Name: Un modelo de lesión de la médula espinal contundente basado en el desplazamiento de tejidos en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a crear lesiones contusivas de médula espinal consistentes en ratones adultos mediante desplazamiento tisular controlado. Este modelo reproducible permite estudiar mecanismos de lesión y evaluar terapias experimentales en neurociencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado en parte por NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562; Premio al Examen del Mérito I01 BX002356 del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos; Fundación Craig H Neilsen 296749; Fundación Indiana para Investigación de Lesiones Cerebrales y Médula Espinal y Fondos de Dotación Mari Hulman George (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); El Estado de Indiana ISDH 13679 (XW); Y la Fundación NeuroCures.

Todos los procedimientos quirúrgicos y de manipulación de animales fueron realizados según lo aprobado en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo Nacional de Investigación) y las Guías del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana. 1. Preparación del animal y realización de la laminectomía torácica T10 <ol><li> Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y el estabilizador de la columna metálica en un autoclave. Limpie la mesa de operaciones quirúrgicas. Calentar una almohadilla de calefacción a 37 ° C. Coloque la almohadilla calefactora en la mesa de operaciones y cúbrala con cortinas quirúrgicas estériles. Utilice una técnica estéril durante toda la operación. </li><li> Utilizar ratones C57 / 6J adultos jóvenes a las 10 semanas de edad para este estudio. Anestesiar cada animal con una inyección intraperitoneal (ip) de una mezcla de ketamina (87,7 mg / kg) y xilazina (12,3 mg / kg). Confirme la anestesia completa sin obtener respuesta a una estimulación de la nocicepción inducida por pellizco de la pata. </stro<html> Ng&gt; <ol><li> Administrar por vía subcutánea buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg), un agente analgésico y carprofeno (5 mg / kg), un fármaco antiinflamatorio no esteroide. </li></ol></li><li> Afeitar el cabello sobre la columna toracolumbar con una podadora eléctrica. Frote la piel con solución de betadine y 70% toallitas de alcohol. </li><li> Aplicar pomada oftálmica a las córneas para proteger los ojos del secado durante la cirugía. </li><li> Con un bisturí, realizar una incisión de la línea media de 1,5 cm en la parte posterior del animal para exponer las 9 a 11 láminas vertebrales torácicas. Empuje el tejido adiposo subcutáneo rostralmente. Diseccionar los músculos paraspinales lejos de los procesos espinosos y las láminas, hacia las facetas laterales de cada lado. </li><li> Coloque el ratón en el canal en forma de U del estabilizador ( Figura 2A Y 2B ). Abrazadera bilateral los brazos de acero inoxidable debajo de las facetas expuestas de la vértebra T10 (G &quot;&gt; Figura 4A) y apriete utilizando los tornillos de pulgar fijados a los brazos ( Figura 2A ). </li><li> Retire el proceso espinoso T10 y la lámina (laminectomía) usando un micro-rongeur que expone la dura-máter que cubre la médula espinal ( Figura 4B ). </li></ol> 2. Realización de la lesión por contusión T10 utilizando el impactor LISA <ol><li> Gire la perilla del regulador de presión en el tanque de nitrógeno para ajustar el nitrógeno comprimido a 20 PSI o 138 kPa ( Figura 1A ) para este estudio. NOTA: La presión es ajustable desde 10-120 PSI. Una presión más alta dará como resultado un impacto de mayor velocidad. La punta del dispositivo SCI con un diámetro de 1,2 mm está diseñada para ratones, y la punta con un diámetro de 2,2 mm está diseñada para ratas. Cuando se cambia de ratones a ratas, la punta de mayor diámetro puede formarse añadiendo un anillo a la punta metálica (id 1,2 mm / mm 2,2 mm). Se utilizó la punta de 1,2 mm en este SCI ratonesTudy Esterilizar la punta SCI antes de usar. </li><li> Encienda la computadora para iniciar el software. Pulse el botón 1 ( Figura 1B ) para activar la punta del impactador en una posición completamente extendida ( Figura 3A -1 ). NOTA: La función del botón 1 es activar o desactivar manualmente el cilindro neumático. </li><li> Coloque el recipiente en forma de U con el ratón sobre el escenario ( Figura 2B ). Fijar el escenario en su lugar apretando los tornillos de