Name: Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende métodos optimizados para la microinyección de ARN y eliminación de capas foliculares en oocitos de Xenopus. Estas técnicas mejoran la supervivencia celular y permiten estudiar canales iónicos con electrofisiología.

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Este trabajo fue apoyado por la beca 315230_156929/1 de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. M.C.M. es beneficiario de una beca (Beca Chile Postdoctorado de CONICYT, Ministerio de Educación, Chile).

Los experimentos con animales han sido aprobados por el comité local del cantón de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15). 1. Preparación de Xenopus Los ovocitos <ol><li> Mantener ranas (Xenopus laevis) en un 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo en el agua que está estrictamente mantuvo a 20 ° C. </li><li> Retire los lóbulos de los ovarios de las ranas hembra 9. NOTA: La eliminación de los lóbulos es un estímulo para la regeneración, y con frecuencia la calidad de los ovocitos mejora con la cirugía. El ovocito está cubierta por una capa vitelina, una capa de células del folículo, y el tejido conectivo que contiene los vasos sanguíneos 21. Toda la estructura se denomina &quot;folículo.&quot; </li><li> Coloque los lóbulos de los ovarios que están muy cargado de los folículos que contienen los ovocitos en estériles de Barth Saline 7 (MBS) suplementado con penicilina y estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1, 2,4 mMDe NaHCO3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2 mM, Ca 0,33 (NO 3) 2, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Single-a cabo la etapa V-VI 21 folículos. Mantenga el lóbulo ovario con fórceps. Bajar el asa de platino (Figura 1) a través de los folículos y retirar suavemente el bucle de perturbar el tejido conectivo que contiene el folículo del tejido de ovario. NOTA: Etapa V-VI 21 folículos se caracterizan por su tamaño (1,0 a 1,2 mm de diámetro) y por el buen contraste entre el hemisferio animales pigmentada oscura y el hemisferio vegetal amarillento. </li><li> Transferencia sólo folículos de aspecto saludable (es decir perfectamente esféricas y con pigmentación intacto) a un diámetro del plato Petri 35 mm por medio de una pipeta de plástico Pasteur (cortar la parte posterior a un diámetro de abertura de 1,5 mm). </li></ol> Nota: El sistema de microinyección se describe aquí se deriva de la reportada por Kressmann y Birnstiel 22. <ol><li> Preparar ARNc de los respectivos ADNc que codifican las subunidades de la α 4 β 2 δ receptor GABA A por transcripción in vitro, la adición de un poli (A +) de la cola, y la cuantificación del ARN por electroforesis en gel de 23. </li><li> Preparar pipetas de microinyección de los capilares de borosilicato de vidrio (1,0 mm de diámetro exterior (OD), 0,58 mm de diámetro interior (ID), 100 mm de longitud), utilizando un extractor de micropipeta. Romper las puntas de los capilares de vidrio con un microscopio utilizando un micromanipulador y microfilamentos para crear un diámetro de punta de 12 - 15 micras con una punta biselada. </li><li> Rellene las pipetas de microinyección con aceite de parafina utilizando una jeringa de 10 ml, y luego montar la pipeta de microinyección en un micr de construcción caseraoinjection aparato (Figura 2). NOTA: El aparato de inyección de aceite hidráulico de construcción casera consiste en un motor parrilla controlado por un interruptor de pedal. Un interruptor adicional cambia el modo de giro del motor. Este motor acciona un tornillo micrométrico (0,5 mm / vuelta) que avanza o se retrae el émbolo de una jeringa de vidrio de 10 mL. La inyección es a una velocidad de alrededor de 3 rpm y un giro de 0,5 corresponde a una inyección de 50 nL en un folículo. La punta de la jeringa está conectado a un tubo de paredes gruesas de politetrafluoroetileno que está a su vez conectado a la aguja de inyección por una pieza muy corto de tubo Tygon. El capilar de inyección se lleva a cabo por un portabrocas que está controlada por un micromanipulador. Todo el sistema se llena con aceite de parafina. Cualquier burbuja de aire debe evitarse, ya que poner en peligro el sistema de inyección. La configuración se ilumina con una fuente de luz fría. Se requiere un microscopio estereoscópico para el control óptico. Los folículos se visualizaron bajo luz fría con un stereomicroscope (40 aumentos). El rendimiento de la configuración de la inyección se prueba por la inyección de un trazador radioactivo en oocitos de Xenopus. Un volumen de 45 - 55 nL debe ser entregado por inyección. </li><li> Con una pipeta con una punta de plástico estéril, probar la configuración mediante la colocación de una gota de agua estéril en el interior limpio de un termoplástico resistente a la humedad (2 x 2 cm). Sumergir la punta de la pipeta de inyección en esta gotita, y luego girar el motor para retraer el émbolo (presión negativa dentro de la pipeta de inyección). NOTA: El agua debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite. </li><li> Retraer la punta de la pipeta de la gotita y aplicar presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Una gota de agua debe formar en la punta de la pipeta de inyección. </li><li> Prepararse para la inyección de los folículos por alineándolos con los polos vegetales apuntando hacia arriba en los intersticios de una malla de nylon (G: 0,8 mm) pegados a la parte inferior de un Peplato de tri (60 mm) cubierta con MBS. </li><li> Prescindir de 2 l de ARNm utilizando una pipeta con una punta de plástico estéril en el interior limpio de un termoplástico. Tome el mRNA arriba en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa en el interior de la pipeta de inyección. </li><li> Coloque la pipeta de inyección más de un folículo individual utilizando el micromanipulador. </li><li> Insertar la aguja de inyección en el centro de la polo vegetal e inyectar 50 nL de mRNA a un caudal de 0,6 l / min mediante la aplicación de presión positiva en el interior de la pipeta. Esperar 5 - 10 s antes de retirar la punta de la pipeta de inyección del folículo para evitar ARNm de escape. NOTA: El ARNm se debe inyectar en el polo vegetal (amarillenta) para evitar la inyección en el núcleo, que se encuentra en el hemisferio animal. </li><li> La transferencia de los folículos inyectados a una nueva placa de Petri (35 mm) llena con 2 ml de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino establecido a 18 ° C. Incubar los folículos inyectados por 1 -7 d antes de la grabación, dependiendo de la identidad de la nueva proteína expresada. </li></ol> 3. Decapado de los folículos (Figura 3) NOTA: Como se mencionó anteriormente, el ovocito cubierta por una capa vitelina, las células del folículo, y el tejido conectivo, que contiene los vasos sanguíneos 24, que se conoce como un &quot;folículo.