Name: La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a realizar cribado de siRNA en esferoides de líneas celulares cancerosas para identificar dianas terapéuticas potenciales. Este método permite evaluar el silenciamiento génico en cultivos tridimensionales que reproducen condiciones tumorales in vivo.

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Los autores desean agradecer a Fredrik Walberg (FACS y centro de imagen, ICR) por su ayuda con la microscopía. Este trabajo fue financiado por Breast Cancer Now. RN es la ganadora de una beca de desarrollo profesional de Breast Cancer Now (2011MaySF01).

1. Preparación de 96 pocillos Placas siRNA NOTA: Los bordes exteriores de una placa de 96 pocillos son más propensos a la evaporación en comparación con otros pozos, por tanto, limitar la cantidad de siRNAs a la placa 60 por 96 pocillos. Rellene pocillos externos con medio normal o PBS para limitar esto. Además, se recomienda una pantalla de validación de accesos para aliviar los sesgos de placas. <ol><li> Diluir los siRNAs a 250 - 500 ng / l en el medio con suero reducido (según las recomendaciones del fabricante) y la alícuota de 10 l a los pocillos apropiados de la placa de fijación ultra-bajo. Realizar todas las pantallas por triplicado. NOTA: Incorporar no dirigidos (negativo) y matando (positivo, como UBB y Plk1) siRNA controles apropiados en el diseño de la placa para asegurar la eficacia de transfección se puede evaluar. El uso de placas de fijación bajo para el trabajo siRNA es crítico, ya que las células se añaden a la mezcla de transfección. No podemos descartar que algunos fabricantes de ultra bajo apegoplacas pueden tener efectos sutiles en el crecimiento de esferoides. Como tal, se recomienda que éstos se ponen a prueba por el usuario final. </li><li> placas de cubierta con juntas adhesivas y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 2. invertir transfección de la línea celular <ol><li> En el día de la pantalla, descongelar las placas a temperatura ambiente y centrifugar durante 5 minutos a 1000 xg usando una centrífuga de sobremesa. Añadir 10 l de medio de suero reducido que contienen el reactivo de transfección optimizada para cada pocillo usando una pipeta multicanal. Dejar las placas durante 15 minutos para que contienen complejos de transfección de siRNA para formar. NOTA: este estudio se utilizó la línea celular de cáncer de mama BT474 para la detección genómica funcional (cultivadas en DMEM de alta glucosa (de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos). </li><li> Tripsinizar las células para ser examinadas (0,05% de tripsina y EDTA 0,53 mM) hasta que se desprenden del matraz, neutralizar con volumen apropiado de specif línea celularic medio y centrifugado durante 5 min a 1.000 xg en una centrífuga de mesa para eliminar la tripsina. Resuspender las células con un volumen apropiado de medio y determinar el número de células exacta usando un contador de células. NOTA: Por lo general 5.000 células por pocillo son suficientes para la formación de esferoides en la mayoría de las líneas celulares ensayadas. Es importante contar con precisión las células como una sola suspensión de células para comparaciones de tamaño precisos. </li><li> Diluir las células a 5.000 células por 180 l de medio frío (4 ° C). NOTA: La adición de componentes de la matriz de membrana basal reconstituida impactará negativamente la eficiencia de la transfección y se recomienda que no se utiliza. optimización línea celular para confirmar la capacidad de formación de esferoides y la eficacia de abatimiento se debe realizar antes de la pantalla. </li><li> Transferir la suspensión celular a un depósito, pipeta para mezclar y añadir 180 l a cada pocillo de la placa de fijación 96 pocillos ultra-bajo que contiene el siRNA preparado anteriormente (2,1). </li><li> centrifuge la placa a 1.000 xg en un preenfriada 4 ° C centrifugar durante 10 min y luego regresar a un incubador de cultivo de 37 ° C el tejido. </li><li> NOTA: Las células aparecerá como un mosaico en el fondo de los pocillos. Durante el próximo 12 - 24 h, las células se agregarán entre sí para formar una sola esfera. </li><li> Después de 24 h, observar las células forman una sola esferoide en el centro del pozo. Añadir 100 ml de medio completo a cada pocillo para estimular el crecimiento. </li><li> Reponer medio después de tres días. Retire con cuidado 100 l de medio de cada pocillo y añadir 100 l de medio fresco. </li><li> En el día 7, cuantificar el tamaño del esferoide automatizado en un lector de placas que puede monitorizar cuantitativamente esferoidal crecimiento con el tiempo (véase la Sección 3). </li><li> A continuación, determinar la viabilidad celular usando un colorante de viabilidad celular