Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en Drosophila Uso de la gastrulación DE-cadherina Reporter moscas transgénicas
29 de diciembre de 2016
Aquí describimos un procedimiento para capturar imágenes en vivo de la gastrulación de Drosophila. Esto nos ha permitido comprender mejor la constricción apical involucrada en el desarrollo temprano y analizar más a fondo los mecanismos que gobiernan los movimientos celulares durante la modificación de la estructura tisular.
El objetivo general de este procedimiento es comprender mejor la forma y el movimiento celular durante la gastrulación de Drosophila. Aquí proporcionamos un método robusto de medición de la gastrulación de Drosophila, para ensayar el inicio del movimiento celular morfogenético, durante esta etapa del desarrollo embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que, el reordenamiento celular en el momento de la gastrulación, se puede identificar junto con la constricción apical, durante la gastrulación.
Para comenzar el experimento, prepare una mezcla de 375 mililitros de agua. 125 mililitros de jugo de manzana 100% disponible comercialmente. 12,5 gramos de agar.
12,5 gramos de glucosa. A continuación, calienta la mezcla en el microondas, hasta que el agar se derrita. Y viértelo en una placa de cultivo celular de tres centímetros.
Guarde la mezcla a 4 grados centígrados, para su uso futuro. Después de preparar el plato de manzanas, agregue una capa delgada de pasta de levadura amasada encima, para permitir que las moscas pongan huevos. Coloque 25 moscas macho y 25 hembras en una botella en un plato de manzana cubierto de levadura amasada.
Envuelve las botellas de plástico de Drosophilas con papel de aluminio para que las moscas pongan más huevos. Mantenga el biberón boca abajo en una incubadora durante la noche. A la mañana siguiente, reemplace el plato de jugo de manzana por uno nuevo.
Luego envuelva la botella con papel de aluminio y deje que las moscas pongan huevos durante tres o cuatro horas. Después de que las moscas hayan puesto huevos, afloje los huevos del plato con un bastoncillo de algodón. Recoja los embriones en un colador y lávelos con solución salina tamponada con fosfato, o PBS.
Lave los embriones tres veces más con PBS, en platos de cultivo de 12 pocillos. Decorionar los embriones con lejía al 50%, en placas de cultivo de 12 pocillos. Después del proceso de decorionación, lavar los embriones tres veces más con PBS.
Transfiera los embriones a una placa de cultivo celular de tres centímetros que contenga PBS. Y seleccionar embriones en etapa cinco bajo el microscopio, en función del nivel de transparencia en sus bordes. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, recoja los embriones en etapas.
A continuación, coloque dos embriones seleccionados en una cubierta de vidrio y retire el exceso de PBS con papel de seda. Con un papel de seda finamente retorcido, oriente el lado dorsal de los embriones hacia el cubreobjetos. A continuación, fije los embriones a la cubierta de cristal con grasa de silicona con una aguja fina.
Agregue una pequeña gota de aceite de carbón hueco 700 sobre los embriones y coloque el cubreobjetos que contiene los embriones boca abajo en el portaobjetos dentado. Dejando algo de espacio en la parte inferior de la diapositiva. A continuación, pegue el cubreobjetos a la corredera.
Por último, examine los embriones utilizando un sistema de imágenes confocal, un láser de argón 488 y un objetivo de inmersión en aceite. Las imágenes de lapso de tiempo se capturaron a partir de imágenes en vivo, utilizando DE-cadherin GFP del movimiento celular durante 500 segundos, para analizar las áreas apicales de las células individuales de Drosophila durante la gastrulación. A los 500 segundos, la constricción apical y la invaginación son claramente visibles.
Utilizando nuestro método. Podemos comprender mejor los mecanismos moleculares de la gastrulación de Drosophila, así como la transición epitelial a mesenquimatosa, involucrada en la metástasis del cáncer.
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Descripción general
Este artículo presenta un procedimiento para capturar imágenes en vivo de la gastrulación de Drosophila, mejorando así nuestra comprensión de la constricción apical durante el desarrollo temprano. La técnica permite un análisis detallado de los movimientos celulares implicados en la modificación de la estructura del tejido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Biología celular
Antecedentes
- La gastrulación en Drosophila es una fase crítica en el desarrollo embrionario.
- Comprender la forma y el movimiento celular es esencial para entender los procesos del desarrollo.