mariposa del montaje ( Figura 2B ). </li><li> Bajo la zona &quot;SET ZERO LEVEL&quot; (verde), ajuste el nivel cero, con un sensor láser midiendo la distancia hasta la punta del émbolo completamente extendido, haciendo clic en el botón &quot;START READING&quot; ( Figura 3A ). La distancia se mostrará en el parámetro &quot;Rango&quot; en esta zona ( Figura 3A ). Haga clic en el botón &quot;SET ZERO&quot; ( por ejemplo, 8,951 mm, mostrado en la Figura 3A ). </li><li> Presione el botón 1 ( Figura 1B ) para retirar la punta del impactador ( Figura 3B -1 , indicada por una flecha superior) y desbloquee el tornillo de sujeción 1 ( Figura 2B ). Tire del tornillo a la posición correcta ( Figura 3B -1 , indicada por una flecha lateral) para mover la punta del camino del haz láser y gire el tornillo 90 ° en el sentido de las agujas del reloj para bloquear el tornillo. </li><li> Mueva la etapa ajustando los micro-conductores frontal y lateral ( Figura 1C ) para apuntar el rayo láser hacia el centro de la médula espinal dorsal expuesta. Después de que el lugar de la lesión está dirigido, mida la distancia del tejido haciendo clic en el botón &quot;INICIO DE LA LECTURA&quot; debajo del &quot;AJUSTE DE LA LESIÓN LEVEL &quot;(azul) ( Figura 3B y 3B-1 ). </li><li> Ajuste lentamente la distancia entre el sensor y la médula espinal a través del micro-conductor vertical ( Figura 1C ) para alcanzar el parámetro de desplazamiento deseado ( por ejemplo, 0,500 mm, mostrado en la casilla de parámetro &quot;Lesión&quot;) en la zona &quot;AJUSTE NIVEL DE DAÑO&quot; (Azul) ( figura 3B ). <ol><li> Cuando se alcance el desplazamiento de lesión deseado, anote la distancia del tejido ( por ejemplo, 8,451 mm, mostrada en el cuadro de parámetros &quot;Rango&quot;) ( Figura 3B ). Defina el desplazamiento deseado (lesión) = distancia de la punta (cero) - distancia del tejido (rango) ( figura 3B ). Cuando se alcanza la lesión deseada ( p. Ej., Desplazamiento de tejido de 0,500 mm) ( Figura 3B ), haga clic en el botón &quot;AJUSTAR DAÑOS&quot; debajo de la zona &quot;AJUSTAR NIVEL DE DAÑOS&quot; paraEstablecer la lesión. </li></ol></li><li> Gire el tornillo 1 90 ° hacia la izquierda para desbloquear el tornillo, empuje la punta de impacto hacia atrás en la trayectoria del rayo láser ( Figura 3C -1 , dirección indicada por una flecha) y bloquee el tornillo 1 girándolo 90 ° en el sentido de las agujas del reloj. </li><li> Haga clic en el botón Ejecutar debajo de la zona roja &quot;EXPERIMENTACIÓN DE FUNCIONAMIENTO&quot; ( Figura 3C ) para ejecutar el impacto. Los cuadros de parámetros bajo esta zona mostrarán el tiempo de lesión, la fuerza (mV), la velocidad (m / s) y el desplazamiento de la lesión (mm) ( Figura 3C ). </li><li> Después de que todos los datos de lesiones se registren y se guarden, retire el canal en forma de U con el ratón del escenario. Visualmente confirmar la lesión de la médula espinal bajo un microscopio quirúrgico ( Figura 4C ). </li><li> Suturar los músculos paravertebrales, la fascia superficial y la piel usando sutura continua con seda 3-0 (Henry Schein, 776-SK). </li><li> InyectarE animal con 1 ml de solución salina al 0,9% por vía subcutánea para hidratación y colocarla sobre una almohadilla controlada por temperatura hasta que se recupera la conciencia total. Coloque el ratón en una jaula con alimentos accesibles y agua. </li><li> Para el cuidado postoperatorio, exprese manualmente la vejiga hasta que regrese la micción espontánea de la vejiga. Para la analgesia, inyecte buprenorfina (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 h / día durante 2 días. Si ocurre una infección de la vejiga urinaria, inyecte Baytril (SQ, 5-10 mg / kg en 0,1 ml, 1 dosis diaria) durante 7-10 días. Si ocurre una infección regional / sistémica, inyecte Gentamicina (SQ, 5-8 mg / kg, diluido en 1 ml de solución salina estéril, cada 8-12 h) durante 4 días. </li><li> Retire los hilos de sutura a los 14 días post-SCI. </li><li> En el día 42 después de la lesión, los ratones serán sacrificados por perfusión. Después de la anestesia adecuada como 1,2, se perfundirán con 30 ml (0,01 M) de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 30 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 0,01 M. Un centímetro de la médula espinal incluyendo la lesión épicaSe recogerán y procesarán para el seccionamiento y el análisis histológico. </li></ol>

