La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide
26 de diciembre de 2016
La identificación de nuevos objetivos farmacológicos que pasan de las pruebas preclínicas a los ensayos en humanos es una prioridad científica. Con ese fin, aquí describimos un enfoque de genómica funcional para examinar el impacto del agotamiento de genes en esferoides de líneas celulares cancerosas, que modelan más adecuadamente los cánceres humanos in vivo.
El objetivo de este protocolo de cribado de siRNA es investigar el impacto del silenciamiento génico en el crecimiento de esferoides de líneas celulares cancerosas. En comparación con las técnicas tradicionales de cultivo celular bidimensional, los esferoides cancerosos muestran condiciones más similares a las encontradas en los tumores in vivo. Este método es útil para la evaluación funcional de genes frecuentemente alterados en cánceres humanos y, lo que es más importante, se puede utilizar para determinar qué genes son potenciales oncogenes o supresores tumorales en condiciones de cultivo más complejas, como las que se observan en el cultivo tridimensional y, en particular, en hipoxia.
La principal ventaja de esta técnica es que es fácilmente adaptable, por lo que los investigadores pueden utilizarla para estudiar sus genes particulares de interés en sus líneas celulares preferidas. Creemos que se basa en los enfoques actuales de detección de ARNs dirigidos. En general, se aprecia que las pruebas de detección dirigidas, en lugar de las cepas del genoma completo, permitan a los científicos hacer preguntas específicas y generar resultados más sólidos.
Hemos analizado el efecto del silenciamiento génico en la viabilidad y el tamaño de los esferoides, pero también se pueden utilizar tintes biométricos para una lectura de pantalla diferente, como la apoptosis. La demostración del procedimiento está a cargo de Patty Wai de nuestro laboratorio. Comience descongelando las placas de 96 pocillos que contienen la biblioteca de siRNA a temperatura ambiente.
A continuación, centrifugar durante cinco minutos a 1.000 veces g, utilizando una centrífuga de sobremesa. Utilice una pipeta multicanal para añadir 10 microlitros de medio sérico reducido que contenga el reactivo de transfección optimizado a los pocillos de cada placa. Incubar durante 15 minutos para permitir que se formen complejos de transfección que contengan siRNA.
Al igual que con cualquier proceso de cribado, la capacidad de formación de esferoides de las líneas celulares en condiciones de transfección debe optimizarse de forma robusta antes de realizar el cribado completo. A continuación, tripsinice las células que se van a cribar hasta que se desprendan del matraz. Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con un volumen adecuado de medio específico de la línea celular, transfiérala a un tubo de centrífuga y centrifuga durante cinco minutos a 1.000 veces g en una centrífuga de sobremesa para recoger las células.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet a una suspensión de una sola celda con un volumen adecuado de medio. Realice un recuento de células mediante un contador de células automatizado. A continuación, diluya la suspensión a 5.000 células por 180 microlitros con medios fríos.
Transfiera la suspensión de la celda a un depósito. Usando una pipeta multicanal, ajustada a 180 microlitros, pipetea para mezclar y transferir la suspensión celular a la placa de 96 pocillos que contiene el siRNA. Centrifugar la placa a 1.000 veces g en una centrífuga preenfriada a 4 grados centígrados durante 10 minutos y, a continuación, incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.
En este punto, las celdas aparecerán como un mosaico en el fondo de los pozos. Después de 24 horas, observe las células bajo un microscopio. En este punto, las celdas deben agregarse para formar un solo esferoide en el centro del pozo.
Agregue 100 microlitros de medio completo a cada pocillo para estimular el crecimiento antes de regresar a la incubadora. Después de tres días de crecimiento, retire suavemente 100 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 100 microlitros de medio fresco. En el séptimo día, examine los esferoides bajo un microscopio y luego proceda a cuantificar el tamaño del esferoide en un lector de placas que pueda monitorear cuantitativamente el crecimiento del esferoide a lo largo del tiempo.
Para cuantificar el tamaño del esferoide, primero abra el software en la computadora. Seleccione la placa de 96 pocillos, seleccione el tipo de placa adecuado e introduzca un nombre para el experimento. A continuación, inserte la placa de 96 pocillos que contiene los esferoides en un citómetro de adquisición de imágenes de placa de micropocillos de sobremesa.
A continuación, seleccione la aplicación Tumorsphere. Seleccione el enfoque basado en imagen para modificar el enfoque de modo que el esferoide esté enfocado y tenga un contraste óptimo. Seleccione los pozos que requieren escaneo e inicie el escaneo.