&quot; Todas las capas excepto para la capa vitelina, que proporciona estabilidad mecánica sin impedir el acceso de las soluciones a la superficie celular, se deben quitar antes de los experimentos electrofisiológicos. El folículo sin las capas de células que rodean previamente se ha denominado un ovocito &quot;denudada&quot; 25. Este paso se realiza generalmente en el mismo día de los experimentos electrofisiológicos. <ol><li> Transferencia diez inyecta folículos a un tubo de vidrio de borosilicato que contiene 0,5 ml de MBS, 1 mg / ml de colagenasa y 0,1 mg / ml de inhibidor de tripsina. Sumergir el tubo en un baño de agua a 36 ° C. incubar lafolículos durante 20 minutos y agitar los tubos de vez en cuando. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los folículos a un tercer tubo que contiene 0,5 ml de MBS doblemente concentradas que contienen 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N &#39;, N&#39;-ácido tetraacético (EGTA), y se incuba durante 4 min a RT. Agitar el tubo de vez en cuando. NOTA: La solución hipertónica (MBS doblemente concentrados) se utiliza para inducir la contracción de los ovocitos dentro de las capas de células del folículo, separando de esta forma las capas de células foliculares de la ovocito; se añade EGTA para inhibir la actividad de la colagenasa. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los ovocitos a una placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene 2 ml de MBS. Bajo un microscopio estereoscópico, separar los sobres exteriores de los folículos porsimplemente empujando el oocito desnudo de distancia utilizando el asa de platino. NOTA: Los sobres exteriores de los ovocitos se adhieren firmemente a la placa de cultivo y se pueden separar fácilmente de los ovocitos. Algunos ovocitos perderán de forma espontánea sus sobres externos y serán recuperados como desprovistas de ovocitos. Este procedimiento resulta en una preparación relativamente estable que mantiene la apariencia esférica de los ovocitos. </li></ol> 4. Cambio rápido de soluciones en todo el ovocito <ol><li> Realizar un experimento de fijación de voltaje, como se describe a 9,26. </li><li> Cambie la solución del sistema de perfusión por gravedad girando los conmutadores de perfusión como se requiere por el experimento. <ol><li> Aplicar la solución de perfusión en 6 ml / min a través de un capilar de vidrio con un diámetro interior de 1,35 mm, la boca del que se coloca alrededor de 0,4 mm de la superficie del ovocito, para permitir cambios rápidos en la concentración de agonista alrededor del oocito. NOTA: La tasa de cambio ha sido previamente estimadod como 70% en menos de 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li>
<li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li>
<li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li>
<li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte%3A+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li>
<li>Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColman%2C+A+%22Transcription+and+Translation%27A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation'A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defolliculation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li>
<li>Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmart%2C+TG+%22Patch-Clamp+Applications+and+Protocols%22">Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol%2C+etomidate+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943(2016).</li>
<li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWongsamitkul%2C+N+%22J+Biol+Chem%22">J Biol Chem</a>. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li>
<li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li>
<li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li>
<li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+Xenopus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li>
<li>Gurdon, J. B. American clawed frogs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurdon%2C+JB+%22Methods+in+developmental+biology%22">Methods in developmental biology</a>. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).</li>
<li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments%3A+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li>
<li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li>
<li>Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKressmann%2C+A+%22Transfer+of+Cell+Constituents+into+Eucaryotic+Cells%22">Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells</a>. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).</li>
<li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li>
<li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li>
<li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocyte+resting+potential%2C+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3%27%2C5%27-cyclic+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li>
<li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor%2Fchannel+targets+of+drugs+and+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li>
<li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente 7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h 8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocitos denudad...

Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 - 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales. Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células gigantes, la alta proporción de células que expresan la información genética extranjera, el simple control del entorno de los ovocitos mediante perfusión del baño, y el control del potencial de membrana . El inconveniente de este sistema de expresión es la variación estacional observada en muchos laboratorios 17-20. La razón de esta variaciónestá lejos de ser clara. Además, la calidad de los ovocitos se observa a menudo para variar fuertemente. Los métodos tradicionales 7-9 han incluido el aislamiento de lóbulos de ovario, la exposición de los lóbulos de ovario a la colagenasa para algunos h, la selección de desprovistas de ovocitos, y la microinyección de ovocitos. A continuación, se presentan una serie de procedimientos alternativos y rápidos que han permitido trabajar con este sistema de expresión durante más de 30 años sin variación estacional y la poca variación en la calidad de los ovocitos. Los métodos modificados y mejorados descritos aquí para el aislamiento de ovocitos, microinyección con cRNA, y la eliminación de las capas de células foliculares se pueden utilizar para la expresión de cualquier proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando y de portadores.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g de penicilina/mL y 100 &mu; g estreptomicina/mL</td></tr><tr><td>Bucle de alambre de platino</td><td>extractor de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipetas casero</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Tipo 701N</td></tr><tr><td>Tubo de politetrafluoroetileno de pared gruesa</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Aceite de parafina</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Red de nylon, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; más rico Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio de borosilicato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Colagenasa NB Grado estándar</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina tipo I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1,35 ID mm (para perfusión), empresa alternativa: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1,0 OD x&nbsp; 0,58 ID x 100 Longitud mm (para microinyección)&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Longitud mm (para pinza de voltaje de dos electrodos)</td></tr><tr><td>&gamma;-Ácido aminobutírico (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihidroxi-5&alfa;-pregnan-20-one (THDOC)</td>Motor de parrilla <td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>Micromotor de corriente continua Tipo 2230 con engranaje Tipo 22/2</td></tr><tr><td>tornillo micrómetro</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico estériles</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

los oocitos de xenopus: métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. 1 y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 - 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos 4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando. La expresión de los receptores GABA A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio 5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente 7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA A, 10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio 13 tripanosoma 14, y un transportador de myo -inositol 15, 16. Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.

Oocitos de Xenopus fueron escogidos mecánicamente a cabo utilizando un asa de platino (Figura 1). Los oocitos se microinyectaron con mRNA que codifica para el receptor de GABA A subunidades alfa 4, ß 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocito (Figura 2). Después de 4 días, las capas de células foliculares se eliminaron (Figura 3). Los oocitos se sujetan voltaje a -80 mV y se expusieron a concentraciones ...

Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

El objetivo general de este procedimiento es expresar nuevas proteínas, como los canales iónicos en los ovocitos de Xenopus. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo que requiera un sistema de expresión funcional. Las principales ventajas de las variaciones de esta técnica son la rapidez, la fiabilidad y la mejora de la supervivencia de los ovocitos.Este método puede proporcionar información sobre el funcionamiento de los canales iónicos. Además, se puede aplicar al estudio de cualquier otra proteína. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que los métodos clásicos daban como resultado una baja tasa de supervivencia de los ovocitos.Después de extirpar los lóbulos de los ovarios de las ranas hembras de acuerdo con el protocolo de texto, coloque los lóbulos en una solución de Barth modificada estéril suplementada con penicilina y estreptomicina. Corta los lóbulos para permitir el acceso del tejido al oxígeno. Para identificar los folículos de la etapa cinco a seis, use fórceps para sostener el ovario y luego baje un bucle de platino sobre los folículos y retire suavemente el bucle para interrumpir el tejido conectivo con el folículo del tejido ovárico.Clasifique los ovocitos de aspecto saludable utilizando el bucle de platino. Utilice una pipeta Pasteur de plástico con la punta cortada a un diámetro de 1,5 milímetros para transferir los folículos seleccionados a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro. Después de preparar los ARNc para el receptor GABA A y las pipetas de microinyección de acuerdo con el protocolo de texto, use aceite de parafina y una jeringa de 10 mililitros con una aguja delgada para rellenar una pipeta de microinyección.A continuación, monte la pipeta en un aparato de microinyección casero. Con una pipeta con una punta de plástico estéril, coloque una gota de solución de ARNm en el lado limpio de una pieza de termoplástico resistente a la humedad. A continuación, sumerja la punta de la pipeta de inyección en la gota y encienda el motor para retraer el émbolo.La solución de ARNm debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite. A continuación, retraiga la punta de la pipeta de la gota y aplique una presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Se debe formar una gota de solución de ARNm en la punta de la pipeta de inyección.Usando una placa de Petri de 60 milímetros con malla de nailon pegada a la parte inferior y cubierta con MBS para la inyección, alinee los folículos con sus polos vegetales apuntando hacia arriba. Con el micromanipulador, coloque la pipeta de inyección sobre un folículo individual. Inserte la aguja de inyección en el centro del polo vegetal y aplique presión positiva en el interior de la pipeta para inyectar 50 nanolitros de ARNm a un caudal de 0,6 microlitros por minuto.Espere de cinco a 10 segundos antes de retirar la punta de la pipeta inyectable del folículo para evitar que se escape el ARN mensajero. Transfiera los folículos inyectados a una nueva placa de Petri llena de dos mililitros de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino a 18 grados centígrados.Incubar los folículos inyectados durante uno a siete días antes del registro, dependiendo de la identidad de la proteína recién expresada. Para extraer los folículos, transfiera diez folículos inyectados a un tubo de vidrio de borosilicato que contenga 0,5 mililitros de MBS, un miligramo por mililitro de colagenasa y 0,1 miligramos por mililitro de inhibidor de tripsina. Sumerge el tubo en un baño de agua a 36 grados centígrados e incuba los folículos durante 20 minutos.La temperatura aquí es crítica porque un grado más puede matar a los ovocitos. Enjuague los folículos transfiriéndolos a un segundo tubo que contenga un mililitro de MBS a temperatura ambiente, y déjelos en el tubo durante unos diez segundos. A continuación, transfiera los folículos a un tercer tubo que contenga 0,5 mililitros de MBS doblemente concentrado que contenga cuatro milimolares de EGTA, e incube las muestras a temperatura ambiente durante cuatro minutos, agitando ocasionalmente los tubos.El tiempo de incubación de cuatro minutos es fundamental para garantizar que las capas foliculares se desprendan del ovocito. Enjuague los folículos transfiriéndolos a otro tubo que contenga un mililitro de MBS a temperatura ambiente y déjelos en el tubo durante unos 10 segundos. Transfiera los ovocitos a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga dos mililitros de MBS.Luego, bajo un microscopio estereoscópico, use un bucle de platino para separar las envolturas exteriores de los folículos simplemente empujando el ovocito desnudo. Almacene los ovocitos desnudados hasta su uso. En este experimento, los ovocitos de Xenopus seleccionados mecánicamente se microinyectaron con un recubrimiento de ARNm para las subunidades del receptor GABA A.Luego se extrajeron las capas de células foliculares. Los ovocitos se fijaron con voltaje a menos 80 milivoltios y se expusieron a concentraciones crecientes de GABA y a la presencia de THDOC, un potente modulador alostérico positivo del receptor GABA A. Este panel muestra las amplitudes de corriente provocadas en función de las concentraciones de GABA, lo que indica la sensibilidad de esta combinación de subunidades hacia el GABA.La ecuación utilizada fue I(c)Imax/n)donde c es la concentración de GABA, el EC50 es la concentración de GABA en presencia de un THDOC micromolar, provocando una amplitud de corriente semimáxima. Imax es la amplitud máxima de la corriente. I es la amplitud actual y n es el coeficiente de Hill.La EC50 del receptor alfa cuatro beta dos delta GABA A fue de 0,41 a 0,12 micromolares y n de 0,76 a 0,04 Una vez dominadas, las capas de células foliculares pueden eliminarse en media hora si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores mejoraran el procedimiento de expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ovocitos de Xenopus rodeados de capas de células foliculares, su microinyección con ARNm y la posterior eliminación de las capas de células foliculares.

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Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos (Video) | JoVE Journal

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

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