luminiscente (véase la Sección 4). </li></ol> 3. Adquisición de imágenes automatizado <ol><li> Escanear las placas en un banco de trabajo, de formación de imágenes de micro-así placa citómetro el día 7. <ol> &lt;li&gt; Abra el software, seleccione lo siguiente: &#39;96 -bien placa &#39;, seleccione el tipo de placa correspondiente y registrar un nombre de experimento. NOTA: Cualquier información adicional también se puede añadir en el software. </li><li> Seleccione la aplicación &#39;Tumorsphere&#39;. Alterar el enfoque de manera que el esferoide está enfocada y tiene un contraste óptimo. NOTA: Se recomienda &#39;enfoque basado en imágenes&#39; como variaciones significativas en los tamaños de esferoides se espera. </li><li> Seleccione los pozos que requieren la exploración y &quot;Iniciar análisis&quot;. </li><li> Usando el software del escáner placa, asegúrese de que la máscara objeto representa con precisión el tamaño de esferoides. Hacer esto mediante el ajuste de la configuración del diámetro de las colonias, la dilatación de fronteras, de espesor mínimo y de precisión, específico para cada línea celular probado 11,12. Nota: El área esferoide A continuación se calculará utilizando el algoritmo de software. Por ejemplo, para calcular con precisión la zona de esferoides BT474 cultivadas durante siete días ajustar precisión a &quot;alto&quot; unad establece el diámetro mínimo de colonias a 200 micras. Así se crearía un representante máscara esferoide adecuada de la zona esferoide. NOTA: Estos datos pueden ser exportados desde la máquina, utilizando la función de exportación, en la forma de un archivo de datos anotada. La fecha es la placa mediana normalizada, combinados y analizados ya sea por z-score o diferencia de medias estandarizada estrictamente (SSMD) para identificar siRNAs que tenían un efecto estadísticamente significativo en el área esferoide. </li></ol></li></ol> 4. Determinación de la viabilidad de la célula <ol><li> Después área esferoide se ha calculado, determinar la viabilidad usando un colorante de viabilidad celular luminiscente. Preparar el reactivo según las instrucciones del fabricante. </li><li> Retire cuidadosamente 100 l de medio de cada pocillo y añadir 100 l de colorante de viabilidad. Incubar las placas durante 15 minutos y después se escanean usando un lector de placas luminiscentes. NOTA: Estos datos pueden ser exportados desde la máquina, utilizando la función de exportación, en enla forma de un archivo de datos anotada. La fecha es la placa mediana normalizada, combinados y analizados ya sea por z-score o diferencia de medias estandarizada estrictamente (SSMD) para identificar siRNAs que tenían un efecto estadísticamente significativo sobre la viabilidad esferoide. </li></ol>

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</ol>

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Los modelos tridimensionales de cáncer se están empleando cada vez más para evaluar la eficacia de los compuestos conocidos y nuevos que se han diseñado para matar selectivamente células cancerosas. Esferoides celulares de cáncer son estructuras que muestran condiciones más similares a los encontrados en los tumores in vivo, por lo tanto compuestos que han aumentado la eficacia en 3D son más propensos a tener un efecto in vivo. Sin embargo, estas modalidades no permiten la identificación de dianas potencialmente nuevos que no han sido objeto de diseño de fármacos que podrían tener una eficacia considerable en el tratamiento de cáncer. Hemos desarrollado un enfoque de la genómica funcional de siRNA que permitió el silenciamiento de genes duradera hasta por siete días en el cáncer de líneas celulares esferoides. Hay varios pasos críticos en el protocolo que requieren optimización antes de una pantalla de siRNA se puede realizar. La capacidad de formar esferoides viables reproducibles a gran escala es esencial. Por otra parte, unatransfección condiciones apropiadas, con deben ser rigurosamente optimizados. Sugerimos probando varios diferentes reactivos de transfección con la no adecuada focalización y matando a los controles antes de intentar la pantalla. Hemos sido capaces de demostrar que varias líneas celulares de cáncer de mama de uso común, a saber, BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 y JIMT1 eran susceptibles de siRNA transfección. Además, proporcionamos la prueba de principio de cribado de los 200 genes más frecuentemente mutados en el cáncer de mama en esferoides BT474 datos, confirmó su dependencia de amplificación de HER2 y la mutación oncogénica de PIK3CA. Curiosamente, el silenciamiento de la FOXO3 factor de transcripción resultó en una reducción en el tamaño de esferoides, pero no tiene efecto significativo sobre la viabilidad. FOXO3 