Name: A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a identificar productos naturales antibióticos y determinar sus clusters biosintéticos mediante minería genómica en Streptomyces diastatochromogenes. Este protocolo acelera el descubrimiento de nuevos antibióticos.

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S. Zhang está financiado por el Consejo de Becas de China. Los autores están muy agradecidos a las personas que trabajaron en el proyecto de policetomicina en este laboratorio y al Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, de la Universidad de Tübingen, por proporcionar el productor de policetomicina. La investigación fue apoyada por la DFG (RTG 1976).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este laboratorio una biblioteca de cósmidos genómica de Streptomyces diastatochromogenes se generó y se proyectó hace muchos años, lo que resulta en la identificación de la agrupación de genes polyketomycin través de un proceso extremadamente lento. Caracterización de los genes individuales fuera posible usando deleciones de genes específicos y el análisis de los mutantes resultantes 12. Recientemente, se obtuvo un proyecto de secuencia del genoma de S. diastatochromogenes que permite la identificación rápida de la agrupación de genes biosintéticos polyketomycin. Podríamos detectar fácilmente los genes biosintéticos, aunque el proyecto de secuencia del genoma contiene todavía muchos contigs. El proceso descrito se puede lograr en pocos meses. Sin embargo, el procedimiento comprende muchos pasos. medidas individuales pueden fallar varias veces, la prevención de la progresión a etapas posteriores: El género Streptomyces es conocida por su capacidad de producir compuestos bioactivos. Mientras que llevan a menudo más de 20 biografíasynthetic grupos de genes, por lo general sólo una o dos compuestos se producen bajo condiciones de laboratorio. La aplicación del enfoque OSMAC (cultivo de una cepa en condiciones diferentes) para despertar grupos de genes silenciosos a veces puede no ser suficiente. La manipulación genética de los genes reguladores, tales como los genes reguladores pleiotrópicos ADPA 44 y bldA 45,46, es también un método eficaz para activar la producción de otros metabolitos secundarios. Para la elucidación de la estructura del compuesto, por ejemplo, por análisis de RMN, por lo general más de 2 mg de compuesto purificado es necesario. Por lo tanto, a menudo se requiere la fermentación de la cultura más de 10 L. Sin un fermentador que es capaz de mantener condiciones de oxígeno, pH y temperatura, puede ser un reto en un pequeño laboratorio para manejar esta cantidad de cultivo y la extracción posterior. Durante la purificación, el compuesto puede cambiar debido a la oxidación, la radiación o la temperatura.También, se utilizan las más etapas de purificación, mayor será la probabilidad de degradación. Al analizar la estructura del producto natural, y los grupos en el genoma, a veces no es tan fácil de identificar el clúster correspondiente. En primer lugar, si sólo hay un proyecto de secuencia del genoma alguna parte del clúster puede no aparecer. En segundo lugar, no todos los genes que son necesarios para la biosíntesis están en el clúster. En tercer lugar, a veces un grupo se divide en dos partes separadas una de otra por muchos kilobases. En cuarto lugar, puede ser difícil decidir cuál es el grupo de genes correspondiente. En caso de gran tipo PKS I o sistemas NRPS, donde es posible calcular el número de unidades de elongación en función del número de módulos, o incluso identificar las unidades extensoras individuales por análisis de los dominios de selección, se convierte fácilmente. Sin embargo, en el caso de trabajar de forma iterativa enzimas de la predicción de los compuestos sintetizados a menudo no es posible, especialmente si la straen cuenta con más de 40 grupos de genes. En quinto lugar, la naturaleza es muy complejo y lleno de compuestos desconocidos. A menudo la biosíntesis es una mezcla de diferentes vías. Si el nuevo compuesto no es identificado todavía, o no relacionado con otro compuesto, puede ser difícil identificar el clúster, para proponer un modelo de biosíntesis y para demostrarlo. Una vez identificado el clúster, la técnica de cruce individual es un método rápido y bueno para verificar la hipótesis. PCR, clonación en un vector suicida, conjugación, la selección de clones positivos, y el ensayo de producción son los únicos pasos necesarios. Una desventaja de esta técnica es que la integración del vector en el cromosoma no es estable debido a más eventos de recombinación. Por lo tanto, con el fin de analizar más a fondo los genes individuales, se requiere que las supresiones de genes precisos. También puede ser difícil de manipular cepas de Streptomyces en el nivel genético. El procedimiento descrito se puede asignar to cualquier otro compuesto producido por una cepa de Streptomyces u otro microorganismo. El conocimiento acerca de un grupo de genes de biosíntesis y su compuesto sintetizado nos da más oportunidades para modificar moléculas ya existentes con el fin de mejorarlos para la lucha contra los patógenos resistentes a múltiples fármacos.

