3D cuantitativa In silico Modelado (q3DISM) de beta-amiloide cerebral fagocitosis en roedores modelos de enfermedad de Alzheimer

El objetivo general de este modelado cuantitativo 3-D in silico, o técnica q3DISM, es cuantificar la absorción de beta-amiloide por parte de los fagocitos mononucleares en los cerebros de modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método aborda una necesidad apremiante en el campo de la investigación de la enfermedad de Alzheimer para cuantificar la eliminación de la beta amiloide que se deposita en el cerebro de los pacientes con Alzheimer formando placas seniles. Por primera vez, esta técnica permite una verdadera reconstrucción y cuantificación en 3D de la beta amiloide por parte de los macrófagos in vivo Comenzamos a utilizar el 3-Dism para estudiar la deposición de beta-amiloide porque necesitábamos una herramienta robusta para visualizar y cuantificar la fagocitosis de los micrófagos in vivo.

Esta técnica puede resultar útil para probar terapias experimentales para la enfermedad de Alzheimer con el fin de evaluar qué fármacos estimulan a los macrófagos para la eliminación eficiente de la beta-amiloide. Cuando las muestras de tejido estén listas para la inmunotinción, llene la región de tejido rodeada por un lápiz de barrera hidrofóbica con tampón de bloqueo para una incubación de una hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Al final de la incubación, reemplace el tampón de bloqueo con el primer anticuerpo primario de interés durante la noche a 4 grados centígrados en la cámara humidificada.

A la mañana siguiente, lave las muestras en tres baños de PBS de cinco minutos a temperatura ambiente con una ligera agitación. Después del tercer lavado, incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario fluorescente adecuado a temperatura ambiente y protegerlos de la luz. Después de una hora, lave las secciones tres veces más en PBS protegidas de la luz.

A continuación, etiquete las células con los otros anticuerpos primarios y secundarios apropiados para el tejido de interés durante los próximos dos a cuatro días, como se acaba de demostrar. Para teñir eficazmente los compartimentos celulares y supercelulares y los depósitos de beta amiloide, es crucial marcar con un solo anticuerpo primario a la vez, seguido del anticuerpo secundario correspondiente. Un proceso que requiere mucho tiempo pero que optimiza los resultados.

Después del último lavado de la tinción secundaria de anticuerpos, deje que las secciones se sequen completamente durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, cubra las muestras secas con un cubreobjetos sellado con un medio de montaje fluorescente que contenga DAPI. Para obtener imágenes de las muestras mediante microscopía confocal, seleccione el objetivo del microscopio de 60x y agregue aceite de inmersión a la lente.

Coloque la muestra en el portaobjetos de la platina del microscopio y eleve el objetivo hasta que el aceite entre en contacto con el portaobjetos. Usando iluminación epifluorescente, ajuste el plano focal para ubicar las placas amiloides en el hipocampo o la corteza cerebral. Luego, adquiera imágenes confocales de los fagocitos mononucleares activados que rodean los depósitos de amiloide en el hipocampo o la corteza.

Para el modelado cualitativo 3D in silico, primero analice los conjuntos de datos confocales con procesamiento científico de imágenes 3D en un módulo de colocalización de software de análisis para la proximidad espacial de la tinción del marcador de macrófagos activados en todos los planos Z simultáneamente. Crear canales de colocalización que correspondan a la tinción de fagolisosomas dentro de los fagocitos mononucleares activados. Seleccione TRITC para el canal A y FITC para el canal B.In la ventana de verificación de modo, seleccione Umbral.

Para las intensidades de colocalización, seleccione Canales de origen. Haga clic en Editar para seleccionar el color de colocalización. A continuación, ajuste los umbrales de cada canal de forma independiente para incluir la tinción específica y excluir las señales de fondo y no específicas.

Los vóxeles colocalizados aparecerán en el color de colocalización seleccionado en todas las pilas z simultáneamente. A continuación, haga clic en Crear canal de colocalización. El canal de colocalización creado aparecerá en la ventana Ajuste de visualización.

Haga clic en el canal de colocalización para abrir las estadísticas del canal. El porcentaje de material volumétrico A por encima del umbral colocalizado representa el volumen de monocitos ocupado por los fagolisosomas. Con el módulo de colocalización, analice el canal de colocalización para la proximidad espacial con las señales de beta-amiloide para cuantificar la beta-amiloide encapsulada dentro de los fagolisosomas.

Seleccione el conjunto de datos de colocalización del canal A y Cy5 para el canal B y cree un canal de colocalización como se acaba de demostrar. Haga clic en el canal de colocalización para volver a abrir las estadísticas del canal. El porcentaje de volumen de material A por encima del umbral colocalizado representa el volumen fagolisosomal ocupado por la beta-amiloide.

Con el módulo Surpass, reconstruya las pilas de imágenes confocales y genere modelos 3D de la beta amiloide encapsulada dentro de los fagolisomas de monocitos. En la ventana Ajuste de pantalla, seleccione TRITC para mostrar solo la tinción de macrófagos y haga clic en "agregar nueva superficie" en las propiedades del volumen. En Configuración, en el paso uno de cinco, algoritmo, seleccione Surface.

En color, seleccione el tipo de color que le interese y ajuste la transparencia según corresponda. A continuación, marque la casilla seleccionar región de interés y haga clic en Siguiente. En el paso dos de cinco, región de interés, ajuste las coordenadas X, Y y Z para dibujar una ventana alrededor de la celda de interés y haga clic en Siguiente.

En el paso tres de cinco, canal de origen, seleccione el canal de origen TRITC y marque la casilla Suavizar. Establezca el nivel de detalle del área de superficie en 0,4 micras y haga clic en siguiente. En el paso cuatro de cinco, umbral, ajuste el umbral para que el volumen creado se superponga perfectamente con la señal del canal TRITC y haga clic en siguiente.

Por último, en el paso cinco de cinco, clasificar superficies, en la sección Tipos de filtro, seleccione los objetos en función de su tamaño a incluir o excluir de los volúmenes a crear. Repita los mismos pasos para crear superficies 3D para fagolisosomas con el canal FITC y beta-amiloide con el canal Cy5. Después de un modelado cualitativo en 3-D in silico, como se acaba de demostrar, se puede analizar la absorción de beta amiloide en los fagolisosomas de monocitos en los cerebros de ratones y ratas transgénicos.

Curiosamente, el volumen ocupado por los fagolisomas CD68 positivos aumenta significativamente en los fagocitos mononucleares positivos Iba1, asociados a placas tanto en ratones como en ratas, en comparación con las distancias de ellas, lo que demuestra que los fagocitos mononucleares cercanos a las placas están preparados para la fagocitosis, en comparación con las células situadas lejos de las placas. También cabe destacar que los fagocitos mononucleares asociados a la placa exhiben una mayor absorción de beta amiloide en ratones transgénicos en comparación con las células distantes de las placas, mientras que en ratas transgénicas se observa una absorción muy modesta de fibrillas de beta amiloide en general, sin cambios aparentes en la fagocitosis de beta fibrilla de amiloide en función de la distancia a las placas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de las imágenes confocales es crucial y que se deben aplicar umbrales similares para todos los canales durante el análisis de colocalización.

Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neuroinflamación exploren los eventos fagocíticos en los cerebros de modelos de roedores con enfermedad de Alzheimer. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar secciones de cerebro de roedores para fagocitos mononucleares, fagolisosoma y beta amiloide. Cuantificar la fagocitosis de la beta-amiloide cerebral en 3-D in vivo.