Name: Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en Drosophila Uso de la gastrulación DE-cadherina Reporter moscas transgénicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Aprende a capturar imágenes en vivo de la gastrulación en Drosophila para estudiar la constricción apical y los movimientos celulares morfogenéticos. Este método permite analizar la dinámica celular durante el desarrollo embrionario temprano.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Astellas para la Investigación de Trastornos Metabólicos (HT), la Fundación de Ciencias Takeda (HT) y el Programa Apoyado por MEXT para la Fundación de Investigación Estratégica en Universidades Privadas (HT).

NOTA: Las moscas transgénicas utilizadas en este estudio son las siguientes: DE-cad 10 :: GFP. 1. Preparación de la placa de Apple <ol><li> Preparar una mezcla de 12,5 g de agar, 125 ml 100% disponible comercialmente jugo de manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Se calienta la mezcla en el microondas y se vierte en una placa de cultivo celular de 3 cm. Almacenar la mezcla a 4 ° C para uso futuro. </li><li> Después de preparar la placa de manzana, añadir una capa delgada de pasta de levadura amasada en la parte superior de la misma para permitir que las moscas de la puesta de huevos. </li></ol> 2. Preparación de embriones y el Protocolo de imágenes en vivo <ol><li> Coloque aproximadamente 50 moscas (25 machos y 25 hembras) en una botella para aparearse y posteriormente poner huevos durante la noche en una placa de manzana cubierta en la levadura amasada. Coloque la placa de jugo de manzana en la boca de la botella. Mantenga la botella boca abajo en una incubadora. Envolver las botellas de plástico Drosophila acciones con papel de aluminio para impulsar THe vuela a poner más huevos. </li><li> A la mañana siguiente, reemplace la placa de jugo de manzana vieja por una nueva. </li><li> Deje que las moscas ponen sus huevos durante 3 a 4 h envolviendo la botella con papel de aluminio. </li><li> De tres a cuatro horas más tarde, recoger los embriones en un colador de embrión a partir de la placa de jugo de manzana con un pincel o algodón malo y lavarlos con PBS. Lavar los embriones de 2 a 3 veces más con PBS en placas de cultivo de 12 pocillos. </li><li> Dechorionate los embriones con 50% de lejía por 5 min en placas de cultivo de 12 pocillos. </li><li> Tras el proceso de dechorionation, lavar los embriones de 2 a 3 veces más con PBS. </li><li> La transferencia de los embriones para una placa de cultivo celular 3 cm que contiene PBS y seleccione etapa 5 embriones bajo el microscopio basado en el nivel de transparencia en sus fronteras. Pipetear los embriones progresivo a través de una punta de pipeta 200 l. </li><li> A continuación, coloque dos embriones seleccionados en un cubreobjetos de vidrio, y eliminar el exceso de PBS con un pañuelo de papel torcido. Orientar los embriones lado dorsal arriba enel cubreobjetos usando un papel de seda torcido. Después de eso, una los embriones a la cubreobjetos de vidrio con grasa de silicona utilizando una aguja fina y papel de seda trenzado. </li><li> Añadir una pequeña gota de aceite de halocarbono 700 en los embriones y colocar el cubreobjetos que contiene los embriones al revés en la corredera dentada, dejando un poco de espacio en la parte inferior de la corredera. </li><li> Examinar los embriones utilizando un sistema de imagen confocal, un / 488 láser de argón, y un objetivo de inmersión en aceite (63X). NOTA: La identificación del embrión en la etapa de desarrollo apropiada es importante para capturar imágenes del evento gastrulación. En estas condiciones, observan casi todos los embriones se desarrollan normalmente hasta al menos la etapa 14. El embrión se analizaron puede cultivarse más de desarrollarse como un adulto. </li></ol>

<ol><li>Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+half+of+the+Drosophila+E-cadherin+extracellular+region+is+dispensable+for+many+cadherin-dependent+events+but+required+for+ventral+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation.</a> Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).</li>
<li>Oda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+structural+and+functional+diversity+of+cadherin+at+the+adherens+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction.</a> J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+in+embryonic+development+and+tumor+growth+integrative+cues+through+molecular+to+multicellular+interplay+and+evolutionary+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives.</a> Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Epithelial+to+mesenchymal+and+back+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).</li>
<li>Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+the+Crossroads+between+EMT+and+Stemness+in+the+Context+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer.</a> J. Clin. Med. 5 (3), (2016).</li>
<li>Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial-mesenchymal+transition+through+epigenetic+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications.</a> Mol. Cancer. 15, (2016).</li>
<li>Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-induced+disruption+of+Nanog+expression+results+in+reduced+proliferation%2C+invasiveness+and+migration%2C+increased+chemosensitivity+and+reversal+of+EMT+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells.</a> Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+is+dispensable+for+metastasis+but+induces+chemoresistance+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer.</a> Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed%2C+efficient%2C+and+versatile+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+genomic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque hemos informado previamente de un procedimiento similar para capturar imágenes en vivo del proceso de gastrulación en Drosophilla1, el método que describimos aquí es detallado y fácil de rastrear la expresión endógena de cadherina y, por lo tanto, es bastante útil para el cribado genético de factores clave involucrados en la gastrulación. Para maximizar el éxito con este procedimiento de imágenes, es esencial utilizar un portaobjetos con sangría. La presión mecánica a veces causa la muerte embr...