productos naturales de plantas y microorganismos han sido siempre una fuente importante para el desarrollo de fármacos y la investigación clínica. El primer antibiótico penicilina fue descubierta en 1928 a partir de un hongo por Alexander Fleming 1. Hoy en día, muchos más productos naturales se utilizan en el tratamiento clínico. Un género conocido por su capacidad de producir varias clases de metabolitos secundarios con diferentes bioactividades es Streptomyces. Streptomyces son bacterias Gram-positivas y pertenecen a la clase de Actinobacteria y el orden Actinomycetales. Casi dos tercios de los antibióticos de uso clínico se derivan de los Actinomycetales, sobre todo a partir de Streptomyces, como la anfotericina 2, 3 daptomicina o tetraciclina 4. Dos premios Nobel se han concedido en el campo de la investigación de antibióticos Streptomyces. El primero fue a Selman Waksman para el descubrimiento de la estreptomicina, la primera de unaantibiótica eficaz contra la tuberculosis. 5 En 2015, como parte del Premio Nobel de Fisiología y Medicina, el descubrimiento de avermectinas de S. avermitilis se adjudicó también. La avermectina se utiliza para el tratamiento de enfermedades parasitarias 6,7. El enfoque tradicional para el descubrimiento de productos naturales en microorganismos tales como Streptomyces generalmente implica el cultivo de la cepa bajo diferentes condiciones de crecimiento, así como la extracción y el análisis de metabolitos secundarios. Ensayos de bioactividad (por ejemplo, ensayos para actividad antibacteriana y contra el cáncer) se llevan a cabo para detectar la actividad del compuesto. Finalmente, el compuesto de interés se aísla y la estructura química se aclara. Las estructuras de los productos naturales a menudo están compuestos de restos individuales que se están formando moléculas complejas. Hay algunas, pero limitadas, las principales rutas biosintéticas que conducen a la construcción de bloqueks, que se utilizan para la biosíntesis de productos naturales. Las principales vías de biosíntesis de poliquétidos son las vías, las vías que conducen a terpenoides y alcaloides, vías utilizando aminoácidos, y las vías que conducen a restos de azúcar. Cada vía se caracteriza por un conjunto de enzimas específicas 8. Basándose en la estructura del compuesto, estas enzimas biosintéticas se pueden predecir. Hoy en día, el análisis estructural detallado de un compuesto en combinación con la secuenciación de próxima generación y el análisis bioinformático puede ayudar a identificar la agrupación de genes biosintéticos responsables. La información de clúster abre nuevas vías para futuras investigaciones producto natural. Esto incluye la expresión heteróloga para aumentar el rendimiento del producto natural, modificación compuesto blanco de la deleción del gen o la alteración y la biosíntesis combinatoria con genes de otras vías. Polyketomycin fue aislado independientemente del caldo de cultivo dedos cepas, Streptomyces sp. MK277-AF1 9 y Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 10. La estructura se elucidó por análisis de RMN y de rayos X. Polyketomycin se compone de un decaketid tetracíclico y un ácido salicílico de dimetilo, unidos por los dos restos desoxiazúcar ß-D-amicetose y α-L-axenose. Se muestra actividad citotóxica y antibióticos, incluso contra cepas Gram-positivos resistentes a múltiples fármacos, tales como MRSA 11. Una biblioteca de cósmidos genómica de S. diastatochromogenes Tü6028 se generó y se proyectó hace muchos años. El uso de sondas de genes específicos de la agrupación de genes polyketomycin con un tamaño de 52,2 kb, que contiene 41 genes, fue identificado después de varios meses de intenso trabajo 12. Recientemente, se obtuvo un proyecto de secuencia del genoma de S. diastatochromogenes que conduce a la identificación rápida de la agrupación de genes biosintéticos polyketomycin. En este panorama, un método que ayuda a identificar un producto natural y dilucidar se describirá su agrupación de genes biosintéticos, utilizando polyketomycin como un ejemplo. Aquí explicamos los pasos individuales que conducen de un producto natural a su agrupación de genes biosintéticos se muestra para polyketomycin producido por Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. El protocolo comprende la identificación y purificación de un producto natural con propiedades antibióticas. Además el análisis estructural y la comparación con los resultados de genoma plomo minería a la identificación de la agrupación de genes biosintéticos. Este procedimiento se puede aplicar a cualquier otro compuesto derivado de una cepa de Streptomyces o cualquier otro microorganismo.

