor estratégico: Aumenta la eficiencia en la identificación de compuestos prometedores al permitir pruebas rápidas de relaciones estructura-actividad en un contexto fisiopatológico relevante.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos citoprotectores para programas de trasplante al proporcionar datos mecanicistas y de eficacia desde las primeras etapas del descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la canulación vascular microquirúrgica y en la anatomía hepática de roedores.
- Depende de instrumentos de precisión, incluyendo microjeringas, suturas finas y sistemas de ampliación.
- Necesita cuidados perioperatorios estandarizados, incluyendo el mantenimiento de la temperatura y el monitoreo de signos vitales.
- La adaptación a otros lóbulos u órganos puede requerir un nuevo mapeo anatómico y ajustes en el tamaño de los vasos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad técnica y la dependencia del operador, lo que puede afectar la reproducibilidad entre laboratorios si no se cuenta con una formación rigurosa.