La gastrulación es el primero conjunto de eventos morfológicamente dinámicas que se producen durante el desarrollo embrionario de los animales multicelulares tales como Drosophila 1,2. Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que este proceso está regulado a través de la interacción entre los mecanismos mecánicos y moleculares 3. Por otra parte, la transición epitelial a mesenquimal (EMT), que es un proceso crucial en la gastrulación, también está implicada en procesos de enfermedades humanas, tales como metástasis de cáncer de 4-8. Como también se conocen tal, muchos genes que controlan la constricción apical ser factores clave en la EMT observado en la metástasis del cáncer 9. Por lo tanto, la constricción apical en el momento de la gastrulación es un excelente modelo para investigar los mecanismos de regulación mencionados anteriormente y para mejorar nuestra comprensión de la metástasis del cáncer. La ventaja de esta técnica es que se puede observar el movimiento de células en el momento de la gastrulación en tiempo real y por lo tanto, estaremoscapaz de pantalla genes implicados en la gastrulación, así como la metástasis del cáncer. Aunque relativamente desconocido, se cree que la adhesión célula a célula para jugar un papel central en la constricción apical 1. La genética de Drosophila es muy adecuado para las investigaciones nivel de células individuales que exploran los mecanismos moleculares de regulación. Este modelo nos permitirá descubrir la importancia de la constricción apical durante la gastrulación. Por otra parte, este método se puede utilizar para detectar los genes implicados en la metástasis del cáncer. La captura de imágenes en directo de Drosophila gastrulación nos ha permitido además a entender con mayor detalle los mecanismos moleculares que regulan el reordenamiento de los tejidos. En este documento, se proporciona una descripción completa de un método simple para lograrlo.

<table><tbody><tr><td>Aceite de halocarbono 700</td><td>Sigma</td><td>MKBH 5726</td><td></td></tr><tr><td>Grasa al vacío Silicona</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio&nbsp;</td><td>Vidrio Matsunami</td><td>Espesor No1</td><td>24 - 36 mm</td></tr><tr><td>Embryo stariner</td><td>Corning</td><td>Corning3477</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de plástico Drosophilla Stock</td><td>Hitec</td><td>MKC-100</td><td></td></tr><tr><td>DE-Cadherin moscas</td><td></td><td></td> knock-in <td>REF (10)</td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en drosophila uso de la gastrulación de-cadherina reporter moscas transgénicas

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

La gastrulación es el primero conjunto de eventos morfológicamente dinámicas que se producen durante el desarrollo embrionario de los animales multicelulares tales como Drosophila. Esta alteración morfológica también es reconocida como transición epitelial a mesenquimal (EMT). La desregulación de EMT está asociado con la fibrosis y la metástasis del cáncer. Hay pruebas de que EMT es controlado por un número de mecanismos moleculares. Como también se conocen tales muchos genes, clave que controlan la constricción apical a ser factores importantes en la EMT observado en la metástasis del cáncer. Como EMT durante la gastrulación Drosophila, las células epiteliales pueden ser inducidas a cambiar su forma y ser reprogramadas para redirigir el destino celular hacia otros diversos tipos de células. Aquí se proporciona un método de formación de imágenes robusta de Drosophila gastrulación para ensayar la iniciación de los movimientos celulares morfogenéticos y la identificación del destino celular durante esta etapa del desarrollo embrionario. Usando este método, identificamos cell reordenación en el momento de la gastrulación y demostrar la importancia de la constricción apical durante la gastrulación usando GFP etiquetados DE-cadherina.

Aquí, mostramos los eventos de gastrulación en el embrión de Drosophila y una descripción general del procedimiento de preparación del embrión (Figura 1). Las membranas celulares se marcaron utilizando DE-cadherina :: GFP y formación de imágenes en vivo de movimientos de las células se realiza en el momento de la gastrulación en Drosophila (Figura 2). Desde moscas DE-cadherina GFP nos permiten visualizar las uniones de adherencia celular, somos ...