- La constricción apical desempeña un papel importante en los movimientos morfogenéticos.
- Las técnicas de imagen en vivo pueden proporcionar información sobre los comportamientos celulares dinámicos.
Objetivo del estudio
- Mejorar la comprensión de los movimientos celulares durante la gastrulación de Drosophila.
- Desarrollar un método robusto para medir el movimiento celular morfogenético.
- Identificar las reorganizaciones celulares y la constricción apical durante la gastrulación.
Métodos Utilizados
- Preparación de una mezcla específica para la obtención de imágenes.
- Obtención de imágenes en tiempo real de embriones de Drosophila durante la gastrulación.
- Análisis de los movimientos celulares y los cambios de forma.
- Identificación de los eventos morfogenéticos clave.
Resultados principales
- Captura exitosa de imágenes en vivo de la gastrulación de Drosophila.
- Identificación de la constricción apical y el reordenamiento celular.
- Mejor comprensión de la dinámica celular durante el desarrollo temprano.
- Metodología robusta para estudios futuros en biología del desarrollo.
Conclusiones
- El procedimiento proporciona información valiosa sobre la gastrulación de Drosophila.
- La imagenología en vivo es una herramienta poderosa para estudiar los movimientos celulares.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión más amplia de los procesos del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen en vivo de la alteración de la forma celular y el movimiento durante la gastrulación de Drosophila proporciona una plataforma robusta para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes a la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), un proceso implicado en la fibrosis y la metástasis del cáncer. Este método permite la visualización de alta resolución de la constricción apical y la reorganización celular, lo que respalda la confianza predictiva en la validación temprana de dianas para vías relacionadas con la EMT. El enfoque fortalece la continuidad traslacional desde la biología del desarrollo hasta estudios mecanicistas relevantes para enfermedades en la investigación y desarrollo biofarmacéutico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de la función génica relacionada con el MTE y la dinámica de las vías en un contexto vivo y multicelular.
- Apoya la desviación de riesgos biológicos mediante la visualización directa de eventos morfogenéticos vinculados a mecanismos de enfermedad.
- Facilita la validación funcional de dianas para genes que controlan la constricción apical y las transiciones del destino celular.
- Proporciona confianza predictiva para la priorización de dianas moduladoras del MTE en carteras de oncología y fibrosis.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un sistema de imagen validado para cuantificar en tiempo real el movimiento celular y los cambios de forma.
- Permite la medición reproducible de la constricción apical y el reordenamiento celular como resultados cuantitativos del ensayo.
- Facilita la estandarización de plataformas de cribado fenotípico para compuestos que modulan el EMT.
- Prepara sistemas biológicos robustos para flujos de trabajo de cribado de alto contenido en etapas posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona los procesos de EMT en desarrollo con modelos relevantes para enfermedades de metástasis y remodelación tisular.
- Proporciona conocimientos mecanicistas que orientan la selección de biomarcadores traslacionales para estudios preclínicos.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos dirigidos contra el EMT basado en evidencia fenotípica de células vivas.
- Fortalece la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en áreas de enfermedades impulsadas por el EMT.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de imagen se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta el desarrollo de modelos preclínicos para dianas relacionadas con la EMT.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías reguladoras del MTE y de la morfogénesis.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles sobre la forma y el movimiento celular, posibilitando la preparación de ensayos.
- Análisis: Ofrece datos de imágenes de alto contenido para el análisis comparativo de perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Investigación Traducional: Conecta los mecanismos del desarrollo con modelos del MTE relevantes para enfermedades, facilitando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma de imagenología reutilizable y adaptable a diversos estudios sobre MTE y morfogénesis.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva y la reducción del riesgo mecanicista en programas de descubrimiento dirigidos a la EMT.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo de imagen estandarizados y escalables para la reproducibilidad entre proyectos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas en indicaciones impulsadas por la EMT.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de activos que modulan la EMT en diversas áreas terapéuticas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes en vivo, microscopía confocal y embriología de Drosophila.
- Exige acceso a instrumentación de imágenes avanzada y software analítico para análisis de imágenes de lapso de tiempo.
- Necesita estandarización entre equipos de los estadios embrionarios y los protocolos de obtención de imágenes para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización de constructos reporteros y condiciones de imagen.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones en el rendimiento y la necesidad de manipulación precisa de los embriones.