se sabe que regulan la respuesta a la hipoxia, la alteración de la capacidad metabólica de las células cancerosas que les permite adaptarse más fácilmente a su entorno 16. Esta función podría interferir potencialmente con la lectura de la viabilidad celular ya que detecta la abundancia ATP, Uno de los principales productos de metabolismo celular. En apoyo de la observación de una reducción en el tamaño de esferoides, se ha demostrado que el silenciamiento de FOXO3 en HeLa xenoinjertos de retraso del crecimiento del tumor y la apoptosis inducida por 17. Es importante tener en cuenta que algunos genes pueden afectar la capacidad de las células cancerosas para mantener su arquitectura 3D, lo que podría dar lugar a falsos positivos. Por ejemplo, desmontables de E-cadherina dio lugar a la disolución de la estructura esferoidal BT474. Esto se había informado anteriormente utilizando E-cadherina dirigido anticuerpos 18. Como con cualquier plataforma de cribado, objetivos potenciales deben ser controlados de nuevo para evaluar la reproducibilidad del efecto observado. Existen limitaciones en la técnica, a saber, la naturaleza transitoria del gen desmontables siRNA mediada. Sostenidas silenciar a más de siete días no era alcanzable con siRNA. La ventaja de este enfoque es que se puede acoplar con varios otros biomascolorantes tric no sólo a aquellos que valoran la viabilidad esferoide, por ejemplo, dar información espacial de la hipoxia esferoides o monitoreo células que experimentan apoptosis. Por otra parte, debido a que las exploraciones lector de placas son relativamente rápido y no invasivo, el impacto de siRNAs en el tamaño del esferoide se puede evaluar con el tiempo en lugar de sólo en el punto final experimental. De hecho, estamos explorando actualmente varias de estas vías dentro de nuestra línea de proyección. Un enfoque alternativo que utiliza cultivos 3D para identificar nuevos dependencias es el uso de bibliotecas químicas que inhiben cualquiera de una amplia gama de objetivos o familias particulares de proteínas. De hecho, Bitler et al. utilizado este enfoque específico para identificar la interacción entre el estado de letalidad sintética ARID1A y los inhibidores de EZH2 en los carcinomas de células claras de ovario 19. El descubrimiento de la tecnología de edición gen CRISPR-Cas9 también ha permitido el desarrollo de las pantallas de genética en cultivos de organoides como in vivo. Sin embargo, tsu enfoque depende de tener instalaciones adecuadas para los animales y puede tener un costo prohibitivo 20. En conclusión, creemos que hemos esbozado un protocolo que los modelos con mayor precisión el oxígeno y nutrientes gradientes, que son características del microambiente del tumor in vivo, lo que permite la identificación de nuevas dianas para el cáncer o la validación robusta de los objetivos establecidos. Por otra parte, el protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de línea celular que forma esferoides y por lo tanto puede ser utilizado de forma rutinaria en la comunidad de investigación del cáncer para las pantallas de siRNA de alto rendimiento.

Los tumores sólidos muestran significativa histológico, la heterogeneidad intra-tumor genética y micro-ambiental, que presenta a los médicos un desafío significativo en la capacidad de tratar a los pacientes con éxito. La mayoría de los modelos utilizados para identificar terapias novedosas no incorporan muchas de estas características. De hecho, las terapias dirigidas actuales utilizados en la clínica se han desarrollado en la última década empleando enfoques de detección que se basan en líneas celulares de cáncer cultivadas bajo condiciones (2D) de cultivo de dos dimensiones. Aunque esto ha dado lugar a varios éxitos, como los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor, cada vez es evidente que se requieren modelos más complejos de cáncer de apreciar plenamente los factores que contribuyen que conducen a la tumorigénesis in vivo e incrementan el número de nuevas terapias que hacen la transición de modelos preclínicos a los ensayos clínicos. Por otra parte, ahora se aprecia bien que los sistemas de cultivo 2D no reflejan encomportamiento in vivo 1,2. Por ejemplo, en tumores vascularizados mal, ya que la demanda de oxígeno y nutrientes en el microambiente superar a la oferta, las regiones de las entregas de alta y baja se desarrollan. La presencia de bajos niveles de oxígeno (hipoxia) en los tumores, tal como se detecta por la tinción inmunohistoquímica de secciones tumorales hipóxicas para los marcadores establecidos, como la anhidrasa carbónica IX (CAIX), se correlaciona con una peor evolución clínica en el cáncer de mama 3,4 características Así que incorporan tales como hipoxia en los modelos de