Aquí describimos un procedimiento para capturar imágenes en vivo de la gastrulación de Drosophila. Esto nos ha permitido comprender mejor la constricción apical involucrada en el desarrollo temprano y analizar más a fondo los mecanismos que gobiernan los movimientos celulares durante la modificación de la estructura tisular.

Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en Drosophila Uso de la gastrulación DE-cadherina Reporter moscas transgénicas

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

El objetivo general de este procedimiento es comprender mejor la forma y el movimiento celular durante la gastrulación de Drosophila. Aquí proporcionamos un método robusto de medición de la gastrulación de Drosophila, para ensayar el inicio del movimiento celular morfogenético, durante esta etapa del desarrollo embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que, el reordenamiento celular en el momento de la gastrulación, se puede identificar junto con la constricción apical, durante la gastrulación.Para comenzar el experimento, prepare una mezcla de 375 mililitros de agua. 125 mililitros de jugo de manzana 100% disponible comercialmente. 12,5 gramos de agar.12,5 gramos de glucosa. A continuación, calienta la mezcla en el microondas, hasta que el agar se derrita. Y viértelo en una placa de cultivo celular de tres centímetros.Guarde la mezcla a 4 grados centígrados, para su uso futuro. Después de preparar el plato de manzanas, agregue una capa delgada de pasta de levadura amasada encima, para permitir que las moscas pongan huevos. Coloque 25 moscas macho y 25 hembras en una botella en un plato de manzana cubierto de levadura amasada.Envuelve las botellas de plástico de Drosophilas con papel de aluminio para que las moscas pongan más huevos. Mantenga el biberón boca abajo en una incubadora durante la noche. A la mañana siguiente, reemplace el plato de jugo de manzana por uno nuevo.Luego envuelva la botella con papel de aluminio y deje que las moscas pongan huevos durante tres o cuatro horas. Después de que las moscas hayan puesto huevos, afloje los huevos del plato con un bastoncillo de algodón. Recoja los embriones en un colador y lávelos con solución salina tamponada con fosfato, o PBS.Lave los embriones tres veces más con PBS, en platos de cultivo de 12 pocillos. Decorionar los embriones con lejía al 50%, en placas de cultivo de 12 pocillos. Después del proceso de decorionación, lavar los embriones tres veces más con PBS.Transfiera los embriones a una placa de cultivo celular de tres centímetros que contenga PBS. Y seleccionar embriones en etapa cinco bajo el microscopio, en función del nivel de transparencia en sus bordes. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, recoja los embriones en etapas.A continuación, coloque dos embriones seleccionados en una cubierta de vidrio y retire el exceso de PBS con papel de seda. Con un papel de seda finamente retorcido, oriente el lado dorsal de los embriones hacia el cubreobjetos. A continuación, fije los embriones a la cubierta de cristal con grasa de silicona con una aguja fina.Agregue una pequeña gota de aceite de carbón hueco 700 sobre los embriones y coloque el cubreobjetos que contiene los embriones boca abajo en el portaobjetos dentado. Dejando algo de espacio en la parte inferior de la diapositiva. A continuación, pegue el cubreobjetos a la corredera.Por último, examine los embriones utilizando un sistema de imágenes confocal, un láser de argón 488 y un objetivo de inmersión en aceite. Las imágenes de lapso de tiempo se capturaron a partir de imágenes en vivo, utilizando DE-cadherin GFP del movimiento celular durante 500 segundos, para analizar las áreas apicales de las células individuales de Drosophila durante la gastrulación. A los 500 segundos, la constricción apical y la invaginación son claramente visibles.Utilizando nuestro método. Podemos comprender mejor los mecanismos moleculares de la gastrulación de Drosophila, así como la transición epitelial a mesenquimatosa, involucrada en la metástasis del cáncer.

imaging-cell-shape-alteration-cell-movement-drosophila-gastrulation

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Aquí se presenta un protocolo de montaje para...

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

El desarrollo temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se caracteriza por una serie de cambios en la forma de células que se presta a los enfoques de imagen. En este artículo se describen las herramientas básicas y los métodos necesarios para la imagen confocal en vivo de embriones de Drosophila, y se centrará en un cambio de forma de la célula llamado cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.

Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Aquí, se presenta un protocolo para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo de la pata de Drosophila durante la etapa de pupa, que implica la eliminación completa del pupario. Este protocolo también se puede aplicar a otros tejidos.

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Aprende a capturar imágenes en vivo de la gastrulación en Drosophila para estudiar la constricción apical y los movimientos celulares morfogenéticos. Este método permite analizar la dinámica celular durante el desarrollo embrionario temprano.

Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en Drosophila Uso de la gastrulación DE-cadherina Reporter moscas transgénicas (Video) | JoVE Journal

Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en Drosophila Uso de la gastrulación DE-cadherina Reporter moscas transgénicas

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