<ol><li>Young, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+contusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal cord contusion models.</a> Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).</li>
<li>Gale, K., Kerasidis, H., Wrathall, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+contusion+in+the+rat%3A+behavioral+analysis+of+functional+neurologic+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord contusion in the rat: behavioral analysis of functional neurologic impairment.</a> Exp. Neurol. 88 (1), 123-134 (1985).</li>
<li>Gruner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monitored+contusion+model+of+spinal+cord+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat.</a> J. Neurotrauma. 9 (2), 126-128 (1992).</li>
<li>Scheff, S. W., Rabchevsky, A. G., Fugaccia, I., Main, J. A., Lumpp, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+modeling+of+spinal+cord+injury%3A+Characterization+of+a+force-defined+injury+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Experimental modeling of spinal cord injury: Characterization of a force-defined injury device.</a> J. Neurotrauma. 20 (2), 179-193 (2003).</li>
<li>Stokes, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+spinal+cord+injury%3A+a+dynamic+and+verifiable+injury+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Experimental spinal cord injury: a dynamic and verifiable injury device.</a> J. Neurotrauma. 9 (2), 129-134 (1992).</li>
<li>Young, W. MASCIS spinal cord contusion model. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoung%2C+W+%22Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries%22">Animal Models of Acute Neurological Injuries</a>. Chen, J., Xu, X. M., Xu, Z. C., Zhang, J. H. , Humana Press. 411-422 (2009).</li>
<li>Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Walters, P., Stokes, B. T. The Ohio State University ESCID spinal cord contusion model. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJakeman%2C+LB+%22Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries%22">Animal Models of Acute Neurological Injuries</a>. Chen, J., Xu, X. M., Xu, Z. C., Zhang, J. H. , Humana Press. 433-448 (2009).</li>
<li>Scheff, S., Roberts, K. N. Infinite Horizon spinal cord contusion model. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheff%2C+S+%22Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries%22">Animal Models of Acute Neurological Injuries</a>. Chen, J., Xu, X. M., Xu, Z. C., Zhang, J. H. , Humana Press. 423-433 (2009).</li>
<li>Sances, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6373138">The biomechanics of spinal injuries.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 11 (1), 1-76 (1984).</li>
<li>Zhang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+contusion+based+on+precise+vertebral+stabilization+and+tissue+displacement+measured+by+combined+assessment+to+discriminate+small+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences.</a> J. Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).</li>
<li>Walker, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vertebral+stabilization+method+for+producing+contusive+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury.</a> J. Vis. Exp. (95), (2015).</li>
<li>Allen, A. R. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/448138">Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. A preliminary report.</a> J. A. M. A. 57, 878-880 (1911).</li>
<li>Jakeman, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+spinal+cord+injury+produced+by+controlled+contusion+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Traumatic spinal cord injury produced by controlled contusion in mouse.</a> J. Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).</li>
<li>Rivlin, A. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+duration+of+acute+spinal+cord+compression+in+a+new+acute+cord+injury+model+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat.</a> Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).</li>
<li>Zhang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cervical+laceration+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Controlled cervical laceration injury in mice.</a> J. Vis. Exp. (75), (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+spinal+cord+contusion+for+the+rhesus+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A controlled spinal cord contusion for the rhesus macaque monkey.</a> Exp. Neurol. 279, 261-273 (2016).</li>
</ol>

Christopher B. Shields, MD tiene propiedad del aparato del sistema de lesiones de Louisville (LISA) producido por Louisville Impactor System, LLC.

