Name: Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende métodos optimizados para la microinyección de ARN y eliminación de capas foliculares en oocitos de Xenopus. Estas técnicas mejoran la supervivencia celular y permiten estudiar canales iónicos con electrofisiología.

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Este trabajo fue apoyado por la beca 315230_156929/1 de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. M.C.M. es beneficiario de una beca (Beca Chile Postdoctorado de CONICYT, Ministerio de Educación, Chile).

Los experimentos con animales han sido aprobados por el comité local del cantón de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15). 1. Preparación de Xenopus Los ovocitos <ol><li> Mantener ranas (Xenopus laevis) en un 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo en el agua que está estrictamente mantuvo a 20 ° C. </li><li> Retire los lóbulos de los ovarios de las ranas hembra 9. NOTA: La eliminación de los lóbulos es un estímulo para la regeneración, y con frecuencia la calidad de los ovocitos mejora con la cirugía. El ovocito está cubierta por una capa vitelina, una capa de células del folículo, y el tejido conectivo que contiene los vasos sanguíneos 21. Toda la estructura se denomina &quot;folículo.&quot; </li><li> Coloque los lóbulos de los ovarios que están muy cargado de los folículos que contienen los ovocitos en estériles de Barth Saline 7 (MBS) suplementado con penicilina y estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1, 2,4 mMDe NaHCO3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2 mM, Ca 0,33 (NO 3) 2, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Single-a cabo la etapa V-VI 21 folículos. Mantenga el lóbulo ovario con fórceps. Bajar el asa de platino (Figura 1) a través de los folículos y retirar suavemente el bucle de perturbar el tejido conectivo que contiene el folículo del tejido de ovario. NOTA: Etapa V-VI 21 folículos se caracterizan por su tamaño (1,0 a 1,2 mm de diámetro) y por el buen contraste entre el hemisferio animales pigmentada oscura y el hemisferio vegetal amarillento. </li><li> Transferencia sólo folículos de aspecto saludable (es decir perfectamente esféricas y con pigmentación intacto) a un diámetro del plato Petri 35 mm por medio de una pipeta de plástico Pasteur (cortar la parte posterior a un diámetro de abertura de 1,5 mm). </li></ol> Nota: El sistema de microinyección se describe aquí se deriva de la reportada por Kressmann y Birnstiel 22. <ol><li> Preparar ARNc de los respectivos ADNc que codifican las subunidades de la α 4 β 2 δ receptor GABA A por transcripción in vitro, la adición de un poli (A +) de la cola, y la cuantificación del ARN por electroforesis en gel de 23. </li><li> Preparar pipetas de microinyección de los capilares de borosilicato de vidrio (1,0 mm de diámetro exterior (OD), 0,58 mm de diámetro interior (ID), 100 mm de longitud), utilizando un extractor de micropipeta. Romper las puntas de los capilares de vidrio con un microscopio utilizando un micromanipulador y microfilamentos para crear un diámetro de punta de 12 - 15 micras con una punta biselada. </li><li> Rellene las pipetas de microinyección con aceite de parafina utilizando una jeringa de 10 ml, y luego montar la pipeta de microinyección en un micr de construcción caseraoinjection aparato (Figura 2). NOTA: El aparato de inyección de aceite hidráulico de construcción casera consiste en un motor parrilla controlado por un interruptor de pedal. Un interruptor adicional cambia el modo de giro del motor. Este motor acciona un tornillo micrométrico (0,5 mm / vuelta) que avanza o se retrae el émbolo de una jeringa de vidrio de 10 mL. La inyección es a una velocidad de alrededor de 3 rpm y un giro de 0,5 corresponde a una inyección de 50 nL en un folículo. La punta de la jeringa está conectado a un tubo de paredes gruesas de politetrafluoroetileno que está a su vez conectado a la aguja de inyección por una pieza muy corto de tubo Tygon. El capilar de inyección se lleva a cabo por un portabrocas que está controlada por un micromanipulador. Todo el sistema se llena con aceite de parafina. Cualquier burbuja de aire debe evitarse, ya que poner en peligro el sistema de inyección. La configuración se ilumina con una fuente de luz fría. Se requiere un microscopio estereoscópico para el control óptico. Los folículos se visualizaron bajo luz fría con un stereomicroscope (40 aumentos). El rendimiento de la configuración de la inyección se prueba por la inyección de un trazador radioactivo en oocitos de Xenopus. Un volumen de 45 - 55 nL debe ser entregado por inyección. </li><li> Con una pipeta con una punta de plástico estéril, probar la configuración mediante la colocación de una gota de agua estéril en el interior limpio de un termoplástico resistente a la humedad (2 x 2 cm). Sumergir la punta de la