<table><tbody><tr><td>agar</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>5210.4</td><td></td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>6352.4</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>glucosa&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>X964.3</td><td></td></tr><tr><td>extracto de malta&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>X976.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Peptona&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>harina de soja&nbsp;</td><td>W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico</td> Hensec-Vollsoja <td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>X938.3</td><td>Extracto de levadura Caso-Bouillon</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td><Solventes<fuertes></td>/ácido acético fuerte> <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>3738.5</td><td></td></tr><tr><td>Acetona&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Avantor Performance Materials B.V., Deventer, Países Bajos</td><td>JT-9012-03</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorofrom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Alemania</td><td>1530754</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO-d6 (Dimetilsulfóxido-d6) 99,9 átomo % D</td><td>ARMAR Chemicals, D&ouml; ttingen, Suiza</td><td>15200.204</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>6784.4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>6331.4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Enzimas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>enzimas de restricción</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polimerasa&nbsp;</td><td>New England Biolabs GmbH, Fráncfort del Meno, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I fragmento grande (Klenow) Promega</td><td>GmbH, Mannheim, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apramicina</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemania&nbsp;</td><td>A7682.0005</td><td></td></tr><tr><td>fosfomicina</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania</td><td>P5396-50G</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid/Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKC1132</td><td>Bierman et al. 1992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer& nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_for</td><td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG</td><td>Primer para amplificar el fragmento que contiene el gen</td><td></td>pokPI</tr><tr><td>pokPI_rev</td><td>AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td><cepas bacterianas fuertes></fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td><td></td><td>cepa de prueba grampositiva&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ET12567 pUZ8002&nbsp;</td><td>MacNeil et al. 1992</td><td>cepa para conjugación</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 Blue</td><td>Agilient Technologies, Santa Clara, EE. UU</td><td>. Cepa de prueba gramnegativa + huésped de clonación&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes T&uuml; 6028</td><td>Paululat et al., 1999</td> Productor <td></td>de <td>policetomicina</td></tr><tr><td>Servicios en línea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>antismash (Shell de análisis de antibióticos y metabolitos secundarios)</td><td>http://antismash.secondarymetabolites.org/</td> <td>Detección del grupo</td><td></td>de genes de metabolitos secundarios</tr><tr><td>BLAST (Herramienta básica de búsqueda de alineación local)</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td><td>encuentra regiones de similitud entre secuencias biológicas</td><td></td></tr><tr><td>GenDB</td><td>https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td><td>Anotación de ORF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MiBIG (Información mínima sobre un grupo de genes biosintéticos)</td><td>http://mibig.secondarymetabolites.org/</td> <td>Base de datos de grupos</td><td></td>de genes biosintéticos</tr><tr><td>NaPDoS</td><td>http://napdos.ucsd.edu/</td> <td>Detección de un grupo de genes de metabolitos seconares</td> NCBI Procariota Pipeline de anotación http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/ Anotación de ORF&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NRPSpredictor</td><td>http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td> <td>Detección de dominios</td><td></td>NRPS</tr><tr><td>Prokka (anotación rápida del genoma procariota)</td><td>http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td><td>Anotación de ORF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RAST (anotación rápida utilizando tecnología de subsistemas)</td><td>http://rast.nmpdr.org/</td> <td>Anotación de ORF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Otros programas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chem Station Rev. A.09.03</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td>Programa de manipulación para HPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clone Manager Suite 7</td><td>Software Científico y Educativo, Cary, EE. UU</td><td>. Diseño de Experimento de Clonación&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Newbler v2.8</td><td>Roche Diagnostics</td><td>Alineación de lecturas</td><td></td> de secuenciación</tr><tr><td>Machines&nbsp; Centrífuga </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Avanti J-6000, rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC/MS</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Autosampler: G1313A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Pre columna: XBridge C18 (20 mm x 4,6 mm; Tamaño de partícula: 3.5 y micro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Column:Xbridge C18 (100 mm y veces; 4,6 mm; Tamaño de partícula: 3.5 &mu; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi Precolumna de preparación: Zorbax B-C18 (9,4 x 150 mm; Tamaño de partícula: 5 y micro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi Columna de preparación: Zorbax B-C18 (9,4 x 20 mm; Tamaño de partícula: 5 y micro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Degasser: G1322A&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quarternary bomba: G1311A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Diode detector de matriz (DAD) G1315B (&lambda; = 254 nm y 400 nm)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quadrupole detector de masas (MSD) G1946D(2-3000 m/z)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>evaporador</td><td></td><td></td><td></td> rotativo</tr><tr><td>_heating baño Hei-VAP Value/G3</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_vacuum sistema de bombeo SC 920 G</td><td>KNF&nbsp; Estrategias Globales&nbsp; AG, Sursee, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Otro material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH20</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromafil PVDF-45/15MS (tamaño de poro 0,45 y micro; m; filtro &Oslash; 15 mm)</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, D&uuml; ren, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna SPE Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td><td>Waters GmbH, Eschborn, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td>Medio: LB, Composición: LB, Cantidad a 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Bacillus&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td>Medio: LB, Composición: LB, Cantidad a 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td>Medio: TSB, Composición: CASO Boullion, Cantidad de 1 L H2O: 30 g</td></tr><tr><td>hongo&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td>Medio: YPD, Composición: Extracto de levadura, Cantidad a 1 L H2O: 10 g</td></tr><tr><td>de hongos&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td>Medio: YPD, Composición: Peptona, Cantidad de 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>de hongos&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td></td><td>Medio: YPD, Composición: Glucosa, Cantidad a 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td colspan="4">para placas de agar añadir un 2% de agar</td></tr></tbody></table>