En 1911, Allen describió el primer modelo de caída de peso usando un peso fijo para inducir lesiones en las médulas espinales expuestas de los perros 12 . Se han desarrollado modelos de caída de peso similares basados ​​en el modelo Allen, incluyendo el impactador NYU / MASCIS 3 , 6 , 13 , 14 . Además del modelo de caída de peso, se han creado otros dispositivos SCI. El modelo OSU / ESCID 5 , 7 utiliza un mecanismo de desplazamiento del tejido para controlar la gravedad de las lesiones, y el modelo IH 4 , 8 utiliza la fuerza para crear un SCI graduable. En estos sistemas, la estabilización vertebral se obtiene sujetando los procesos espinosos rostrales y caudales al sitio de la lesión. Estos dispositivos utilizan velocidades de lesiones bajas, específicamente 0,33-0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID),Y 0,13 m / s (1H). La estabilización de los procesos espinosos rostrales y caudales puede causar flexibilidad de la columna vertebral y movimiento de la columna durante el impacto, lo que puede afectar la precisión de la lesión. El método LISA intenta superar las deficiencias de los modelos existentes, particularmente en lo que respecta a la inestabilidad de la columna vertebral y la baja velocidad de lesión. Este método utiliza bilateral facet estabilización y evita los artefactos de movimiento asociados con la lesión. Este dispositivo utiliza una velocidad de alto impacto que puede establecerse entre 0,5-2 m / s 11 , 15 . El sensor láser es más avanzado que el Vibrador Ling utilizado en el modelo ESCID y mide con precisión la distancia desde la superficie de la médula espinal sin necesidad de contacto tisular. El modelo se desarrolló originalmente para producir un SCI de rata, y ahora se ha adaptado para producir SCI en ratones y en primates no humanos 16 , con modificaciones. Columna vertebralAbilization reduce la variabilidad en todos los métodos experimentales de SCI, particularmente en modelos del desplazamiento del tejido. El sensor de distancia láser determina la magnitud del desplazamiento tisular de la médula espinal durante los movimientos respiratorios. Es importante que el punto de la médula espinal en el que se centra el láser debe ser el punto idéntico golpeado por el impactador. Esta etapa se realiza durante la etapa de calibración ( Figura 3 ), cuando la punta del impactador y el haz láser están alineados. Una debilidad potencial de este modelo es que la magnitud del desplazamiento tisular se mide desde la superficie dural. Aunque el grosor de la duramadre constituye una diferencia insignificante entre los animales, puede existir variabilidad significativa en el espacio subaracnoideo lleno de líquido cefalorraquídeo (LCR). La variabilidad en los resultados de las lesiones puede ocurrir al producir una lesión de contusión muy leve usando un pequeño desplazamiento del tejido. En general, la consistencia de la lesión depende principalmenteSobre la precisión del desplazamiento del tejido y también sobre la velocidad y el tiempo de contacto con el tejido del émbolo. El rango de desplazamiento tisular es amplio (precisión: 0-10 ± 0,005 mm). Sobre la base de datos experimentales previos e información publicada en roedores y primates no humanos, un desplazamiento del 20% del diámetro anteroposterior del SC produce un SCI leve, un desplazamiento del 30-40% produce un SCI moderado y un desplazamiento&gt; 50% Produce SCI severa a una velocidad de 1 m / s. Habrá ligeras diferencias dependiendo de la especie animal. El tiempo de parada es ajustable de 0 a 5 s con un relé de tiempo. En nuestro estudio, el tiempo de permanencia se estableció en 300 ms. Esto se puede ajustar fácilmente para reproducir los tiempos de permanencia de otros dispositivos SCI, incluyendo los modelos NYU e IH. En resumen, hemos desarrollado un modelo basado en el desplazamiento de SCI contusiva en ratones adultos. El modelo utiliza un estabilizador en forma de U para estabilizar las facetas espinales bilaterales, evitando el cordónArtefactos de movimiento asociados con la medición guiada por láser de la superficie del cordón. Este modelo puede producir lesiones de la cuerda de alta velocidad de 0.5-2 m / s. El sensor láser es más preciso que el método convencional para determinar la velocidad y la distancia a la superficie de impacto. El modelo puede producir lesiones de la médula espinal en todos los niveles, de leve a severo. Cuando se modifica, este dispositivo también puede producir lesiones en ratas y animales grandes, tales como primates no humanos.

