Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos
31 de diciembre de 2016
Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.
El objetivo general de este procedimiento es expresar nuevas proteínas, como los canales iónicos en los ovocitos de Xenopus. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo que requiera un sistema de expresión funcional. Las principales ventajas de las variaciones de esta técnica son la rapidez, la fiabilidad y la mejora de la supervivencia de los ovocitos.
Este método puede proporcionar información sobre el funcionamiento de los canales iónicos. Además, se puede aplicar al estudio de cualquier otra proteína. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que los métodos clásicos daban como resultado una baja tasa de supervivencia de los ovocitos.
Después de extirpar los lóbulos de los ovarios de las ranas hembras de acuerdo con el protocolo de texto, coloque los lóbulos en una solución de Barth modificada estéril suplementada con penicilina y estreptomicina. Corta los lóbulos para permitir el acceso del tejido al oxígeno. Para identificar los folículos de la etapa cinco a seis, use fórceps para sostener el ovario y luego baje un bucle de platino sobre los folículos y retire suavemente el bucle para interrumpir el tejido conectivo con el folículo del tejido ovárico.
Clasifique los ovocitos de aspecto saludable utilizando el bucle de platino. Utilice una pipeta Pasteur de plástico con la punta cortada a un diámetro de 1,5 milímetros para transferir los folículos seleccionados a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro. Después de preparar los ARNc para el receptor GABA A y las pipetas de microinyección de acuerdo con el protocolo de texto, use aceite de parafina y una jeringa de 10 mililitros con una aguja delgada para rellenar una pipeta de microinyección.
A continuación, monte la pipeta en un aparato de microinyección casero. Con una pipeta con una punta de plástico estéril, coloque una gota de solución de ARNm en el lado limpio de una pieza de termoplástico resistente a la humedad. A continuación, sumerja la punta de la pipeta de inyección en la gota y encienda el motor para retraer el émbolo.
La solución de ARNm debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite. A continuación, retraiga la punta de la pipeta de la gota y aplique una presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Se debe formar una gota de solución de ARNm en la punta de la pipeta de inyección.
Usando una placa de Petri de 60 milímetros con malla de nailon pegada a la parte inferior y cubierta con MBS para la inyección, alinee los folículos con sus polos vegetales apuntando hacia arriba. Con el micromanipulador, coloque la pipeta de inyección sobre un folículo individual. Inserte la aguja de inyección en el centro del polo vegetal y aplique presión positiva en el interior de la pipeta para inyectar 50 nanolitros de ARNm a un caudal de 0,6 microlitros por minuto.
Espere de cinco a 10 segundos antes de retirar la punta de la pipeta inyectable del folículo para evitar que se escape el ARN mensajero. Transfiera los folículos inyectados a una nueva placa de Petri llena de dos mililitros de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino a 18 grados centígrados.
Incubar los folículos inyectados durante uno a siete días antes del registro, dependiendo de la identidad de la proteína recién expresada. Para extraer los folículos, transfiera diez folículos inyectados a un tubo de vidrio de borosilicato que contenga 0,5 mililitros de MBS, un miligramo por mililitro de colagenasa y 0,1 miligramos por mililitro de inhibidor de tripsina. Sumerge el tubo en un baño de agua a 36 grados centígrados e incuba los folículos durante 20 minutos.
La temperatura aquí es crítica porque un grado más puede matar a los ovocitos. Enjuague los folículos transfiriéndolos a un segundo tubo que contenga un mililitro de MBS a temperatura ambiente, y déjelos en el tubo durante unos diez segundos. A continuación, transfiera los folículos a un tercer tubo que contenga 0,5 mililitros de MBS doblemente concentrado que contenga cuatro milimolares de EGTA, e incube las muestras a temperatura ambiente durante cuatro minutos, agitando ocasionalmente los tubos.
El tiempo de incubación de cuatro minutos es fundamental para garantizar que las capas foliculares se desprendan del ovocito. Enjuague los folículos transfiriéndolos a otro tubo que contenga un mililitro de MBS a temperatura ambiente y déjelos en el tubo durante unos 10 segundos. Transfiera los ovocitos a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga dos mililitros de MBS.
Luego, bajo un microscopio estereoscópico, use un bucle de platino para separar las envolturas exteriores de los folículos simplemente empujando el ovocito desnudo. Almacene los ovocitos desnudados hasta su uso. En este experimento, los ovocitos de Xenopus seleccionados mecánicamente se microinyectaron con un recubrimiento de ARNm para las subunidades del receptor GABA A.
Luego se extrajeron las capas de células foliculares. Los ovocitos se fijaron con voltaje a menos 80 milivoltios y se expusieron a concentraciones crecientes de GABA y a la presencia de THDOC, un potente modulador alostérico positivo del receptor GABA A. Este panel muestra las amplitudes de corriente provocadas en función de las concentraciones de GABA, lo que indica la sensibilidad de esta combinación de subunidades hacia el GABA.