detección puede mejorar nuestra capacidad de descubrir nuevos objetivos farmacológicos que sean más eficaces in vivo. De hecho, dirigidos con éxito tumores agresivos que contienen la hipoxia es una prioridad clínica 5. La alteración de la detección tradicional 2D siRNA, en un intento de recapitular con mayor precisión los elementos de las condiciones encontradas por las células cancerosas en el microambiente tumoral, ha llevado a la identificación de varios genes THa se han encontrado para ser importante para el crecimiento del tumor in vivo. Estos incluyen pantallas de genómica funcional realizados en condiciones de bajo suero 6, 7 y condiciones de hipoxia en combinación 8. Por ejemplo, el silenciamiento de 6-fosfofructo-2-quinasa / fructosa-2,6-bifosfatasa 4 (PFKFB4), una proteína responsable de la regulación de la glicolisis de entrar de carbono, solamente induce la apoptosis en líneas de cáncer de próstata derivadas de metástasis cuando se cultiva en suero bajo. El silenciamiento de PFKFB4 en líneas de células de próstata normales en las mismas condiciones no tuvo ningún efecto, mientras que, el agotamiento de PFKFB4 ablación completamente el crecimiento de la línea celular de cáncer de próstata xenoinjertos 6. En un grupo ampliado de líneas celulares de cáncer de mama, el silenciamiento de transportador de mono-carboxilasa 4 (MCT4) preferentemente condujo a la reducción del crecimiento de la línea celular bajo condiciones de bajo nivel de oxígeno. Esta vulnerabilidad se validó in vivo en el cáncer de mama línea celular xenogra ortotrópicoFTS. número Quizás lo más sorprendente es que el silenciamiento de acetil-CoA sintetasa 2 (ACSS2), una enzima responsable de la conversión de acetato en acetil-CoA, la reducción de cáncer de células bajo condiciones de estrés de nutrientes (bajo nivel de oxígeno y suero), pero tuvo poco o ningún efecto en condiciones normales de cultivo 8. La ablación de ACSS2 afectado el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de mama y de próstata que sugieren que los gradientes de nutrientes no existen en forma aislada en el microambiente tumoral y que las células que residen en estas regiones son esenciales para la progresión del tumor 8. Además, ACSS2 también se encontró que era importante en glioblastoma y carcinomas hepatocelulares 9,10, lo que sugiere que el aumento de la actividad ACSS2 en los tumores podría ser un mecanismo fundamental que apoya el crecimiento en condiciones desfavorables. En conjunto, estos estudios demuestran que la recapitulación de las condiciones encontradas in vivo y la realización de pantallas de siRNA permite la identificación de genes esenciales para la supervivencia del cáncer. Además de afectar el crecimiento celular del cáncer de 2D en condiciones de estrés de nutrientes, el agotamiento de los genes diana en estos estudios inhibida línea celular de crecimiento esferoide cáncer, reflejo de lo que se observó en xenoinjertos de tumor de 6,8. Por lo tanto, esferoides línea celular de cáncer contienen varias de las condiciones encontradas en el microambiente tumoral que imparten sensibilidad a silenciamiento ACSS2. De hecho, esferoides muestran gradientes de nutrientes (suero y oxígeno), cambios en el pH, (3D) de contacto célula-célula tridimensional, sino también, las alteraciones en la celeridad proliferativa con las células sometidas a la detención del ciclo celular y la apoptosis. Ejemplo de ello es la presencia de esferoides de cáncer de regiones necróticas, una característica que no se encuentra en la cultura tradicional en 2D. esferoides celulares de cáncer ya han sido utilizados como modelos más biológicamente relevantes para detectar inhibidores de moléculas pequeñas pero esto sólo permite la validación de la eficacia del compuesto o la reutilización de compounds originalmente diseñar para otras enfermedades 11. métodos de cribado esferoide actuales no permiten el análisis de agotamiento gen específico en un alto rendimiento de forma de alta contenido. A continuación, describimos por primera vez, una tubería de genómica funcional para descubrir dependencias de genes específicos que utilizan tecnología de pequeños ARN de interferencia (siRNA) en el cáncer de líneas celulares esferoides. Hemos diseñado una biblioteca a medida con siRNAs dirigidos a los 200 genes mutados con mayor frecuencia en los cánceres de mama humanos y evaluamos los efectos del agotamiento de genes en el tamaño del esferoide y la actividad metabólica en BT474 esferoides de cáncer de mama. Hemos sido capaces de detectar robusta y reproducible el impacto de ErbB2 y PIK3CA silenciar en 3D culturas. Por otra parte, se podría evaluar el impacto del agotamiento del gen de la arquitectura espacial de esferoides BT474 mediante inmunohistoquímica.