La lesión de la médula espinal más común (SCI) que ocurre en los seres humanos es una contusiva SCI 1 . Para investigar los mecanismos de lesión y las diversas estrategias terapéuticas después de la LME, se necesita un modelo SCI contuso, preciso, consistente y reproducible en roedores. Muchos modelos de lesión contusiva de la médula espinal con diversos mecanismos productores de lesiones se han utilizado en la investigación experimental de SCI 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Tres impactantes modelos SCI -específicamente, el peso de impacto de la Universidad de Nueva York (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor 3 , 6 , la Universidad del Estado de Ohio (OSU) impactor / dispositivo electromagnético SCI (ESCID) 7 , unD el impactador del Horizonte Infinito (IH) 4 , 8 - son ampliamente aceptados en el campo de investigación de SCI. El impactador NYU / MASCIS o un equivalente produce lesión al bajar un peso fijo de diferentes alturas a la médula espinal objetivo para crear múltiples gravedad de lesiones 3 , 6 . El OSU / ESCID causa lesión induciendo el desplazamiento del tejido 5 , 7 . El impactador IH produce lesiones aplicando diferentes fuerzas a la médula espinal 4 , 8 . Cada impactador utiliza una velocidad diferente, que es un parámetro importante que influye en los resultados de la lesión. El aparato NYU / MASCIS genera velocidades que van desde 0,33-0,9 m / s. El dispositivo IH tiene una velocidad máxima de 0,13 m / s 4 . El impactador OSU / ESCID tiene una velocidad fija de 0,148 m / s 5 . En particular, las velocidadesSe modelos son más bajos que el observado en las velocidades clínicas, que por lo general exceden 1,0 m / s [ 9] . Aquí, introducimos un nuevo dispositivo SCI contusivo basado en el desplazamiento, denominado LISA (Louisville Injury System Apparatus), para producir SCI en ratones con una alta velocidad de impacto 10 . Este sistema incluye un estabilizador vertebral, que estabiliza firmemente la vértebra en el sitio de la lesión, permitiendo la producción de un SCI constante y reproducible. El sensor láser del dispositivo asegura la determinación precisa del desplazamiento del tejido y la gravedad resultante del SCI. La velocidad del émbolo en el punto de contacto con la médula espinal puede ajustarse de 0,5 a 2 m / s. Estos parámetros de lesión reproducen estrechamente la SCI traumática vista clínicamente.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (7,2 mg/mL)/Xilacina (0,475 mg/mL)/Acepromazina</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947</td><td>Agente anestésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,03 mg/mL)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-9756</td><td>Agente analgésico</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td> agente <td>antibiótico</td></tr><tr><td>Purdue Products Betadine Surgerical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>para esterilizar la piel</td></tr><tr><td>Esponjas de gasa Dukal</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>para esterilizar la piel</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>para esterilizar la piel</td></tr><tr><td>1 mL NORM-JECT</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>D-78532</td><td>para anestesia/alivio del dolor/inyección de agente antibiótico</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>TERUMO</td><td>REF SS-10L</td><td>para inyección de solución salina</td></tr><tr><td>Lágrimas artificiales ungüento para los ojos</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261</td><td>Provent eyes from dry</td></tr><tr><td>Ungüento antibiótico</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-877-0876</td><td>Provent surgery cortado de la infección</td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>1006015</td><td>detener el sangrado</td></tr><tr><td>Esterilizador de instrumentos</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>para esterilizar herramienta de cirugía</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11223-20</td><td>tejido de agarre</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>corte de piel</td></tr><tr><td>hoja de bisturí #15</td><td>Fisher Scientific</td><td>10015-00</td><td>corte de piel</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td> detener <td>el sangrado</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomía</td></tr><tr><td>Retractor Agricola</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td>Mantenga abierta la vista de la cirugía</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14040-10</td><td>para músculos separados de la columna vertebral</td></tr><tr><td>Suturas estériles</td><td>Fine Science Tools</td><td>12051-10</td> cierre <td>cutáneo</td></tr><tr><td>Ratón Estabilizador vertebral</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Estabilizar y exponer la vértebra</td></tr><tr><td>LISA</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Producir una lesión experimental por contusión de la médula espinal en ratones</td></tr></tbody></table>