a partir de un producto natural a su cluster biosintético gen: una demostración del uso de polyketomycin streptomyces diastatochromogenes tü6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Cepas de Streptomyces son conocidos por su capacidad de producir una gran cantidad de diferentes compuestos con diversas actividades biológicas. El cultivo bajo diferentes condiciones a menudo conduce a la producción de nuevos compuestos. Por lo tanto, los cultivos de producción de las cepas se extraen con acetato de etilo y los extractos crudos se analizaron por HPLC. Además, los extractos se ensayaron para determinar su bioactividad mediante diferentes ensayos. Para elucidación de la estructura del compuesto de interés se purifica mediante una combinación de diferentes métodos de cromatografía. La secuenciación del genoma junto con la minería genoma permite la identificación de un grupo de genes de biosíntesis de productos naturales usando diferentes programas de ordenador. Para confirmar que el grupo de genes correcto ha sido identificado, los experimentos de inactivación de genes que se han realizado. Los mutantes resultantes se analizan para la producción del producto natural particular. Una vez que el grupo de genes correcta ha sido inactivado, lacepa debe dejar de producir el compuesto. El flujo de trabajo se muestra para el polyketomycin compuesto antibacteriano producido por Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Hace unos diez años, cuando la secuenciación del genoma era todavía muy caro, la clonación y la identificación de un grupo de genes fue un proceso muy lento. la secuenciación del genoma rápida, combinados con la minería genoma acelera el proceso de identificación de cluster y abre nuevas maneras de explorar la biosíntesis y para generar nuevos productos naturales por métodos genéticos. El protocolo descrito en este documento puede ser asignado a cualquier otro compuesto derivado de una cepa de Streptomyces u otro microorganismo.

En este resumen se describen los pasos individuales de la identificación de un antibiótico que lleva a su agrupación de genes biosintéticos. Hace muchos años hemos clonado de una biblioteca de cósmidos, fagos empaquetados en ellos, transducidas células huésped de E. coli, y tuvo que examinar miles de colonias para identificar los clones que tienen regiones de solapamiento de clúster polyketomycin. La secuenciación de los cósmidos era también un proceso difícil y costoso 12. Con el fin de llevar a cabo más estudios sobre la cepa secuenciado todo el genoma de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Con el proyecto de secuencia del genoma que identifica fácilmente la agrupación de genes biosintéticos de polyketomycin y otros grupos que codifican compuestos prometedores. La Figura 7 compara el método de la "vieja" de la identificación del cluster biosintético por clonación de una biblioteca de cósmidos y la detección elaborative, yel método "nuevo" mediante la secuenciación de todo el genoma con la posterior explotación minera genoma en una escala de tiempo áspero. Las nuevas tecnologías de secuenciación y nuevos programas de minería genoma acelerar todo el proceso. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg"> Figura 7: Comparación del Método y "viejo" "Nuevo" de la asignación de un gene cluster biosintético. El método "viejo" comprende la clonación de una biblioteca de cósmidos con la selección de clones positivos y secuenciación del cósmido (s) respectiva (arriba); El método "nuevo" incluye secuenciación del genoma completo y -Minería para identificar todos los grupos de genes de metabolitos secundarios situados en el genoma de la cepa (abajo). Duración de los pasos individuales se muestran en una escala de tiempo áspero. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un protocolo detallado de (A) la identificación de un producto natural con actividad antibiótica, (B) la purificación del compuesto, (C) el primer modelo de su biosíntesis, (D) la secuenciación del genoma / -Minería y la ( E) verificación de la agrupación de genes biosintéticos.