<table><tbody><tr><td>Canción de cuna</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&nbsp;</td><td>reactivo de transfección a base de lípidos</td></tr><tr>Reactivo de <td>transfección de polímero similar a virus</td> <td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td></tr><tr><td>Placa de fijación ultra baja</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Sellos de placa de aluminio</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Tinte luminiscente de viabilidad celular</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (200 &#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (10 &#956; L)</td> <td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1, 000 &#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino Feta</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Biblioteca seleccionada</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara de recuento de células</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>empresa</td><td></td></tr><tr><td>de contacto Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td></td> empresa de contacto <td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Microscopio de campo claro invertido</td><td>Empresa</td><td></td><td>de contacto Zeiss</td></tr><tr><td>Cultivo de tejidos CO2; Incubadora</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas esferoide

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

La identificación de los eventos de controlador funcionales en el cáncer es central para la promoción de nuestra comprensión de la biología del cáncer y indispensable para el descubrimiento de la próxima generación de nuevas dianas farmacológicas. Cada vez es más evidente que se requieren modelos más complejos de cáncer de apreciar plenamente los factores que contribuyen que conducen a la tumorigénesis in vivo e incrementan la eficacia de las terapias innovadoras que hacen la transición de modelos preclínicos para ensayos clínicos. Aquí presentamos una metodología para la generación de esferoides tumorales uniformes y reproducibles que puede ser sometido a cribado funcional de siRNA. Estos esferoides presentan muchas de las características que se encuentran en los tumores sólidos que no están presentes en el cultivo tradicional de dos dimensiones. Se demuestra que varias líneas celulares de cáncer de mama comúnmente utilizados son susceptibles de este protocolo. Además, proporcionamos la prueba de principio de los datos que utilizan el cáncer de mama BT474 línea celular, lo que confirma sudependencia de la amplificación del factor de crecimiento epidérmico receptor HER2 y la mutación de la fosfatidilinositol-4,5-bifosfato 3-quinasa (PIK3CA) cuando se cultiva como esferoides tumorales. Por último, estamos en condiciones de investigar más a fondo y confirmar el impacto espacial de estas dependencias mediante inmunohistoquímica.

Ensayos de esferoides en el Anexo placas ultra-bajo 96 pocillos proporcionan una evaluación fenotípica de alto rendimiento para la oncogenicidad potencial en un contexto que recapitula más fácilmente las condiciones fisiológicas encontradas en los tumores in vivo. De hecho, las líneas celulares de cáncer MCF10DCIS.com y estructuras esferoides ajustados de forma BT474 (Figura 1A) y de investigación inmunohistoquímico de secciones de esferoides mostraron cambios espaciales distintas en la morfología celular y nuclear. Con el tiempo, algunos esferoides como esferoides BT474 desarrollan regiones necróticas, una característica común de los tumores sólidos agresivos (Figura 1B). Algunos esferoides no desarrollan núcleos necróticos, tales como la línea celular MDA-MB-231, pero hacen marcada variación de visualización en el marcador de proliferación Ki67, lo que se correlaciona con inversamente escindido expresión caspsase-3, un marcador de la apoptosis (Figura 1C). Para establecer que las líneas celulares múltiples son, en efecto, RecepTIVE a BT474 silenciamiento génico mediado por siRNA, MCF10DCIS.com, células JIMT1 MDA-MB-231 y fueron transfectadas con siRNA inversa durante siete días. La presencia de reactivo de transfección (mock) o transfección de siRNAs de control no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad esferoide, mientras que el silenciamiento del gen esencial ubiquitina B (UBB) redujo significativamente la viabilidad esferoide en todas las líneas celulares ensayadas (Figura 1D). Hemos diseñado una biblioteca siRNA humano que abarca los genes mutados con mayor frecuencia en no seleccionada, ER +, HER2 + y triples cánceres de mama negativos. Esta biblioteca consiste en genes de función conocida, tales como MYC, PIK3CA y TP53 y aquellos cuya contribución a la carcinogénesis no está establecido. La pantalla también contiene varios control de siRNAs dirigidos-no (control n ° 1, de control n ° 2) y siRNAs dirigidos genes esenciales, tales como Plk1 y UBB, que actúan como matar a los controles (Tabla 1). Se optó por utilizar la canc mamaer líneas de células BT474, ya que forman fácilmente esferoides sin la adición de la membrana basal reconstituida, se establecen las líneas de células de caballo de batalla y tienen una arquitectura genómica conocida. Por ejemplo, las células BT474 son positivos para el receptor de estrógeno (ER +), sobreexpresan el factor de crecimiento epidérmico receptor humano 2 (HER2 +) y las mutaciones del puerto en TP53 (E285K) y PIK3CA (K111N) 13. Empleando el protocolo descrito anteriormente, se ha monitorizado el agotamiento gen impacto tuvo sobre el tamaño del esferoide y viabilidad después de siete días de siRNA transfección inversa (Figura 1E). Curiosamente, la mayoría de los genes no tenía un efecto significativo en el área esferoide o la viabilidad (Figura 2A). El silenciamiento de FOXO3, PIK3CA, ErbB2 y SF3B1 como resultado la reducción