A continuación, asegúrese de que la máscara de objeto represente con precisión el tamaño del esferoide. Para los esferoides BT474 cultivados durante siete días, ajuste la precisión a alta y establezca el diámetro mínimo de la colonia en 200 micras. Utilice la función Exportar para exportar los datos en forma de un archivo de datos anotado que se analizará para identificar siRNAs con un efecto estadísticamente significativo en el área esferoide.
Después de la toma de imágenes, retire 100 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 100 microlitros de tinte de viabilidad luminiscente para determinar la viabilidad celular. Después de incubar las placas durante 15 minutos, escanee la placa con un lector de placas luminiscente. Este protocolo también se puede adaptar para su uso con otras líneas celulares cancerosas.
El procedimiento de transfección inversa de los controles no dirigidos no afectó significativamente la viabilidad de ninguna de las líneas probadas, mientras que la transfección de Ubiquitina B, un control positivo de destrucción celular, disminuyó significativamente la viabilidad. Las células BT474 se transfectaron de forma inversa con la biblioteca de siRNA del genoma humano de 200 genes por triplicado. Se observó el área y la viabilidad de los esferoides.
Se identificaron valores atípicos significativos con una puntuación z superior a 1,7. Los SiRNAs que aumentaron o redujeron significativamente el área y la viabilidad de los esferoides están sombreados en azul, y el rojo representa los siRNAs de control. Este conjunto de micrografías muestra imágenes representativas de los esferoides BT474 siete días después de la transfección inversa con E-Cadherin, un control no dirigido, PIK3CA, ERBB2 o SF3B1 siRNA.
Este histograma muestra cómo el tratamiento con cada siRNA afectó la viabilidad celular siete días después de la transfección inversa. La eliminación de ERBB2 y PIK3CA redujo significativamente la viabilidad celular en comparación con los controles. Esta imagen demuestra que los esferoides pueden ser inmunoteñidos con éxito para revelar el impacto del silenciamiento génico en las proteínas diana.
Una vez dominados, se pueden examinar varios cientos de genes en múltiples líneas celulares en un día, lo que permite la identificación robusta de genes potencialmente nuevos importantes para la supervivencia en cultivos tridimensionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar con éxito esferoides de células cancerosas que son susceptibles al silenciamiento génico mediado por ARNs. También podrá investigar el impacto del silenciamiento génico mediante la realización de inmunohistoquímica en los esferoides.
Esto puede ofrecer información espacial valiosa que puede informarle sobre la biología subyacente.
Visión general
Este artículo presenta un enfoque de genómica funcional para identificar posibles objetivos de fármacos mediante el examen de los efectos de la depleción génica en esferoides de líneas celulares de cáncer. Estos esferoides proporcionan un modelo más preciso de tumores humanos in vivo en comparación con los cultivos 2D tradicionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Genómica funcional
- Biología del cáncer
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- El silenciamiento génico puede revelar oncogenes y supresores tumorales.
- Los esferoides de cáncer imitan el microambiente tumoral más de cerca que los cultivos 2D.
- La selección dirigida de siRNA permite la investigación específica de genes.
- Las condiciones hipóxicas pueden estudiarse utilizando este método.
Propósito del estudio
- Investigar el impacto del silenciamiento génico en el crecimiento de esferoides de cáncer.
- Identificar genes que puedan servir como nuevos objetivos de fármacos.
- Mejorar la comprensión de la función génica en un entorno de cultivo 3D.
Métodos utilizados
- Selección de siRNA en esferoides de líneas celulares de cáncer.
- Optimización de las condiciones de transfección para una formación robusta de esferoides.
- Cuantificación del tamaño y viabilidad de los esferoides mediante citometrìa de imagen.
- Análisis de los efectos del silenciamiento génico en la viabilidad y el crecimiento celular.
Principales resultados
- Se observaron efectos significativos de siRNAs específicos en la viabilidad y el tamaño de los esferoides.
- El knockdown de ERBB2 y PIK3CA redujo la viabilidad celular en comparación con los controles.
- Se logró una identificación robusta de genes importantes para la supervivencia en cultivo 3D.
- Se demostró la adaptabilidad del método para varias líneas celulares de cáncer.
Conclusiones
- Este enfoque permite la selección de cientos de genes en un solo día.
- Proporciona una herramienta valiosa para identificar posibles objetivos terapéuticos en el cáncer.
- El método mejora la comprensión de la función génica en un contexto más fisiológicamente relevante.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