A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

El objetivo general de este flujo de trabajo es identificar un producto natural con actividad antibiótica, purificar el compuesto y determinar su grupo de genes biosintéticos a través de la minería del genoma. Se necesitan con urgencia nuevos antibióticos debido al creciente número de patógenos resistentes a los mitos. Las cepas de estreptomicina son productoras de antibióticos conocidas y debemos utilizar ese potencial.Con el conocimiento de un grupo heterogéneo de biocinas antibióticas, podemos proponer una ruta biosintética y modificar aún más el compuesto. Estos procedimientos le ayudan a identificar el grupo de genes correspondiente. La radio se demuestra con cepa de estreptomicina.Pero se puede aplicar a otros microorganismos. Para comenzar, lance la cepa de estreptomicina en diferentes condiciones, como diferentes medios o tiempo de incubación. Recolectar las células por centrifugación durante 10 minutos a 3.000 veces G.Y transferir los sobrenadantes a un nuevo matraz.Para la extracción de compuestos del caldo de cultivo, ajuste el sobrenadante a PH4 mediante la adición de un molar de ácido clorhídrico. Y transfiéralo a un embudo de separación. A continuación, añade el mismo volumen de acetato de ethal y agita la mezcla durante 30 minutos a 180 rpm.A continuación, recoja la fase de acetato de etial y transfiérala a un matraz de fondo redondo a través de un papel de filtro. Evaporar el acetato de etial por evaporación rotativa a 40 grados centígrados y 240 bar. Para la extracción de compuestos del micelio, vuelva a suspender las células en un volumen doble de acetona.Agite las celdas en un tubo a 180 rpm durante 30 minutos. Filtra el líquido a través de papel de filtro. A continuación, evapore la acetona utilizando un evaporador rotativo a 40 grados centígrados y 550 bar.Disuelva el extracto seco en 20 mililitros de acetato de etial de agua y continúe la extracción de compuestos como antes. Luego disuelva los extractos secos en metanol. Fíltralos a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 micrómetros.Y transfiera los extractos a viales de HPLC. Inyecte las muestras en la máquina de HPLC y analice el extracto crudo como se describe en el protocolo de texto. Para identificar la actividad antibiótica utilizando el ensayo de difusión en disco, extienda varios precultivos de cepas de prueba en las placas de agar respectivas.A continuación, pipetee de 20 a 50 microlitros del extracto disuelto en discos de papel estériles. Prepare también un control negativo con disolvente y un control positivo con un antibiótico adecuado. Después de secar los discos de papel durante 30 minutos, transfiéralos a las placas con los cultivos de prueba.Incubar las placas de prueba en condiciones adecuadas. A continuación, determine las zonas de inhibición aparente para cada cepa de prueba. Si existe una zona de inhibición, purifique el compuesto responsable del cultivo a gran escala y dilucide la estructura como se describe en el protocolo de texto.Durante la purificación, un compuesto puede cambiar debido a la oxidación, la radiación o la temperatura. Cuantas más pastillas de purificación se utilicen, mayor será la posibilidad de degradación. Hasta cinco miligramos de compuesto, que es el mínimo necesario para el análisis del genoma común.Analizar la estructura química del compuesto aislado y predecir las enzimas que pueden estar implicadas en su biosíntesis. Aquí se utiliza la policidomicina como ejemplo para demostrar el procedimiento. Primero, subdivida la estructura en partes simples obvias.La policidomicina está compuesta por una fracción tetracíclica, dos monosacáridos y ácido dimetilsalicílico. A continuación, predecir los genes putativos en el grupo de donde se pueden derivar las fracciones. Aquí, la fracción tetracíclica podría derivarse de una sinfase de tipo policlave tipo II.Mientras que la fracción dimetilsalicílica puede derivarse de una sinfase iterativa de tipo policlave tipo I.Del mismo modo, las dos fracciones de azúcar, que son 6 azúcares desoxi, podrían sintetizarse a partir de glucosa que involucra una dNDP-glucosa-4, 6-deshidratasa durante la biosíntesis y unidas por dos glicosiltransferasas.Secuenciar el ADN genómico mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación. Para la identificación del grupo de genes de metabolitos secundarios, ejecute programas como antiSMASH, buscador de dominio de producto natural o