un modelo de lesión de la médula espinal contundente basado en el desplazamiento de tejidos en ratones

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

La producción de una lesión de la médula espinal contundente y reproducible es esencial para minimizar las variabilidades de comportamiento e histológicas entre los animales de experimentación. Se han desarrollado varios modelos de SCI contusivos para producir lesiones utilizando diferentes mecanismos. La gravedad de la LME se basa en la altura en la que un peso dado se deja caer, la fuerza de lesión o el desplazamiento de la médula espinal. En el presente estudio, introducimos un nuevo dispositivo SCI contusivo de ratón, el impacto de LISA (Louisville Injury System Apparatus), que puede crear un SCI basado en el desplazamiento con una alta velocidad y exactitud de las lesiones. Este sistema utiliza sensores de distancia láser combinados con software avanzado para producir lesiones graduadas y altamente reproducibles. Se realizó un SCI contusivo en el nivel de la 10ª columna vertebral torácica (T10) en ratones para demostrar el procedimiento paso a paso. El modelo también se puede aplicar a los niveles cervicales y lumbares espinales.

Este dispositivo consta de cinco componentes principales: (1) un cuerpo con una punta de impactador ( Figura 1C ), (2) un ordenador con software ( Figura 1B ), (3) una caja de control eléctrica ( Figura 1B ), (4) a Estabilizador vertebral ( Figura 2A ), y (5) aire comprimido para el sistema de control neumático ( Figura 1A ). Para inducir un desplazamiento tisular preciso, el sistema se basa en un sensor láser para medir la distancia entre la punta del émbolo completamente extendida y la superficie dorsal de la médula espinal objetivo. El software tiene en cuenta el grosor de 4 mm de la punta debido al hecho de que el rayo láser sólo alcanza la superficie reflectora del impactador ( Figura 2B y Figura 3A -1 ). Hay dos posiciones en las que se puede colocar la punta del émbolo: (1) iN la trayectoria del rayo láser ( Figura 3A -1 ) o (2) en una posición lateral alejada del rayo láser ( Figura 3B -1 ). Cuando el émbolo está en la trayectoria del rayo láser ( Figura 3A -1 ), mide la distancia desde la punta del impactador y supervisa la velocidad de la punta del impactador durante el movimiento entre extensión y retracción. Cuando el émbolo está en la posición lateral alejada de la trayectoria del rayo láser ( Figura 3B -1 ), se mide la distancia entre el láser y la médula espinal. La estabilización de la vértebra T10 utilizando nuestro estabilizador vertebral es un componente integral del procedimiento ( Figura 2A ] 10 , 11 . Mediciones fiables de la distancia utilizando el sensor láser dependen de la sDel objetivo, que puede distorsionarse si hay movimiento. Para determinar la exactitud y consistencia de este sistema, 8 ratones fueron sometidos a lesiones de desplazamiento de 0,5 mm. Estos animales mostraron una variabilidad de desplazamiento de ± 0,001 mm (± SD), lo que indica que el sistema es altamente preciso y reproducible. La Figura 4 muestra las vértebras diana inmovilizadas en el estabilizador ( Figura 4A ) y la médula espinal T10 expuesta antes de ( Figura 4B ) y después de la contusión ( Figura 4C ) bajo un microscopio quirúrgico. La presión del aire comprimido controla la velocidad del impactador en el momento de la lesión. Nuestros datos demuestran que la velocidad de impacto es 0.81 ± 0.0345 m / s (media ± DE) a una presión de 138 kPa. El mando ( Figura 1B ) en los controles de la caja eléctricaLa duración del contacto de la punta del cordón (tiempo de permanencia) después de la lesión, y se puede ajustar entre 0 y 5.000 ms. El tiempo de permanencia del cable de la punta en la mayoría de los experimentos se establece en 0,32 ± 0,0147 s (media ± DE) ( Figura 5 ). Utilizando este dispositivo, se pueden producir lesiones contusionantes dependientes de la gravedad con desplazamientos tisulares de 0 mm (control simulado), 0,2 mm (lesión leve), 0,5 mm (lesión moderada) y 0,8 mm (lesión grave) en ratones adultos ( Figura 6). ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig1.jpg"> Figura 1: El aparato del sistema de lesiones de Louisville (LISA). ( A ) El sistema consiste en un impactador, un sistema de control y una fuente de aire comprimido. ( B ) El sistema de control incluye una caja de control y un ordenador portátil. El software y los botones de control de la caja de control permiten al usuario establecerLos parámetros de lesión. ( C ) El sensor láser es el componente clave del dispositivo y mide la posición del blanco de lesión, la distancia desde la médula espinal al sensor y la velocidad de lesión. El rápido movimiento hacia abajo y hacia arriba de la punta de impacto es impulsado por aire comprimido. La ubicación de la lesión y la gravedad del desplazamiento del tejido se ajustan mediante microdiscos que controlan el movimiento en tres dimensiones. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig2.jpg"> Figura 2: El estabilizador y el sostenedor del ratón. ( A ) El estabilizador de la columna vertebral se compone de un canal en forma de U y dos brazos metálicos para sostener la vértebra del ratón. ( B ) El estabilizador se monta entonces en el dispositivo de impacto. TLa línea roja indica la trayectoria del rayo láser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig3.jpg"> Figura 3: Método para producir un SCI contusivo. ( A - C ) Se muestra el software de interfaz gráfica de usuario (GUI) con tres parámetros / zonas de lesiones. ( A , A-1 ) La zona verde (SET ZERO LEVEL) calibra la distancia de la punta del émbolo. La línea roja indica la trayectoria del rayo láser. ( B , B-1 ) La zona azul se utiliza para ajustar el nivel de lesión (SET NIVEL DE LESIÓN). El impactador se eleva y se mueve lateralmente hacia el lado derecho para permitir que el rayo láser alcance la superficie dorsal de la médula espinal para establecer el nivel cero. La línea roja indica el láser b Eam camino ( C , C-1 ) Antes del impacto, la punta se mueve de nuevo sobre la trayectoria del rayo láser para ejecutar la lesión (RUN). Los parámetros de lesión se encuentran bajo la zona roja (RUN EXPERIMENT). La línea roja indica la trayectoria del rayo láser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig4.jpg"> Figura 4: Exposición y evaluación de lesiones. ( A ) Los brazos metálicos del estabilizador estabilizan la vértebra T10. ( B ) T10 laminectomía para exponer la médula espinal, con los vasos dorsales claramente visto. ( C ) La contusión inducida por el impacto (flecha) en la superficie dorsal de la médula espinal confirma la lesión. Barra de escala = 2 mm.G4large.jpg "target =" _ blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig5.jpg"> Figura 5: Parámetros de Lesión. Los parámetros de lesión consistentes incluyen desplazamiento del tejido (mm), velocidad de lesión (m / s) y tiempo (s) de reposo de la punta. N = 8, Media ± SD. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig6.jpg"> Figura 6: Evaluación histológica. Las secciones transversales representativas de las médulas espinales, teñidas con violeta de cresilo y eosina, muestran lesiones dependientes de la gravedad del desplazamiento después de ( A ) farsa (0 mm), ( B ) leve (0,2 mm), ( C D ) severa (0,8 mm) con SCI en T10 usando el dispositivo LISA. Las imágenes fueron tomadas en el epicentro de la lesión. Barra de escala = 500 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un modelo de lesión en la médula espinal basado en el desplazamiento del tejido que puede producir una lesión consistente de la médula espinal contusa en ratones adultos.