reproducible más significativa en el tamaño de esferoides. Esta reducción también se observó en la viabilidad después de esferoide erbB2 y SF3B1 silenciamiento. Es alentador que confirmed el impacto de PIK3CA, erbB2 y SF3B1 silenciar en el tamaño de esferoides utilizando microscopía de campo brillante (Figura 2B). Hemos identificado previamente SF3B1 como un gen esencial en numerosos modelos de líneas celulares y por lo tanto siSF3B1 representa un buen control de la matanza, además de UBB 14. Curiosamente, de los 200 genes sólo el silenciamiento de E-cadherina resultó en un aumento significativo en la viabilidad esferoide (Figura 2A). Investigación de la morfología esferoidal mostró que E-cadherina silenciamiento dio lugar a una ruptura completa de la arquitectura esferoide, con células viables que descansa sobre la parte inferior de la baja fijación bien (Figura 2B). Manual nueva investigación de los datos de pantalla de volumen de esferoides mostró que esto también se había observado, pero había sido eliminado de la cuantificación zona debido al objeto que va por encima de las restricciones de tamaño de conjunto. Como se destacó anteriormente, las células BT474 sobreexpresan el receptor tirosina quinasa HER2 y albergan una mutación oncogénica en PIK3CA (K111N). Se confirmó que el silenciamiento de ErbB2 y PIK3CA dado lugar a reducción de la viabilidad esferoide, mientras que la transfección con los controles no la orientación no tuvo ningún efecto (Figura 2C). A continuación se investigó el impacto del agotamiento de siRNA en la histología esferoide. esferoides BT474 se transfectaron inversa con la no-siRNA dirigidos a control y siRNAs dirigidos PIK3CA, ErbB2 y UBB. El silenciamiento de ErbB2 y UBB resultó en una reducción del marcador de proliferación Ki67 pro-comparación con el control siRNA (Figura 2D). La activación del marcador pro-apoptóticos escinde la caspasa-3 se observó sólo después de UBB silenciamiento, lo que sugiere que el agotamiento de HER2 y PIK3CA no dio lugar a la apoptosis, pero eran citostático en lugar de citotóxico. De hecho, el silenciamiento de HER2 y PIK3CA dio lugar a un aumento en la expresión de proteínas del ciclo celular p27 proteína detención comparación con el control esferoides transfectadas. ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; Tomados en conjunto, estos resultados muestran que las células BT474 son impulsados ​​por oncogénico HER2 y de señalización cuando se cultiva como esferoides 3D PIK3CA es más importante, estos resultados muestran que es posible. Diseñar e implementar una biblioteca de examen siRNA medida de cientos de genes en esferoides línea celular de cáncer robusta y reproducible. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg"> Figura 1: Optimización de la célula de línea para el crecimiento de 3 dimensiones. A. Las líneas celulares de cáncer de mama, MCF10DCIS.com y BT474 se cultivaron en placas de fijación bajas durante 7 días. imágenes representativas de campo claro fueron tomadas usando un microscopio invertido. Barras de escala = 100 m. B. MCF10DCIS.com y BT474 esferoides se cultivaron durante 28 días. 100 l de medio fresco se reponía cada 3 - 4 días. Esferoides fueron fijadas en 3,8% de formaldehído, embedded, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H &amp; E). Se muestran imágenes representativas a baja y alta magnificación. Las barras de escala representan 100 micras y 33 micras, respectivamente. C. MDA-MB-231 esferoides se cultivaron durante 21 días. 100 l de medio fresco se reponía cada 3 - 4 días. Esferoides fueron fijadas en 3,8% de formaldehído, incrustados, seccionadas y teñidas con Ki67 y escinden la caspasa-3. se muestran imágenes representativas. Barras de escala = 100 m. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, y JIMT1 líneas celulares se transfectaron con inversa (reactivo de transfección únicamente) mock y los siRNAs de control y UBB, placas de fijación ultra-bajas se centrifugaron para formar esferoides. Se añadió medio fresco (100 l) los días 1 y 4. Después de 7 días, se cuantificó la viabilidad celular. Los datos representan la media ± desviación estándar de dos réplicas biológicas independientes realizados por triplicado normalizado para controlar # 1. La significación estadística se calculó utilizando una UNPAEstudiantes IRED prueba t (p &lt;0,05). E. Un diagrama de flujo que resume el protocolo de transfección inversa utilizado para interrogar a la dependencia funcional de genes en el cáncer de líneas celulares esferoides. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg"> Figura 2: Investigación Genómica Funcional de BT474 esferoides Destapa Oncogénicos Dependencias. Células BT474 se transfectaron A. inversa con la biblioteca de siRNA siGENOME humano 200-gen por triplicado. se observó el tamaño del esferoide y viabilidad. Valores de los datos en bruto fueron normalizados placa mediana y las puntuaciones z se calcularon para identificar valores atípicos significativos superiores a 1,7 veces la desviación estándar de la placa mediana 15. Nota genes periféricas ErbB2, SF3B1, Plk1 y un UBBnd E-cad. siRNAs que aumentaron o redujeron significativamente el área esferoide y la viabilidad se han coloreado en azul y rojo, donde el rojo representa los siRNA de control. B. Las células fueron transfectadas con el control inverso no director, E-cadherina (E-Cad), PIK3CA, ErbB2 o UBB siRNA y luego girar en una placa de fijación ultra baja para formar esferoides. Después de 7 días, de campo claro esferoide imágenes representativas fueron tomadas usando un microscopio invertido. Barras de escala = 100 m. C. Las células fueron transfectadas con el inverso no director de control, PIK3CA, ErbB2 o UBB siRNA y luego girar en una placa de fijación ultra baja para formar esferoides. Después