predictor NRPS. Envíe la secuencia del genoma en formato fasta.Después de varias horas, los resultados se envían a través de un enlace de correo electrónico. En el borrador del genoma de los estreptimyoces diastatochromogenes, antiSMASH identificó 22 grupos de genes putativos. Analice los grupos de genes putativos por sus vías enzimáticas.Busque grupos que contengan genes que puedan estar involucrados en la síntesis de su compuesto. En los astrocromogenes, el grupo II contiene genes de tipo II de sinfase de tipo clave poli, tres genes para un PKS tipo I iterativo y el gen dTDP-glucosa-4, 6-deshidratasa y dos genes que codifican glicosiltransferasas. Para comparar el conglomerado con otros conglomerados, antiSMASH proporciona un enlace a la base de datos MIBiG que incluye anotaciones y más información sobre conglomerados de genes biosintéticos similares y sus productos.Compara la estructura del compuesto con otros compuestos conocidos para comprobar si hay similitudes. La identificación del grupo de genes biosintéticos responsable puede ser sencilla. Pero en algunos casos también puede ser muy difícil.Para verificar que el grupo de genes propuesto es responsable de la biosíntesis del compuesto, busque un gen dentro del grupo y codifique una enzima con una función central para la biosíntesis. Para confirmar el grupo de genes de la policidomicina, se seleccionó el gen pokPI uno que codifica para la cetosintasa alfa del PKS tipo II y se inactivó mediante una deleción fuera de cuadro. Después de la clonación y conjugación de la construcción de cruce única como se describe en el protocolo de texto.Comprueba los mutantes cruzados individuales. Para ello, se inoculan 100 mililitros de medios de producción con clones individuales que contengan la interrupción genética verificada. Incubar las células en las mismas condiciones que se utilizaron anteriormente.Proceda a extraer el extracto crudo como se muestra anteriormente. Finalmente, verifique la producción por HPLC MS Analysis como se describe en el protocolo de texto. El pico correspondiente en el cromatograma de HPLC y la masa del compuesto no deben ser detectables.El grupo de genes biosintéticos de policidomicina se verificó mediante un experimento de deleción de genes. Aquí se muestra el cromatograma de HPLC del extracto crudo del tipo salvaje S.Diastatochromogenes y la cepa mutante con el gen interrupte pokPI one. La cepa mutante ya no produce policidomicina.Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en varios meses. Hace muchos años, la identificación de un grupo de genes biosintéticos llevó mucho tiempo. Hoy en día, la secuenciación del genoma y la minería del genoma aceleran fuertemente este proceso.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo pasar de un compuesto nuevo a su grupo de genes biosintéticos. Mostramos todo el procedimiento en pasos individuales para que pueda asignarlos ahora a cualquier otro productor de productos naturales. El conocimiento sobre el grupo de genes y sus compuestos sintetizados nos da una idea de las vías biosintéticas.Esto nos da más oportunidades para modificar moléculas ya existentes con el fin de mejorarlas.

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Investigación

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Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

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La minería del genoma guiada por espectrometría de masas como herramienta para descubrir nuevos productos naturales

Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Aquí, se presenta un protocolo para diseñar, construir y administrar un circuito sintético inducible basado en tetraciclinas. El efecto de los circuitos sintéticos sobre la eliminación de parásitos y la expresión de citoquinas se puede estudiar mediante la canalización de la tubería presentada. Este protocolo es relevante para los investigadores que estudian terapias basadas en circuitos sintéticos en enfermedades infecciosas.

Circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped

Aprende a identificar productos naturales antibióticos y determinar sus clusters biosintéticos mediante minería genómica en Streptomyces diastatochromogenes. Este protocolo acelera el descubrimiento de nuevos antibióticos.

A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Video) | JoVE Journal

A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

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