pipeta de inyección en esta gotita, y luego girar el motor para retraer el émbolo (presión negativa dentro de la pipeta de inyección). NOTA: El agua debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite. </li><li> Retraer la punta de la pipeta de la gotita y aplicar presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Una gota de agua debe formar en la punta de la pipeta de inyección. </li><li> Prepararse para la inyección de los folículos por alineándolos con los polos vegetales apuntando hacia arriba en los intersticios de una malla de nylon (G: 0,8 mm) pegados a la parte inferior de un Peplato de tri (60 mm) cubierta con MBS. </li><li> Prescindir de 2 l de ARNm utilizando una pipeta con una punta de plástico estéril en el interior limpio de un termoplástico. Tome el mRNA arriba en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa en el interior de la pipeta de inyección. </li><li> Coloque la pipeta de inyección más de un folículo individual utilizando el micromanipulador. </li><li> Insertar la aguja de inyección en el centro de la polo vegetal e inyectar 50 nL de mRNA a un caudal de 0,6 l / min mediante la aplicación de presión positiva en el interior de la pipeta. Esperar 5 - 10 s antes de retirar la punta de la pipeta de inyección del folículo para evitar ARNm de escape. NOTA: El ARNm se debe inyectar en el polo vegetal (amarillenta) para evitar la inyección en el núcleo, que se encuentra en el hemisferio animal. </li><li> La transferencia de los folículos inyectados a una nueva placa de Petri (35 mm) llena con 2 ml de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino establecido a 18 ° C. Incubar los folículos inyectados por 1 -7 d antes de la grabación, dependiendo de la identidad de la nueva proteína expresada. </li></ol> 3. Decapado de los folículos (Figura 3) NOTA: Como se mencionó anteriormente, el ovocito cubierta por una capa vitelina, las células del folículo, y el tejido conectivo, que contiene los vasos sanguíneos 24, que se conoce como un &quot;folículo.&quot; Todas las capas excepto para la capa vitelina, que proporciona estabilidad mecánica sin impedir el acceso de las soluciones a la superficie celular, se deben quitar antes de los experimentos electrofisiológicos. El folículo sin las capas de células que rodean previamente se ha denominado un ovocito &quot;denudada&quot; 25. Este paso se realiza generalmente en el mismo día de los experimentos electrofisiológicos. <ol><li> Transferencia diez inyecta folículos a un tubo de vidrio de borosilicato que contiene 0,5 ml de MBS, 1 mg / ml de colagenasa y 0,1 mg / ml de inhibidor de tripsina. Sumergir el tubo en un baño de agua a 36 ° C. incubar lafolículos durante 20 minutos y agitar los tubos de vez en cuando. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los folículos a un tercer tubo que contiene 0,5 ml de MBS doblemente concentradas que contienen 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N &#39;, N&#39;-ácido tetraacético (EGTA), y se incuba durante 4 min a RT. Agitar el tubo de vez en cuando. NOTA: La solución hipertónica (MBS doblemente concentrados) se utiliza para inducir la contracción de los ovocitos dentro de las capas de células del folículo, separando de esta forma las capas de células foliculares de la ovocito; se añade EGTA para inhibir la actividad de la colagenasa. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los ovocitos a una placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene 2 ml de MBS. Bajo un microscopio estereoscópico, separar los sobres exteriores de los folículos porsimplemente empujando el oocito desnudo de distancia utilizando el asa de platino. NOTA: Los sobres exteriores de los ovocitos se adhieren firmemente a la placa de cultivo y se pueden separar fácilmente de los ovocitos. Algunos ovocitos perderán de forma espontánea sus sobres externos y serán recuperados como desprovistas de ovocitos. Este procedimiento resulta en una preparación relativamente estable que mantiene la apariencia esférica de los ovocitos. </li></ol> 4. Cambio rápido de soluciones en todo el ovocito <ol><li> Realizar un experimento de fijación de voltaje, como se describe a 9,26. </li><li> Cambie la solución del sistema de perfusión por gravedad girando los conmutadores de perfusión como se requiere por el experimento. <ol><li> Aplicar la solución de perfusión en 6 ml / min a través de un capilar de vidrio con un diámetro interior de 1,35 mm, la boca del que se coloca alrededor de 0,4 mm de la superficie del ovocito, para permitir cambios rápidos en la concentración de agonista alrededor del oocito. NOTA: La tasa de cambio ha sido previamente estimadod como 70% en menos de 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente 7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h 8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocitos denudad...

Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 - 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales. Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células gigantes, la alta proporción de células que expresan la información genética extranjera, el simple control del entorno de los ovocitos mediante perfusión del baño, y el control del potencial de membrana . El inconveniente de este sistema de expresión es la variación estacional observada en muchos laboratorios 17-20. La razón de esta variaciónestá lejos de ser clara. Además, la calidad de los ovocitos se observa a menudo para variar fuertemente. Los métodos tradicionales 7-9 han incluido el aislamiento de lóbulos de ovario, la exposición de los lóbulos de ovario a la colagenasa para algunos h, la selección de desprovistas de ovocitos, y la microinyección de ovocitos. A continuación, se presentan una serie de procedimientos alternativos y rápidos que han permitido trabajar con este sistema de expresión durante más de 30 años sin variación estacional y la poca variación en la calidad de los ovocitos. Los métodos modificados y mejorados descritos aquí para el aislamiento de ovocitos, microinyección con cRNA, y la eliminación de las capas de células foliculares se pueden utilizar para la expresión de cualquier proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando y de portadores.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g de penicilina/mL y 100 &mu; g estreptomicina/mL</td></tr><tr><td>Bucle de alambre de platino</td><td>extractor de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipetas casero</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Tipo 701N</td></tr><tr><td>Tubo de politetrafluoroetileno de pared gruesa</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Aceite de parafina</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Red de nylon, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; más rico Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio de borosilicato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Colagenasa NB Grado estándar</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina tipo I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1,35 ID mm (para perfusión), empresa alternativa: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1,0 OD x&nbsp; 0,58 ID x 100 Longitud mm (para microinyección)&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Longitud mm (para pinza de voltaje de dos electrodos)</td></tr><tr><td>&gamma;-Ácido aminobutírico (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihidroxi-5&alfa;-pregnan-20-one (THDOC)</td>Motor de parrilla <td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>Micromotor de corriente continua Tipo 2230 con engranaje Tipo 22/2</td></tr><tr><td>tornillo micrómetro</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico estériles</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

los oocitos de xenopus: métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. 1 y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 - 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos 4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando. La expresión de los receptores GABA A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio 5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente 7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA A, 10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio 13 tripanosoma 14, y un transportador de myo -inositol 15, 16. Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.

Oocitos de Xenopus fueron escogidos mecánicamente a cabo utilizando un asa de platino (Figura 1). Los oocitos se microinyectaron con mRNA que codifica para el receptor de GABA A subunidades alfa 4, ß 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocito (Figura 2). Después de 4 días, las capas de células foliculares se eliminaron (Figura 3). Los oocitos se sujetan voltaje a -80 mV y se expusieron a concentraciones ...

Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

El objetivo general de este procedimiento es expresar nuevas proteínas, como los canales iónicos en los ovocitos de Xenopus. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo que requiera un sistema de expresión funcional. Las principales ventajas de las variaciones de esta técnica son la rapidez, la fiabilidad y la mejora de la supervivencia de los ovocitos.Este método puede proporcionar información sobre el funcionamiento de los canales iónicos. Además, se puede aplicar al estudio de cualquier otra proteína. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que los métodos clásicos daban como resultado una baja tasa de supervivencia de los ovocitos.Después de extirpar los lóbulos de los ovarios de las ranas hembras de acuerdo con el protocolo de texto, coloque los lóbulos en una solución de Barth modificada estéril suplementada con penicilina y estreptomicina. Corta los lóbulos para permitir el acceso del tejido al oxígeno. Para identificar los folículos de la etapa cinco a seis, use fórceps para sostener el ovario y luego baje un bucle de platino sobre los folículos y retire suavemente el bucle para interrumpir el tejido conec

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Biología

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática...

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Describimos métodos de manipulación de ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, maduración in vitro de ovocitos a óvulos e inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite la degradación de algunas proteínas maternas y la sobreexpresión de genes de interés en la fertilización, por lo que es valioso para estudiar el papel de factores específicos en el desarrollo embrionario temprano.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

El control de la síntesis de proteínas ocurre principalmente en la etapa de iniciación de la traducción, cuyas deficiencias están relacionadas con diversos trastornos. Para comprender mejor su etiología, describimos aquí un protocolo utilizando ovocitos de Xenopus laevis que evalúa la traducción de la transcripción mos en presencia de un mutante del factor de iniciación de la traducción eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.

Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

Aprende métodos optimizados para la microinyección de ARN y eliminación de capas foliculares en oocitos de Xenopus. Estas técnicas mejoran la supervivencia celular y permiten estudiar canales iónicos con electrofisiología.

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Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

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