Un modelo de lesión de la médula espinal contundente basado en el desplazamiento de tejidos en ratones

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

El objetivo general de este video es presentar un nuevo modelo de lesión de la médula espinal contusiva basada en el desplazamiento de tejidos, que puede producir una lesión de la médula espinal contusiva consistente en ratones adultos. Este modelo de contusión puede ayudar a responder preguntas clave en el campo experimental de las lesiones de la médula espinal. La principal ventaja de esta técnica, es que produce una lesión medular muy consistente.Las implicaciones de esta técnica se extendieron hacia la terapia de la lesión medular porque este modelo proporciona herramientas fiables y reproducibles para estudiar los mecanismos de lesión y los efectos de las terapias experimentales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están familiarizadas con el nuevo impactador. La demostración visual de este método es fundamental, ya que varios pasos son difíciles de aprender debido a las operaciones manuales y de software.Comience por llevar los instrumentos quirúrgicos del autoclave y el estabilizador metálico de la columna vertebral a la mesa quirúrgica limpia. Caliente una almohadilla térmica a 37 grados centígrados. Luego, coloque la almohadilla térmica sobre la mesa de operaciones y cúbrala con paños quirúrgicos estériles.Para este estudio se utilizan hembras de 10 semanas de edad C57BL6J ratones. Después de administrar una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina, verifique un nivel adecuado de anestesia por la ausencia de cualquier respuesta a la estimulación de la nocicepción inducida por el pellizco de la pata. Administrar buprenorfina, un agente analgésico y carprofeno, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo por vía subcutánea.Use maquinillas eléctricas para afeitar el vello sobre la columna toracolumbar. Frote la piel con solución de betadine y toallitas con alcohol al 70%. Aplique ungüento oftálmico en las córneas, para proteger los ojos de la sequedad.Después de hacer una incisión de 1,5 centímetros en la línea media de la piel en el dorso del animal sobre las láminas vertebrales torácicas del noveno al undécimo, empuje el tejido adiposo subcutáneo rostralmente. Con tijeras finas, pinzas finas y un retractor agrícola, diseccione los músculos paraespinales alejándolos de las apófisis espinosas y las láminas hacia los fascetes laterales de cada lado. Coloque el ratón en el contenedor en forma de U del estabilizador, sujete los brazos de acero inoxidable por debajo de las facetas expuestas de la vértebra t10 bilateralmente y apriete los brazos con los tornillos de mariposa unidos a ellos.Utilice un micro rongeur para eliminar la apófisis espinosa t10 y la lámina que expone el modelo de duramadre que recubre la médula espinal. Coloque el contenedor en forma de U con el ratón en la platina del impactador y fije la platina en su lugar apretando los tornillos de mariposa de la montura. Para configurar el impactador, primero gire la perilla del regulador de presión en el tanque de nitrógeno para ajustar el nitrógeno comprimido a 20 libras por pulgada cuadrada o 138 kilopascales para el estudio.Esterilizar la punta de impacto de 1,2 mililitros con 70% de alcohol. Luego, abra el paquete de software en la computadora. Presione el botón uno de los botones de la caja de control para activar la punta del impactador en una posición completamente extendida.En la pantalla de la computadora, en el nivel cero establecido, haga clic en iniciar lectura para medir la distancia hasta la punta del émbolo completamente extendida. La distancia se mostrará como el parámetro de rango en esta zona. A continuación, haga clic en establecer cero y aparecerá un número en mililitros en el cuadro del parámetro cero.A continuación, presione el botón uno en la caja de control, para retirar la punta del impactador. A continuación, desbloquee el tornillo de fijación, tire del tornillo para alejar la punta de la trayectoria del rayo láser y gire el tornillo 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para bloquearlo. Ahora mueva la etapa de montaje, ajustando los microcontroladores frontales y laterales para apuntar el rayo láser hacia el centro de la médula espinal dorsal expuesta.Una vez que se haya identificado el punto de la lesión, mida la distancia del tejido haciendo clic en el botón de inicio de lectura debajo del nivel de lesión establecido. Utilice el microcontrolador vertical para ajustar lentamente la distancia entre el sensor y la médula espinal, hasta alcanzar el parámetro de desplazamiento deseado. Esto se encuentra en el nivel de lesión establecido, en el cuadro de parámetros de lesión.Cuando se alcance el desplazamiento deseado de la lesión, registre la distancia del tejido que se muestra en el cuadro de parámetros de rango, luego, defina el desplazamiento o la lesión deseados restando la distancia o el rango del tejido de la distancia de la punta a cero. A continuación, haga clic en establecer lesión en establecer nivel de lesión. A continuación, desbloquee el tornillo girándolo 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj.Empuje la punta de impacto hacia atrás en la trayectoria del rayo láser y bloquee el tornillo girándolo 90 grados en el sentido de las agujas del reloj, haga clic en el botón de ejecución en el experimento de ejecución para ejecutar el impacto. Los cuadros de parámetros mostrarán el tiempo de lesión en segundos, la fuerza en microvoltios, la velocidad en metros por segundo y el desplazamiento de la lesión en milímetros. Una vez que se hayan registrado y guardado todos los datos de lesiones, retire el canal en forma de U con el mouse del escenario.Luego, confirme visualmente la lesión de la médula espinal bajo un microscopio quirúrgico. Después de suturar la incisión en capas, inyecte al animal un milímetro de solución salina al 0,9% por vía subcutánea para su hidratación y colóquelo en una almohadilla con temperatura controlada hasta que recupere la conciencia. Luego, aloja al ratón en una jaula limpia con agua y comida de fácil acceso.Estos datos muestran parámetros de lesión inconsistentes, demuestran que el impactador puede producir lesiones confiables y reproducibles. Esta sección transversal representativa teñida con cresilvioleta-eosina, muestra la región t10 de la médula espinal después de una lesión simulada con el desplazamiento de 0 milímetros. Esta imagen muestra el epicentro de una lesión medular contusiva leve en t10, utilizando el dispositivo con un desplazamiento de 0,2 milímetros.Esta lesión moderada se logró utilizando un desplazamiento de 0,5 milímetros. Por último, esta grave lesión es consecuencia de un desplazamiento de 0,8 milímetros. Estas imágenes demuestran que este nuevo impactador puede producir lesiones por contusión graduada.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe establecer cero para la punta del impactador en los objetivos de la médula espinal. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la lesión medular exploraran mecanismos y terapias en ratones, ratas y primates no humanos.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar este impactador para producir una lesión contusiva de la médula espinal.