La ecuación utilizada fue I(c)Imax/n)donde c es la concentración de GABA, el EC50 es la concentración de GABA en presencia de un THDOC micromolar, provocando una amplitud de corriente semimáxima. Imax es la amplitud máxima de la corriente. I es la amplitud actual y n es el coeficiente de Hill.
La EC50 del receptor alfa cuatro beta dos delta GABA A fue de 0,41 a 0,12 micromolares y n de 0,76 a 0,04 Una vez dominadas, las capas de células foliculares pueden eliminarse en media hora si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores mejoraran el procedimiento de expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ovocitos de Xenopus rodeados de capas de células foliculares, su microinyección con ARNm y la posterior eliminación de las capas de células foliculares.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe procedimientos optimizados para aislar folículos individuales y realizar microinyecciones de ARN citoplasmático en ovocitos de Xenopus. También presenta un método para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos que involucran canales iónicos activados por ligandos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Electrofisiología
Antecedentes
- Los ovocitos de Xenopus se utilizan comúnmente como un sistema modelo para estudiar la expresión de proteínas.
- Los métodos clásicos a menudo resultan en bajos índices de supervivencia de los ovocitos.
- Las técnicas mejoradas pueden aumentar la fiabilidad y la velocidad de los experimentos.
- Comprender la función de los canales iónicos es fundamental para diversos estudios biológicos.
Objetivo del estudio
- Expresar nuevas proteínas, particularmente canales iónicos, en un sistema funcional.
- Obtener información sobre el funcionamiento de los canales iónicos.
- Mejorar las tasas de supervivencia de los ovocitos durante los experimentos.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de folículos individuales de ovocitos de Xenopus.
- Microinyecciones de ARN citoplasmático.
- Eliminación de las capas celulares circundantes.
- Experimentos electrofisiológicos con cambios rápidos de solución.
Resultados Principales
- Los procedimientos optimizados dieron como resultado tasas más altas de supervivencia de ovocitos.
- Mejora en la velocidad y confiabilidad de la expresión proteica.
- Expresión exitosa de canales iónicos en los ovocitos.
- Mayor comprensión de la funcionalidad de los canales iónicos.
Conclusiones
- Los métodos descritos pueden aplicarse a diversas proteínas más allá de los canales iónicos.
- Estas técnicas representan un avance significativo en el estudio de sistemas de expresión funcional.
- Investigaciones futuras pueden aprovechar estos métodos para abordar preguntas biológicas más amplias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Optimizado Xenopus los protocolos de microinyección en ovocitos y eliminación de células foliculares permiten una expresión funcional robusta de canales iónicos y proteínas de membrana, apoyando la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación y desarrollo biofarmacéutico&D. El bajo fondo endógeno del canal del sistema y el intercambio rápido de soluciones facilitan ensayos electrofisiológicos cuantitativos, aumentando la confianza predictiva en la identificación y selección de fármacos. Estos métodos agilizan la transición desde la hipótesis molecular hasta la lectura funcional, reduciendo la ambigüedad biológica en puntos críticos de inflexión del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación funcional de canales iónicos y transportadores candidatos en un sistema controlado.
- Apoya la desestimación mecanicista al aislar la actividad específica de la proteína del fondo endógeno.
- Facilita la evaluación cuantitativa de la farmacología de receptores modulados por ligandos para la validación del blanco.
- Proporciona una plataforma para la prueba rápida de hipótesis y la triage del portafolio.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona una preparación reproducible y escalable de ovocitos para ensayos electrofisiológicos posteriores.
- Permite mediciones estandarizadas y cuantitativas de corriente para la selección de compuestos.
- Facilita la disponibilidad del ensayo para la evaluación de alto rendimiento de moduladores de canales.
- Permite la reutilización de la plataforma para diversos objetivos de proteínas de membrana.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los resultados funcionales con la farmacología de canales iónicos relevantes para la enfermedad, cuando corresponda.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento molecular hasta la validación preclínica de la función del canal.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos electrofisiológicos cuantitativos.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales para dianas de canales iónicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Estos protocolos optimizados de ovocitos de Xenopus sitúan la expresión funcional y el análisis electrofisiológico en la interfaz del descubrimiento temprano, la identificación de compuestos activos y la investigación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas basadas en hipótesis de la función y farmacología de proteínas de membrana.
- Detección: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles de corriente para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite el cálculo de EC50, coeficiente de Hill y corrientes máximas para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos moleculares con modelos preclínicos para dianas de canales iónicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y adaptable para estudios diversos de expresión proteica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y el rendimiento de los ensayos funcionales.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas dirigidos a canales iónicos y transportadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microinyección, manipulación de ovocitos y registro electrofisiológico.
- Exige acceso a instrumentación especializada para el bloqueo de voltaje y el intercambio de soluciones.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de ovocitos y de ensayo.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes clases de proteínas o tipos de ligandos.
- Los parámetros de temperatura e incubación son críticos para la viabilidad de los ovocitos y el éxito del ensayo.