de 7 días, se cuantificó la viabilidad celular. Los datos representan la media ± desviación estándar de dos réplicas biológicas independientes realizados por triplicado normalizado para controlar # 1. La significación estadística se calculó utilizando un Estudiantes no apareados t-test (p &lt;0,05). D. Después de 7 días, esferoides fueron fijadas, embebidas, seccionadas y teñidaspara H &amp; E, Ki67, exfoliados caspasa-3, y p27. se muestran imágenes representativas. Barras de escala = 100 m. Tenga en cuenta el H &amp; E de los esferoides siCONTROL parezca más pequeño debido a un artefacto de procesamiento e individuales intacta esferoides elegidos para la tinción. Sin embargo, esto no resta valor a los cambios observados con las imágenes digitalizadas y los resultados de viabilidad celular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> No director 1 </td><td> TP53 </td><td> el horario de verano </td><td> KMT2C </td><td> Sin tratamiento 1 </td><td> FCGBP </td><td> arid1b </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> No director 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> AHNAK </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> ITPR2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> APOB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> Lama2 </td><td> AS </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PCLO </td><td> CACNA1B </td><td> erbB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Plk1 </td><td> SYNE1 </td><td> LYST </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> Sin tratamiento 2 </td><td> BVS </td><td> RYR1 </td><td> COL6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> No director 1 </td><td> ENAM </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> Sin tratamiento 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> SI </td><td> No director 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RyR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> NEBRASKA </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> ubr5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td></td> Plk1 <td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> Sin tratamiento 2 </td><td> BVS </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> No director 1 </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> Sin tratamiento 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCoR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><td atr></td><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> TCHH </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> Cajero automático </td><td> LRP1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> SPEN </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> SCN2A </td><td> IPTR3 </td><td> ERBB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> chd4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Plk1 </td><td> EYS </td><td> SACS </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> Sin tratamiento 2 </td><td bvs></td><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> No focalización </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> Sin tratamiento 1 </td><td> sdk1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> No director 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> ATRX </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> ITPR1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> VCAN </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Plk1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> Sin tratamiento 2 </td><td> BVS </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: disposición de las placas y siRNA humana Biblioteca De convolución. La tabla contiene el contenido de cada una de las piscinas de siRNA y el diseño de las placas de unión bajas usadas en la pantalla.

La identificación de nuevos objetivos farmacológicos que pasan de las pruebas preclínicas a los ensayos en humanos es una prioridad científica. Con ese fin, aquí describimos un enfoque de genómica funcional para examinar el impacto del agotamiento de genes en esferoides de líneas celulares cancerosas, que modelan más adecuadamente los cánceres humanos in vivo.

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

El objetivo de este protocolo de cribado de siRNA es investigar el impacto del silenciamiento génico en el crecimiento de esferoides de líneas celulares cancerosas. En comparación con las técnicas tradicionales de cultivo celular bidimensional, los esferoides cancerosos muestran condiciones más similares a las encontradas en los tumores in vivo. Este método es útil para la evaluación funcional de genes frecuentemente alterados en cánceres humanos y, lo que es más importante, se puede utilizar para determinar qué genes son potenciales oncogenes o supresores tumorales en condiciones de cultivo más complejas, como las que se observan en el cultivo tridimensional y, en particular, en hipoxia.La principal ventaja de esta técnica es que es fácilmente adaptable, por lo que los investigadores pueden utilizarla para estudiar sus genes particulares de interés en sus líneas celulares preferidas. Creemos que se basa en los enfoques actuales de detección de ARNs dirigidos. En general, se aprecia que las pruebas de detección dirigidas, en lugar de las cepas del genoma completo, permitan a los científicos hacer preguntas específicas y generar resultados más sólidos.Hemos analizado el efecto del silenciamiento génico en la viabilidad y el tamaño de los esferoides, pero también se pueden utilizar tintes biométricos para una lectura de pantalla diferente, como la apoptosis. La demostración del procedimiento está a cargo de Patty Wai de nuestro laboratorio. Comience descongelando las placas de 96 pocillos que contienen la biblioteca de siRNA a temperatura ambiente.A continuación, centrifugar durante cinco minutos a 1.000 veces g, utilizando una centrífuga de sobremesa. Utilice una pipeta multicanal para añadir 10 microlitros de medio sérico reducido que contenga el reactivo de transfección optimizado a los pocillos de cada placa. Incubar durante 15 minutos para permitir que se formen complejos de transfección que contengan siRNA.Al igual que con cualquier proceso de cribado, la capacidad de formación de esferoides de las líneas celulares en condiciones de transfección debe optimizarse de forma robusta antes de realizar el cribado completo. A continuación, tripsinice las células que se van a cribar hasta que se desprendan del matraz. Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con un volumen adecuado de medio específico de la línea celular, transfiérala a un tubo de centrífuga y centrifuga durante cinco minutos a 1.000 veces g en una centrífuga de sobremesa para recoger las células.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet a una suspensión de una sola celda con un volumen adecuado de medio. Realice un recuento de células mediante un contador de células automatizado. A continuación, diluya la suspensión a 5.000 células por 180 microlitros con medios fríos.Transfiera la suspensión de la celda a un depósito. Usando una pipeta multicanal, ajustada a 180 microlitros, pipetea para mezclar y transferir la suspensión celular a la placa de 96 pocillos que contiene el siRNA. Centrifugar la placa a 1.000 veces g en una centrífuga preenfriada a 4 grados centígrados durante 10 minutos y, a continuación, incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.En este punto, las celdas aparecerán como un mosaico en el fondo de los pozos. Después de 24 horas, observe las células bajo un microscopio. En este punto, las celdas deben agregarse para formar un solo esferoide en el centro del pozo.Agregue 100 microlitros de medio completo a cada pocillo para estimular el crecimiento antes de regresar a la incubadora. Después de tres días de crecimiento, retire suavemente 100 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 100 microlitros de medio fresco. En el séptimo día, examine los esferoides bajo un microscopio y luego proceda a cuantificar el tamaño del esferoide en un lector de placas que pueda monitorear cuantitativamente el crecimiento del esferoide a lo largo del tiempo.Para cuantificar el tamaño del esferoide, primero abra el software en la computadora. Seleccione la placa de 96 pocillos, seleccione el tipo de placa adecuado e introduzca un nombre para el experimento. A continuación, inserte la placa de 96 pocillos que contiene los esferoides en un citómetro de adquisición de imágenes de placa de micropocillos de sobremesa.A continuación, seleccione la aplicación Tumorsphere. Seleccione el enfoque basado en imagen para modificar el enfoque de modo que el esferoide esté enfocado y tenga un contraste óptimo. Seleccione los pozos que requieren escaneo e inicie el escaneo.A continuación, asegúrese de que la máscara de objeto represente con precisión el tamaño del esferoide. Para los esferoides BT474 cultivados durante siete días, ajuste la precisión a alta y establezca el diámetro mínimo de la colonia en 200 micras. Utilice la función Exportar para exportar los datos en forma de un archivo de datos anotado que se analizará para identificar siRNAs con un efecto estadísticamente significativo en el área esferoide.Después de la toma de imágenes, retire 100 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 100 microlitros de tinte de viabilidad luminiscente para determinar la viabilidad celular. Después de incubar las placas durante 15 minutos, escanee la placa con un lector de placas luminiscente. Este protocolo también se puede adaptar para su uso con otras líneas celulares cancerosas.El procedimiento de transfección inversa de los controles no dirigidos no afectó significativamente la viabilidad de ninguna de las líneas probadas, mientras que la transfección de Ubiquitina B, un control positivo de destrucción celular, disminuyó significativamente la viabilidad. Las células BT474 se transfectaron de forma inversa con la biblioteca de siRNA del genoma humano de 200 genes por triplicado. Se observó el área y la viabilidad de los esferoides.Se identificaron valores atípicos significativos con una puntuación z superior a 1,7. Los SiRNAs que aumentaron o redujeron significativamente el área y la viabilidad de los esferoides están sombreados en azul, y el rojo representa los siRNAs de control. Este conjunto de micrografías muestra imágenes representativas de los esferoides BT474 siete días después de la transfección inversa con E-Cadherin, un control no dirigido, PIK3CA, ERBB2 o SF3B1 siRNA.Este histograma muestra cómo el tratamiento con cada siRNA afectó la viabilidad celular siete días después de la transfección inversa. La eliminación de ERBB2 y PIK3CA redujo significativamente la viabilidad celular en comparación con los controles. Esta imagen demuestra que los esferoides pueden ser inmunoteñidos con éxito para revelar el impacto del silenciamiento génico en las proteínas diana.Una vez dominados, se pueden examinar varios cientos de genes en múltiples líneas celulares en un día, lo que permite la identificación robusta de genes potencialmente nuevos importantes para la supervivencia en cultivos tridimensionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar con éxito esferoides de células cancerosas que son susceptibles al silenciamiento génico mediado por ARNs. También podrá investigar el impacto del silenciamiento génico mediante la realización de inmunohistoquímica en los esferoides.Esto puede ofrecer información espacial valiosa que puede informarle sobre la biología subyacente.

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