a-tissue-displacement-based-contusive-spinal-cord-injury-model-in-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Una manera confiable y repetible para producir una lesión unilateral del cuello uterino de la médula espinal con el impactador horizonte infinito es descrito. El método aprovecha las ventajas de un marco de diseño personalizado y la abrazadera para estabilizar la columna. El procedimiento estandarizado y las lesiones biomecánicas resultado los parámetros de las lesiones suficiente y sostenida.

Un modelo de la contundente unilateral Lesión Medular Cervical Uso del Impactador Infinite Horizon

Fuente: Elzat, E. Y. Y., et al., Establecimiento de un modelo de lesión medular por contusión en ratón basado en una técnica mínimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra el método para inducir una lesión por contusión a nivel de la médula espinal T9 en un modelo de ratón, utilizando una plataforma coaxial para lesiones de la médula espinal. Se deja caer un peso sobre la médula espinal a nivel T9 que crea una contusión que inmediatamente causa decoloración e hinchazón del tejido.

Inducción de una contusión de la médula espinal en un modelo de ratón utilizando una plataforma coaxial para lesiones de la médula espinal

Fuente: Kumar, S., et. al. Modelo de ratón de úlceras por presión después de una lesión de la médula espinal. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra una inducción detallada de la lesión de la médula espinal en ratones. El ratón anestesiado se disecciona para exponer las vértebras T9-T10 y se extirpan sus apófisis espinosas. A continuación, se secciona la médula espinal expuesta para infligir la lesión. A continuación, se cierra el área quirúrgica y se permite que el ratón se recupere.

Generación de un modelo de ratón con una lesión medular

Controlado lesiones laceración cervical en ratones

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

Los modelos de lesiones medulares deben ser altamente reproducibles. Demostramos que el modelo de compresión con pinzas calibradas de la lesión de la médula espinal es un método quirúrgico fácil de usar para generar lesiones reproducibles en la médula espinal murina.

Calibrado Pinzas Modelo de Lesión Medular Compresión

Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Este protocolo describe cómo crear una laminectomía precisa para la inducción de lesiones medulares estables de tipo transección en el modelo de ratón, con un daño colateral mínimo para la investigación de lesiones de la médula espinal.

Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

Las técnicas mínimamente invasivas y un dispositivo de laboratorio simple mejoran la reproducibilidad del modelo de lesión de la médula espinal al reducir el daño operatorio a los animales de experimentación y permitir el mantenimiento de la morfología anatómica. El método vale la pena porque los resultados confiables y el procedimiento reproducible facilitan las investigaciones de los mecanismos de reparación de enfermedades.

Establecimiento de un modelo de lesión de la médula espinal por contusión en ratones basado en una técnica mínimamente invasiva

El protocolo actual, que simula el síndrome del cordón central (CCS) en ratones, ha mejorado la repetibilidad y minimizado el daño operativo a los animales de experimentación, evitando alterar excesivamente la estructura anatómica. La estrategia de este estudio es ventajosa porque permite investigar los mecanismos de lesión al producir resultados consistentes.

Establecimiento del modelo de síndrome de cordón central en ratón C57BL/6J

Aquí se presenta un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, que puede producir con precisión modelos de contusión por lesión de la médula espinal con diversos grados.

Impactador automatizado para el modelo de lesión medular contusiva en ratones

Aprende a crear lesiones contusivas de médula espinal consistentes en ratones adultos mediante desplazamiento tisular controlado. Este modelo reproducible permite estudiar mecanismos de lesión y evaluar terapias experimentales en neurociencia.

Un modelo de lesión de la médula espinal contundente basado en el desplazamiento de tejidos en ratones

Explorar más videos